Anda di halaman 1dari 19

LAPORAN PRAKTIKUM

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO


NAMA : RACHMA SURYA M
NIM : H311 12 267
KELOMPOK : III (TIGA)
HARI/TGL.PERC . : RABU/ 23 APRIL 2014
ASISTEN : AGUSTIANI















LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2014
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Seperti yang telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga
gugus yang reaktif pada asam amino yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan gugus
rantai samping. Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik, diantaranya
adalah dengan melalui tes ninhydrin, dan sebagainya. Akan tetapi, selain uji spesifik
berdasarkan ciri khas reaksi kimianya, asam amino dapat pula diidentifikasi bahkan
dipisahkan dengan beberapa metode, salah satunya adalah melalui kromatografi lapis
tipis (KLT).
Pemisahan asam amino dengan metode ini didasari oleh kemampuan
suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fasa
stasioner atau yang lazim disebut sebagai fasa diam, dimana bila suatu zat terlarut
yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama dan tidak saling
bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut di dalam kedua pelarut
seimbang.
Pada kromatografi lapis tipis, yang digunakan sebagai fasa stasioner
adalah suatu lembaran tipis silika gel. Untuk memperoleh pemisahan asam amino
yang baik, dapat digunakan dua fase pelarut, dimana setiap jenis asam amino
mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Perbandingan
kecepatan perpindahan komponen dengan permukaan fasa mobile merupakan dasar
untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan. Oleh karena itu
melalui percobaan ini akan dilakukan analisis asam amino dengan menggunakan
metode kromatografi lapis tipis.
1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dilakukannya percobaan ini adalah untuk mengetahui cara
pemisahan dan identifikasi asam amino dalam suatu contoh.

1.2.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah :
1. Menghitung nilai Rf dari beberapa jenis asam amino dan larutan sampel.
2. Mengidentifikasi asam amino dalam larutan sampel berdasarkan nilai Rf nya.

1.3 Prinsip Percobaan
Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan
menggunakan metode kromatrografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari
campuran n-butanol, asam asetat dan air, dan fase diamnya berupa lapisan tipis silika
gel.










BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Asam amino ialah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam
amino terdapat sebagai komponen protein mempunyai gugus NH
2
pada atom
karbon dari posisi gugus COOH (Poedjiadi dan Supriyanti, 1994).
Asam amino yang pertama kali ditemukan adalah asparagin, pada tahun 1860
dan yang paling terakhir adalah treonin, yang belum teridentifikasi sampai tahun
1938. Sumber asam amino biasanya memiliki nama umum atau biasa, yang kadang
diturunkan dari sumber pertama-tama molekul ini diisolasi. Semua asam amino yang
ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugud karboksilat dan gugus
amino terikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan
yang lainnya pada gugus rantaoi sampingnya atau gugus R, yang bervariasi dalam
struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutannya dalam air (Lehninger, 1982).
H
2
N CH C
R
OH
O

