I.

TATA TERTIB DI LABORATORIUM

(1) Jangan membiasakan menempelkan etiket (label) dengan air liur (ludah).
(2) Dilarang makan,minum dan merokok dalam laboratorium.
(3) Untuk membersihkan lensa mikrokop janganlah mengunakan saputagan atau bahan
bahan lainnya selain dari pada lap yang telah disediakan .
(4) Setiap tiga mahasiswa membentuk satu kelompok tetap yang bertanggung jawab atas
penggunaan alat- alat/zat kimia yang telah disediakan pada tempatnya serta diwajibkan
selalu menjaga kebersihan dan kerapihan meja praktikum.
(5) Setelah selesai praktikum setiap kelompok harus membereskan kembali semua alat alat
pada tempat nya ,dan jangan lupa mematikan api.
(6) Segera setelah dipakai ,alat alat selalu harus dibakar.
(7) Mahasiswa yang karena kelalaiannya menyebabkan alat alat laboratorium rusak /pecah
diwajibkan untuk mengganti paling lambat sebulum ujian praktikum diselenggarakan.
(8) Harap diperhatikan baik-baik cara penggunaan mikroskop, jangan sampai anda dirugikan
karena ketidak tahuan cara menggunakan alat tersebut. Setiap kali praktikum gunakanlah
mikroskop dengan nomor yang tetap.
(9) Satu minggu setelah melakukan praktikum setiap mahasiswa diwajibkan membuat laporan.
(10) Jangan memulai praktikum sebelum anda membaca dan memahami apa yang harus anda
kerjakan.
(11) Catat semua hasil pengamatan yang anda peroleh untuk laporan dan kalau perlu, disertai
gambar gambar.
















I. MIKROSKOP

Mikroskop adalah suatu alat untuk melihat jasadrenik, termasuk bakteri. Oleh sebab itu
mikroskop erat sekali hubungannya dengan mikrobiologi mengingat kecilnya mikro organisme.
Sedangkan untuk melihat virus tidaklah dapat menggunakan mikroskop biasaakan tetapi harus
menggunakan mikroskop eiektron.Dengan demikian secara garis besarnya mikroskop dibagi atas
dua macam, yaitu (1)mikroskop biasa atau mikroskopn cahaya, dan (2)mikroskop elekteron.
Mikroskop yang bias kita gunakan adalah mikrokop cahaya dari tipe bright field,yaitu tipe
dengan lapangan pandangan yang disinari (diteragi )sedangkan opjeknya sendiri
gelap.Disamping mikroskop tipe bright field. Juga dikenal mikroskop tipe dark fieed yaitu tipe
dengan obkjek yang disinari sedangkan lapangan pandangan gelap, mikroskop ultraviolet, yaitu
mikroskop yang menggunakan sinar ultra violet, miskroskop fase kontras ,yaitu mikroskop yang
dilengkapi dengan diafragma dan lensa objektif khusus sehingga dapat membedakan stuktur
dengan jelas .
Mikroskop electron adalah mikroskop yang menggunakan sinar electron sehingga
mampu
membuat pembesaran 10 000 30 000 kali. Mikroskop ini selain dapat digunakan untuk
melihat virus juga dapat digunakan untuk melihat bakteriophage, struktur bakteri, molekul
protein, dan lain-lain. Terdapt dua tipe mikroskop, yaitu (1) tipe monokuler, dan (2) tipe
binokuler. Yang sering digunakan untuk mempelajari mikroorganisme adalah mikroskop tipe
monokuler. Pada garis besarnya mikroskop terdiri atas dua bagian,
Yaitu :
(1) Bagian mekanik yang meliputi statif, tubus, revolver, meja benda, makrometer,
micrometer danpengatur kondensor, dan
(2) Bagian optic yang meliputi lensa okuler, lensa obyektif, kondensor dan cermin
pengatur cahaya.

Gambaran yang lebih jelas dari mikroskop dapat di lihat di bawah ini.





















































CARA MENGGUNAKAN MIKROSKOP

(1) Sebelum menggunakan mikroskop terlebih dahulu anda periksa apakah alat optic dan
mekaniknya lengkap atau tidak. Bersihkan dengan kain flanel, dan apabila lensa berlemak
bersihkanlah dengan kapas yang dibasahi dengn xilol.
(2) Carilah tempat dengan sinar matahari yang cukup terang.
(3) Periksa kunci makrometernya. Bila masih terkunci bukalah (tekan) kunci tersebut.
(4) Atur cahaya yang masuk, dengan cara memutar micrometer berlawanan dengan arah jarum
jam sampai mencapai maksimum. Pergunakan lensa obyektif dengan pembesaran 10 x.
naikkan kondenor maksimum, buka diafragma, atau cermin , putar makrometer sesuai
dengan arah jarum jam sampai diperoleh cahaya yang cukup terang. Bila sumber cahaya
lemah pkilah cermin cekung supaya terkumpul.
(5) Letak mikroskop jangan di rubah lagi.
(6) Letakkan obyek gelas di atasmeja preparat dengan baik sehingga preparat (film) nya sendiri
terletak tepat di bawah lensa obyektif. Untuk melihat preparat hidup, misalnya untuk
melihat gerak bakteri, pergunakanlah lensa obyektif 45 x, putar micrometer sesuai dengan
arah jarum jam sehingga diperoleh pandangan yang luas jelas.
(7) Untuk melihat preparat yang di warnai, pergunakanlah lensa dengan pembesaran kuat
(lensa obyektif 100 x). untuk keperluan ini harus selalu kita gunakan minyak imersi
(immersion oil) yang diteteskan langsung di atas flim. Kegunaan minyak imersi ialh untuk
mengumpulkan cahaya ; dan dalam hal ini tidak digunakan gelas penutup. Setelah preparat
diletakkan di atas meja preparat, putarlah micrometer searah dengan jarum jam sampai
maksimum, kemudian putar makrometer ke arah yang sama sampai maksimum dan lensa
obyektif mengenai minyak imersi. Puter kembali micrometer ke kiri pelan pelan sambil
diamati dan terlihat pandangan yang jelas.

















