Anda di halaman 1dari 13

PENUNTUN

PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI





Oleh :
DOSEN PENGAMPU DAN TIM ASISTEN













FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH
SEMARANG
2014


ACARA I
PREPARASI ALAT DAN STERILISASI
Tujuan
1. Praktikan mengetahui jenis dan fungsi alat-alat dalam praktikum mikrobiologi
2. Praktikan dapat memahami bermacam-macam teknik sterilisasi
3. Praktikan dapat mengoprasikan alat-alat sterilisasi
Cara Kerja
1. Gambar secara skematis alat-alat sterilisasi
2. Jelaskan fungsi masing-masing alat
3. Jelaskan prinsip kerja dari masing-masing alat sterilisasi
4. Jelaskan bagaimana cara mengoprasikan alat-alat sterilisasi
Dasar teori
Mikrobiologi merupakan ilmu yang mempelajari organisme-organisme berukuran
mikroskopis. Untuk mempelajari sifat dan peranannya, mikroba perlu dibiakkan dan
diamati di dalam laboratorium. Meningat bahwa mikroba merupakan mahkluk hidup
dengan ukuran sangat kecil, maka kontaminasi merupakan hal yang perlu dihindari.
Untuk kepentingan mempelajari mikroba dipertlukan berbagai alat dengan berbagai
fungsi, antara lain peralatan sterilisasi, peralatan inkubasi, peralatan utnuk mengamatan
makroskopis maupun mikroskopis dan berbagai peralatan gelas untuk kegiatan kultivasi
mikroba.
I. PERALATAN GELAS.
Alat-alat gelas yang dipergunakan dalam pekerjaan mikrobiologi pada umumnya
berupa alat-alat gelas seperti yang digunakan dalam lab. Kimia, antara lain : tabung
reaksi, erlenmeyer, gelas piala, pipet ukur, gelas ukur, gelas obyek, kaca penutup, dll.

Gambar 1.1. Peralatan gelas dari kiri ke kanan : a) gelas ukur ; b) beaker glass ; c) cawan
Petri ; d) Erlenmeyer ; e) Pipet ukur ; f) tabung reaksi.

Membersihkan peralatan gelas
Untuk mencegah terjadinya kontaminnasi peralatan gelas baru perlu dibersihkan sebelum
digunakan untuk menghilangkan spora yang kemungkinan melekat pada alat gelas selama
penyimpanan, sedangkan peralatan gelas yang telah digunakan perlu dibersihkan dari sisa-
sisa mikroba. Adapun cara membersihkan peralatan gelas adalah sbb:
1. Alat gelas baru
Alat gelas direbus dalam larutan Na3PO4 (trinatrium fosfat) 1% sampai mendidih
beberapa saat, selanjutnya dicuci dengan air hingga bersih dan direndam dalam larutan HCl
1% selama 24 jam untuk melarutkan lapisan fosfat pada alat gelas tersebut. Alat gelas
selanjutnya dicuci kembali dengan air dan dibilas bersih dengan akuades, selanjutnya
dikeringkan di dalam oven (hot air sterilizer) atau langsung dengan sinar matahari.
2. Alat-alat gelas yang sudah dipakai
Alat yang telah digunakan disterilkan beserta sisa medium/biakan dengan menggunakan
autoklaf pada tekanan 15 lbs ( 2 atm, suhu 121
o
C) selama 20 menit, untuk menghilangkan
mikroba patogen. Isi tabung dibuang dan selanjutnya tabung direndam dalam larutan Na3PO4
1% dan didihkan selama beberapa menit. Setelah dingin atau hangat-hangat kuku, alat gelas
disikat sampai bersih dan dibilas dengan air. Direndam dlam larutan HCl 1%, dicuci bersih
dengan air, kemudian dibilas dengan akuades. Alat gelas selanjutnya dikeringkan di dalam
oven atau dengan sinar matahari.
Sisa medium padat harus dibuang ke dalam tempat yang telah disediakan, dilarang
membuang medium agar yang masih cair, karena akan membeku dan menyumbat saluran
pembuangan.
3. Pipet yang sudah dipakai
a
b
c
d e
f
Pipet yang telah selesai digunakan untuk mengambil suspensi mikroba harus didesinfeksi
dengan larutan fenol atau desinfektan lain selama waktu tertentu, slanjutnya dicuci dengan
sabun, dibilas bersih dan dikeringkan di dalam oven.
4. Gelas benda baru.
Gelas benda baru perlu direndam dalam larutan alkohol asam (mengandung HCl 3%)
selama beberapa jam. Dicuci dengan air, dan dibilas dengan akuades. Dikeringkan dengan
kain halus, selanjutnya disimpan dalam wadah yang bersih dan tertutup. untuk menghidari
menempelnya lemak dari jari tangan, gelas benda dipegang pada bagian sisinya.
5. Kaca penutup baru
Kaca penutup yang baru, direndam dalam alkohol asam selama beberapa jam. Dicuci
dengan air, kemudian dibilas dengan akuades. Dikeringkan dengan kain halus, selanjutnya
disimpan dalam wadah yang bersih dan tertutup.
6. Gelas benda dan gelas penutup yang telah dipakai.
Gelas benda dan kaca penutup yang selesai dipakai direndam dalam larutan Na3PO4 1%
selama 15 menit, dicuci dengan air, kemudian direndam dalam larutan HCl 1% untuk
melarutkan sisa fosfat yang melekat. Dicuci dengan air sampai bersih, kemudian dibilas
dengan akuades. Dikeringkan dengan kain halus, selanjutnya disimpan dalam wadah yang
bersih dan tertutup.
II. PERALATAN STERILISASI
Semua peralatan yang digunakan dalam mikrobiologi harus dijaga kebersihannya dan
disterilkan sebelum digunakan untuk menghindari terjadinya kontaminasi dengan mikroba
yang tidak diinginkan. Peralatan untuk sterilisasi antara lain : lampu spiritus, autoklaf,
disamping itu masih pula diperlukan lemari inokulasi (transfer-box / laminar air flow),
milipore filter, dll.