Gambar 2. Rumus umum asam amino
Asam amino adalah senyawa yang mempunyai rumus umum
+
H
3
NCH -
(R)COO-, besifat ion dan hidrohfil. Asam-asam amino saling berbeda gugus R-nya.
Ada sekitar 20 macam asam amino penting yang merupakan pembentuk protein dan
disebut asam amino hidrolisat, seperti alanin (Ala), arginin (Arg), sistein (Sis),
glutamin (Gln), asam glutamat (Glu), glisin (Gly), histidin (His), iso leusin (Leu),
lisin (Lys), metionin (Met), fenilalanin (Phe), prolin (Pro), serin (Ser), treonin (Thr),
triptofan (Trp), tirosin (Tyr), dan valin (Val) (Rediatning dan Kartini, 1987).
Asam amino dibagi menjadi dua klasifikasi, yaitu (Devi, 2010) :
1. Asam Amino Esensial
Asam amino esensial tidak dapat diproduksi oleh tubuh sehingga harus ada
dalam diet. Apanila tubuh akan membenyuk jaringan baru, jaringan baru tersebut
hanya terbentuk jika semua asam amino esensial tersedia dalam satu saat yang
bersamaan. Asam amino esensial terdiri dari: alanine, arginine, aspartate, asam
aspartate, sistin, asam glutamate, glutamin, glisin, dan prolin.
2. Asam Amino Nonesensial
Asam amino ini dapat diproduksi dalam tubuh sehingga tidak perlu
dikonsumsi atau tidak perlu tersedia diet. Asam amini nonesensial terdiri atas:
histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilealanin, treonin, triptofan, valin, serin,
dan tirosin.
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik
menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-
macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas
masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino
tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri,
kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis.Salah satu metode yang
banyak memperoleh pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam
kromatografi ialah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi
penukar ion. Kromatografi kertas, merupakan salah satu jenis kromatografi partisi,
yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaaan kelarutan dalam dua pelarut
yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini
cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan
sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung kertas
dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan proses
kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam
amino yang mudah larut dalam pelarut tetentu ini, misalnya pelarut organik, akan
terbawa naik lebih jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian
atas atau bagian akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering
dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan terpisah satu
dengan lain, dan dengan penyemprotan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi
tersebut akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang
telah terpisah itu (Poedjiadi dan Supriyanti, 1994).
Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan
perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat
dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar.
Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase stasioner) dan fase gerak (fase
mobile). Fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fse
diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda.
Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun
semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).
Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik dapat digunakan dua
fase pelarut, misalnya pasangan fenol- air, n-Butanol- air, atau dengan tiga fase
pelarut tersebut dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi, kertas
digunakan sebagai pendukung air. Campuran komponen yang akan dipisahkan
ditempatkan pada fasa stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fase cair,
maka fasse cair akan melalui fase stasioner sambil membawa komponen tersebut,
dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan kecepatan
permukaan fasa mobile (cair) merupakan dasar untuk mengidentifikasikan komponen
yang dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini disingkat dengan R
f
(Rate Of Front)
(Tim Dosen, 2013).
Di tahun 1903 Tswett menemukan teknik kromatografi. Teknik kromatografi
ini digunakan sebagai cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi,
komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam.
Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul
campuran terserap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori
partikel atau terbagi ke dalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau di
dalam pori. Proses ini dikenal sebagai proses absorpsi (penyerapan). Laju
perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu di dalam kolom atau lapisan tipis zat
penyerap secara langsung berhubungan dengan bagian molekul-molekul tersebut di
antara fase bergerak dan fase diam. Jika ada perbedaan penahanan secara selektif,
maka masing-masing komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yang
tergantung pada karakteristik masing-masing penyerapan. Jika pemisahan terjadi,
masing-masing komponen keluar dari kolom pada interval waktu yang berbeda,
mengingat bahwa proses keseluruhannya adalah fenomena migrasi secara diferensial
yang dihasilkan oleh tenaga pendorong tidak selektif berupa aliran fase bergerak
(Khopkar, 2010).
Kromatografi lapis tipis (KLT), teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh
Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak
sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan
terbentuklah kromatogram. Metode dikenal juga sebagai kromatografi kolom
terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan
pemisahannya tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang
terpisahkan (Khopkar, 2010).
BAB III
METODE PERCOBAAN
3.1. Bahan Percobaan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah larutan glisin, tirosin,
sampel X, eluen (n-butanol : asam asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v), larutan
penyemprot ninhidrin 2 %, plat KLT, akuades, selotip dan tissue roll.

3.2. Alat Percobaan
Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah chamber, pipa kapiler
0,5 L, gelas ukur 10 mL, botol semprot, pipet tetes, cawan petri, gunting, gegep,
pensil, penggaris, dan oven.