a b c d


Gambar 1.2. Peralatan sterilisasi: a) Lampu spiritus, b) Lampu bunsen, c) Autoklaf, d)
Millipore filter apparatus , e) Laminar air flow, f) Oven

Selain itu diperlukan alat khusus untuk menanam mikroba yang disebut dengan jarum
tanam atau ose (Gambar 1.3.). Terdapat 2 jenis jarum tanam, yaitu jarum tanam tajam
yang digunakan untuk menanam / memindahkan biakan berfilamen (jamur), dan ose atau
jarum tanam bulat yang digunakan untuk menanam/memindahkan biakan mikroba yang
tidak berfilamen (bakteri dan khamir)


Gambar 1.3. jarum tanam tajam dan ose

III. PERALATAN INKUBASI
Untuk menumbuhkan mikroba di dalam laboratorium, diperlukan peralatan tertentu
berdasarkan sifat bakteri yang berkaitan dengan kondisi optimum pertumbuhannya. Menurut
suhu pertumbuhannya, mikroba dikelompokkan menjadi :
1. psikrofil : hidup pada suhu -10 -20
o
C, optimum pada suhu 10
o
C
2. mesofil : hidup pada suhu 10 - 50
o
C, optimum pada suhu 35
o
C
3. termofil : hidup pada suhu 40 - 70
o
C, optimum pada suhu 60
o
C
4. hipertermofil : hidup pada suhu 65 - 110
o
C, optimum pada suhu 90
o
C
Menurut kebutuhan akan oksigen, mikroba dikelompokkan menjadi:
e
f
1. aerob
2. anaerob fakultatif
3. anaerob obligat
4. anaerob aerotoleran
5. mikroaerofil
Untuk menumbuhkan mikroba sesuai dengan kebutuhan suhu inkubasi dan oksigen, dapat
digunakan peralatan seperti pada Gambar 1.4.


Gambar 1.4. Peralatan inkubasi: a) Candle jar ; b) Anaerobic jar ; c) Inkubator

IV. MIKROSKOP
Perkembangan ilmu mikrobiologi, salah satunya ditentukan oleh penemuan dan
perkembangan mikroskop sebagai suatu alat utama untuk mengamati mikroba yang
berukuran mikrometer (m = 10-3 mm) atau lebih kecil lagi. Beberapa jenis mikroskop telah
dikembangkan antara lain mikroskop cahaya yang mendapatkan sumber cahaya dari
gelombang cahaya dan mikroskop elektron yang sumber cahayanya berasal dari berkas sinar
elektron. Berbagai jenis mikroskop cahaya telah dikenal, yaitu mikroskop medan terang,
mikroskop medan gelap (dark field microscope), mikroskop fluorensensi (fluorecens
microscope) dan mikroskop fase kontras (phase contrast microscope). Mikroskop medan
terang, merupakan jenis mikroskop yang paling umum digunakan di dalam praktikum
mikrobiologi (Gambar 1.5.)
Mikroskop jenis ini umumnya mempunyai lensa obyektif perbesaran lemah ( 4x atau
10x), perbesaran sedang (40x) dan perbesaran kuat (100x).Total perbesaran pengamatan
obyek ditentukan dari hasil perkalian lensa obyektif dan lensa okuler yang digunakan.

a b c

Gambar 1. 5. Mikroskop medan terang dan bagian-bagiannya

Pengamatan obyek dengan menggunakan mikroskop, dimulai dengan perbesaran
lemah sampai ditemukan gambaran obyek yang fokus, selanjutnya lensa obyektif
dipindahkan ke perbesaran sedang sehingga diperoleh gambaran yang fokus, selanjutnya
lensa obyektif dipindahkan ke perbesaran kuat atur sampai terlihat gambaran yang jelas
(fokus). Untuk menurunkan indeks bias cahaya yang dapat mengaburkan pengamatan pada
penggunaan lensa okuler 100x, digunakan minyak imersi. Setelah penggunaan minyak
imersi, lensa obyektif 100x dibersihkan dengan larutan xylol atau alkohol 70%.

Cara penggunaan mikroskop:
Bersihkan meja preparat dengan kain halus.
1. Letakkan preparat di atas meja preparat dan jepit dengan penjepit agar preparat tidak
bergerak.
2. Mulailah mengamati preparat menggunakan lensa obyektif dengan perbesaran terkecil
(misalnya 4x). Putar revolver, sehingga lensa obyektif berada tepat satu poros / di atas
preparat.
3. Nyalakan sumber cahaya dan carilah fokus preparat dengan menaik-turunkan lensa dengan
cara memutar tombol fokus kasar secara perlahan-lahan. Hentikan apabila mulai terlihat
bayangan gambar pada bidang pandang mikroskop.
4. Lanjutkan pencarian fokus preparat pada bidang pandang dengan memutar tombol fokus
halus, sampai preparat terlihat jelas.
Lensa Okuler
Fokus Halus
Fokus Kasar
Penggerak Preparat
Tubus
Meja Preparat
Diafragma
Sumber Cahaya
Objektif 100x
Revolver
5. Setelah preparat terlihat jelas/detil, perbesar pengamatan dengan menempatkan obyektif
perbesaran yang selanjutnya (10X) tepat satu poros / di atas preparat.dengan memutar
revolver (lakukan dengan tidak mengubah posisi/meja preparat dan posisi tombol fokus
kasar/halus.
6. Lakukan langkah-langkah 4 s/d 6, sampai mendapatkan gambar yang fokus/detil.
7. Perbesar pengamatan menggunakan obyektif perbesaran yang lebih kuat (40x, selanjutnya
100x), dengan melakukan langkah-langkah seperti di atas.
8. Setelah selesai menggunakan, ambil preparat dan bersihkan meja preparat dengan
menggunakan lap atau kertas tisu yang bersih.
9. Sisa-sisa minyak imersi pada lensa obyektif dibersihkan secara hati-hati dengan larutan
xylol/ethanol 96% dengan menggunakan kertas lensa
10. Simpan kembali mikroskop dengan posisi lensa perbesaran lemah tepat di atas permukaan
meja preparat, meja preparat dan diturunkan dengan menggunakan tombol fokus sampai
lensa mencapai jarak terdekat dari permukaan meja preparat.
Catatan:
1. Untuk pengamatan yang lebih jelas, cobalah mengatur banyaknya sinar yang mengenai
preparat dengan cara mengubah-ubah bukaan diafragma yang terletak di bawah meja
preparat.
2. Pengamatan obyek/preparat menggunakan perbesaran kuat (obyektif 100x) seringkali
kabur, hal ini disebabkan karena jarak antara obyek dan lensa terlalu dekat. Gambaran
obyek dapat terlihat lebih jelas dengan menurunkan indeks bias cahaya, menggunakan
minyak imersi yang diteteskan di atas permukaan preparat (menjadi media antara
permukaan preparat dengan lensa).

STERILISASI
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari
semua bentuk kehidupan. Sterilisasi adalah usaha untuk membebaskan alat-alat atau
bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan terutama mikroba (terrmasuk spora
mikroba). Dalam mikrobiologi dimaksud sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan
semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Ketika untuk pertama
kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptic, sesungguhnya hal itu telah
menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran (Hadioetomo, 1985).

1. Macam-Macam Sterilisasi
Sterilisasi Secara Fisik
Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang
dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau
terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat
bejana/ruang panas (oven dengan temperatur 170
o
180
o
C dan waktu yang
digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas)(Suriawiria,
2005).Menurut referensi yang didapat sterilisasi secara pemanasan dibagi menjadi 2
yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering. Sterilisasi basah menggunakan Autoklaf
dengan suhu 121
o
C untuk mensterilkan media selama 15 menit, untuk mensterilkan
alat selama 20 menit. Karena titik didih air menjadi 121
0
C itu disebabkan oleh
tekanan 1 atmosfer pada ketinggian permukaan laut, maka daur sterilisasi tersebut
seringkali juga dinyatakan sebagai 1 atm 15 menit.
- Sterilisasi dengan pemijaran.
Digunakan untuk mensterilkan jarum preparat, ose dan alat lain yang terbuat
dari logam, dengan cara membakar langsung alat-alat tersebut di atas api lampu
spiritus atau bunsen (Gambar 1.6).