3.3. Prosedur Percobaan
Dibuat larutan eluen dengan menggunakan larutan n-butanol, asam asetat, dan
air dengan perbandingan 2,5 : 6 : 2,6 v/v. Kemudian eluen dimasukkan ke dalam
chamber, dihomogenkan lalu tutup dan tunggu sampai larutan tersebut jenuh. Pada
plat KLT dibuat garis pembatas kurang lebih 1 cm pada bagian atas dan bawah. Plat
KLT kemudian diaktifkan dengan memasukkannya ke dalam oven selama 15 menit.
Larutan sampel X dan standar tirosin dan glisin kemudian ditotolkan pada garis yang
telah dibuat. Plat dimasukkan dalam chamber yang telah jenuh, kemudian ditutup
kembali. Setelah eluen mencapai batas yang telah ditentukan, plat dikeluarkan
kemudian dikeringkan. Setelah plat kering, plat lalu disemprotkan dengan larutan
ninhidrin 2% dan dikeringkan dalam oven. Plat yang telah kering kemudian
dikeluarkan dan diamati noda yang terbentuk. Noda yang timbul dilingkari
menggunakan pensil dan diukur jaraknya. Dari jarak tersebut dapat ditentukan nilai
R
f
larutan tersebut.



















BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Tabel 1. Hasil pengamatan jarak noda
Noda Jarak eluen (cm) Jarak noda (cm) R
f
(cm)
Sampel X
1
5,2 2,35 0,45
Sampel X
2
5,2 1,65 0,32
Glisin 5,2 1,8 0,35
Tirosin 5,2 2,4 0,46

4.2. Reaksi
Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dan asam amino :
O
O
OH
OH
HC COO
-
R
NH
3
+
RCHO + CO
2
O
O
OH
H
+ NH
3

Ninhidrin
3 H
2
O
C
O
O
C N
OH
O
Pigmen Ungu

4.3. Pembahasan
Dari percobaan yang dilakukan, dua larutan standar akan digunakan sebagai
pembanding larutan sampel X yang ingin diketahui. Ketiga larutan tersebut
ditotolkan pada plat KLT. Pada saat elusi terjadi, baik larutan sampel maupun larutan
standar tidak dapat terlihat. Larutan ninhidrinlah yang berfungsi untuk pemberian
warna. Adapun tujuan pengeringan plat supaya larutan dapat dideteksi dan
menguapkan pelarut yang tidak diinginkan.
Larutan eluen yang digunakan terbuat dari campuran n-butanol, asam asetat
dan air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Pemilihan ketiga pelarut ini
didasarkan pada perbedaan kepolaran dari ketiga pelarut tersebut, dengan urutan
kepolaran air >n-butanol > asam asetat. Setiap asam amino mempunyai koefisien
partisi tertentu. Hal inilah yang akan mempengaruhi kecepatan reaksi suatu larutan.
Eluen dimasukkan ke dalam chamber dan dibiarkan beberapa saat hingga eluen jenuh
dan uapnya memenuhi chamber
Saat plat dimasukkan ke dalam chamber, larutan harus telah berada dalam
keadaan jenuh. Hal ini dimaksudkan agar proses pengelusian dapat berjalan dengan
lancar dan cepat dan untuk mencegah penguapan eluen. Lalu pada saat dimasukkan,
noda tidak boleh ikut terendam dengan fase gerak karena jika ikut terendam maka
noda akan bergerak ke arah bawah, bukannya ke atas. Tujuan plat KLT dikeringkan,
supaya noda yang timbul tidak melebar dan mempersulit perhitungan R
f
.
Setelah plat disemprot dengan ninhidrin dan dikeringkan, didapatkan 2 noda
dengan warna berbeda yaitu ungu dan orange. Dari hasil tabel 1, dapat dilihat bahwa
nilai R
f
sampel X mendekati nilai R
f
tirosin dan glisin, yang berarti sampel terdiri
atas campuran glisin dan tirosin. Sewaktu diperoleh sampel X, salah satu noda
sampel terdapat ekor. Hal ini dapat terjadi karena pada saat penotolan mungkin saja
terjadi beberapa keselahan. Untuk mencegah hal ini terjadi, pada saat penotolan zat
tersebut harus ditotolkan secukupnya pada garis batas.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan:
1. Nilai R
f
asam amino glisin adalah 0,35, asam amino tirosin 0,46, asam amino
serta sampel X adalah 0,32 dan 0,45.
2. Berdasarkan nilai R
f
, larutan sampel X memiliki jarak tempuh noda yang
mendekati larutan asam amino tirosin dan glisin.
5.2 Saran
5.2.2 Saran untuk Laboratorium
Saya menyarankan kepada pihak laboratorium supaya dapat mengecek
barang-barang yang memang sudah tidak layak pakai lagi.
5.2.1 Saran untuk Percobaan
Saya menyarankan agar dapat disediakan jenis-jenis asam amino lain,
sehingga kita mempunyai lebih banyak contoh perbandingan .

5.2.3 Saran untuk Asisten
Saya menyarankan kepada kakak asisten agar bisa lebih mengawasi
praktikannya.




DAFTAR PUSTAKA

Devi, N., 2010, Nutrition and Food, Kompas, Jakarta.

Khopkar, S.M., 2010, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.

Lehninger, A.L., 1982, Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1, Erlangga, Jakarta.

Poedjiadi, A., dan Supriyanti F.M.T., 2005, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta.

Rediatning, W.S., dan Kartini, N.H., 1987, Analisis Asam Amino Dengan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Secara Derivatisasi Prakolom dan
Pascakolom, Proceesings ITB, 20 (1): 41-59.

Tim Dosen Biokimia, 2013, Penuntun Praktikum BiokimiaLaboratorium Biokimia
Jurusan Kimia Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar.























LEMBAR PENGESAHAN



















Makassar, 28 April 2014
Asisten Praktikan


AGUSTIANI RACHMA SURYA M
Lampiran 1. Bagan Kerja

- Digunting dan diberi tanda
- Dikeringkan dalam oven untuk mengaktifkan lapisan tipis
- Ditotolkan larutan contoh dan sampel
- Dikeringkan
- Dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen (n-butanol : asam asetat
: air = 2,5 ml : 0,6 ml : 2,6 ml) yang telah jenuh.
- Dielusi sampai tanda batas yang telah ditentukan
- Dikeluarkan dari chember dan dikeringkan
- Disemprot dengan larutan ninhidrin 0,1 %
- Dikeringkan dalam oven selama beberapa menit pada suhu 60
o
C.


- Ditandai dengan diberi lingkaran dengan menggunakan pensil
- Diukur jarak noda dari tempat penotolan
- Diukur jarak tempuh eluen
- Dihitung nilai Rf-nya
-





Noda
Data
Plat KLT
Lampiran 2. Perhitungan nilai Rf
eluen tempuh Jarak
sampel tempuh Jarak
R
f


a. Glisin
35 , 0
cm 5,2
cm 1,8
R
f


b. Tirosin
46 , 0
cm 5,2
cm 2,4
R
f

c. Sampel
45 , 0
cm 5,2
cm 2,35
R
1 f

32 , 0
cm 5,2
cm 1,65
R
2 f















Lampiran 3. Daftar nilai R
f
20 asam amino

Sumber : http://www.biotopics.co.uk/as/amino_acid_chromatography.html

Amino acid Rf value
alanine 0.38
arginine 0.20
asparagine 0.5
aspartic acid 0.24
cysteine 0.4
glutamine 0.13
glutamic acid 0.30
glycine 0.26
histidine 0.11
isoleucine 0.72
leucine 0.73
lysine 0.14
methionine 0.55
phenylalanine 0.68
proline
not a true amino acid - shows up as yellow
0.43
serine 0.27
threonine 0.35
tryptophan 0.66
tyrosine 0.45
valine 0.61

Lampiran 4. Foto Percobaan





Gambar 1. Noda Pada KLT