Gambar 1.6. Cara mensterilkan ose
- Sterilisasi dengan udara panas kering
Alat yang digunakan adalah hot air sterilizer atau oven. Alat-alat gelas seperti
erlenmeyer, petri dish, tabung reaksi dsb. disterilkan pada suhu 170 180
o
C selama 2
jam atau lebih, tergantung dari jumlah dan bahan yang disterilkan.



Gambar 1.7. Hot air sterilizer / Oven

- Sterilisasi dengan uap air panas.
Beberapa jenis bahan, misalnya senyawa gula, vitamin tidak tahan suhu yang
terlalu tinggi. Alat yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat seperti
ini, adalah Arnold steam sterilizer. Bahan yang akan disterilkan dimasukkan ke dalam
alat dan dipanaskan pada suhu 100
o
C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel
vegetatif mikroba. Pemanasan diulang 3 kali dengan interval waktu 24 jam, untuk
memberi kesempatan spora yang ada tumbuh menjadi sel vegetatif.

Gambar 1.8. Arnolds steam sterilizer

- Sterilisasi dengan uap panas bertekanan.
Cara ini merupakan cara sterilisasi yang terbaik, diantara berbagai cara
sterilisasi lain. Alat yang digunakan adalah autoklaf. Uap panas bertekanan tinggi
yang dihasilkan dalam alat ini akan mempermudah penetrasi uap air ke dalam sel
mikroba yang menyebabkan terjadinya koagulasi protein protoplasma, sehingga
mempercepat kematian mikroba

Gambar 1.9. Autoklaf

Bahan yang tahan panas dan tekanan tinggi, serta berbagai alat lain dapat
disterilkan dengan metode ini. Media atau Bahan yang disterilkan harus ditempatkan
dalam tabung/erlenmeyer yang tertutup rapat. Lama sterilisasi berkisar 15-30 menit
dengan tekanan 2 atm dan suhu 121
o
C, tergantung dari jenis dan sifat bahan yang
disterilkan .
Cara Penggunaan autoklaf :
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air
kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.
Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, makatutup
harus dikendorkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap
yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan
terlebihdahulu.
4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121
o
C.
5. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf
dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman
ditutup(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15
dimulaisejak tekanan mencapai 2 atm.
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun
hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisuregauge
menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dankeluarkan isi
autoklaf dengan hati-hati.

Sterilisasi secara kimia
Menurut Hala (2009) bahan-bahan yang biasa digunakan dalam sterilisasi ini
misalnya penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin. Sterilisasi dengan
zat kimia menggunakan desinfektan. Disinfektan adalah bahan kimia yang digunakan
untuk mencegah terjadinya infeksi atau pencemaran oleh jasad renik atau obat untuk
membasmi kuman penyakit.
Sterilisasi Secara Mekanik
Dengan cara penyaringan larutan atau suspensi dibebaskan dari semua organisme
hidup dengan cara melakukannya lewat saringan dengan ukuran pori yang sedemikian
kecilnya sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan diatasnya, sedangkan
filtratnya ditampung didalam wadah yang steril (Hadioetomo, 1985). Sterilisasi
dengan penyaringan digunakan untuk bahan yang peka terhadap panas misalnya
serum, urea dan enzim (Lay dan hastowo, 1982).


Gambar 1.10. Millipore filter
Teknik Aseptis
Teknik aseptik adalah langkah-langkah yang diambil agar dalam percobaan di
laboratorium sehingga diperoleh hasil yang akurat. Teknik aseptik juga berfungsi
untuk melindungi diri dari infeksi dan pencemaran lingkungan. Langkah aseptik yang
diambil missal dengan menyemprotkan alkohol pada tangan dan mengelap meja
percobaan dengan desinfektan sebelum memulai percobaan.



EVALUASI :
1. a. Berapa total perbesaran yang diperoleh dengan perbesaran sedang?
b. Berapa total perbesaran yang diperoleh dengan pengamatan minyak imersi?
2. Apa fungsi penggunaan minyak imersi dalam pengamatan dengan lensa obyektif 100x?
3. Bagaimana cara Saudara mensterilkan larutan gula yang termo labil?
4. Bagaimana cara saudara menghilangkan spora bakteri dalam suatu bahan?
5. Kalau Saudara akan menggunakan pipet, bagaimana Saudara mensterilkannya?
6. Sebutkan 4. metode sterilisasi secara fisik, dan jelaskan keuntungan dan kerugian masing-
masing metode.