II. BAKTERI BULUK DAN RAGI

Menurut BERGEY (1957) dalam bukunya Bergeys Manual of Determinative
Bacteriology , dunia tumbuh-tumbuhan dibagi atas lima division, yaitu (1) Protophyta
(antara lain bakteri dan virus), (2) Thallophyta (antara lain buluk dan ragi), (3)
Bryophyta (lumut), (4) Pteridophyta (paku-pakuan), dan (5) Spermatophyta (tanaman
berbunga).

Beberapa dari divisio (1) dan (2),yaitu bakteri, virus, protozoa, mold (buluk) dan ragi
(yeast) ,dipelajari secara mendalam dalam suatu ilmu yang disebut Mikri biologi, yaitu
ilmu yang mempelajari jasad renik (mikroorganisme). Dalam divisio Thallophyta
terdapat golongan Eumycetes yang terdiri dari empat kelas, yaitu ascomycetes,
Basidiomycetes, Phycomycetes, dan Deuteromycetes (Fungi Imperfecty). Dari kelas
Phycomycetes terdapat contoh yang terkenal, seperti Rhyzopus dan Mucor, yang sering
terdapat sebagai kontaminan pada biakan bakteri.

Ragi mempunyai cirri-ciri khusus, antara lain berukuran 5,0 10,0 U, dapat tumbuh
pada media buatan, unicellular, dan bereproduksi secara sexual atau asexual. Beberapa
ragi ada yang berguna bagi industri untuk proses permentasi atau berguna di pabrik
makanan dalam kaleng, ada yang dapat menyebabkan kerusakan pada kayu dan kain,
dan ada juga yang dapat menyebabkan penyakit atau menambah kesuburantanah.
Banyak ragi yang mempunyai peranan dalam industri, misalnya true yeast digunakan
dalam proses pembuatan roti, bottom yeast dalam proses pembuatan bir,top yeast
dalam peroses destilasi alkohol ,wild yeast dalam proses pembuatan anggur (wine) ,dan
false yeast sering kali menybabkan ferementasi yang tidak diinginkan.
Buluk tidak banyak berbeda dengan ragi hanya saja buluk mempunyai hypha,yaitu
bulu- bulu kasar dan panjang,dan kumpulan hypha disebut mycelium. Buluk
mempunyai ciri ciri
Khusus ,antara lain berukuran 5.0 U atau lebih ,dapat tumbuh pada media buatan
,multicelluler dan berreproduksi secara asexual dan asexual . Beberapa buluk ada yang
berguna dalam industri ,ada yang dapat menghasilkan antibiotik dan ada pula yang
merusak kayu atau menyebabkan penyakit pada tanaman.
Bakteri mempunyai ukuran yang sangat kecil sehingga tidak dapat terlihat tanpa
menggunakan mikrokop. Dalam keadaan biasa tidak pernah dapat melihat satu sel
bakteri dan hanya dalam bentuk koloni saja bakteri dapat terlihat. Cirri-ciri khusus dari
bakteri antara lain berukuran 0.5-50.0 U, uniseluler, dapat tumbuh pada media buatan,
dan bereproduksi dengan cara membelah diri. Beberapa bakteri ada yang berguna
dalam industry, ada yang dapat menghasilkan antibiotika dan ada pula yang dapat
meningkatkan kesuburan tanah atau menyebabkan penyakit pada tanaman.

Biakan yang terdiri dari hanya satu species/strain bakteri disebut biakan murni,
sedangkan bikan yang terdiri lebih dari satu species/strain bakteri disebut biakan
campuran. Kebanyakan mikroorganisme dapat tumbuh pada media buatan yang pada
dasarnya dapat digolongkan dalam tiga golongan, yaitu :
(1) Natural media, bersal dari potongan-potongan buah-buahan, sayuran atau
jaringan binatang(daging).
(2) Culture media, berasal dari pepton, ekstrak tanaman,agar atau senyawa kimia
lainya.
(3) Synthetic media, berasal dari zat kimia murni.

Biasanya media dasar dibuat dari bulyon (air kaldu) atau ekstrak kentang/toge
dicampur dengan pepton, NaCL, aquadest dan agar. Apabila dalam suatu biakan
tumbuh mikroorganisme yang tidak dikendaki, peristiwa ini disebut
kontaminasi. Sebaliknya apabila ke dalam suatu bahan kita tanamkan
mikroorganisme maka peristiwa ini disebut inokulasi. Biasanya
menginokulasikan suatu bakteri memerlukan waktu untuk member kesemptan
kepada bakteri untuk tumbuh dan waktu ini disebut masa inkubasi.
Untuk menghindari kontaminasi, maka semua alat dan bahan yang akan
digunakan di laboratorium harus steril (bebas mikroorganisme).





PRAKTIKUM I
MELIHAT BENTUK DAN UKURAN BEBERAPA MACAM BAKTERI, BULUK DAN RAGI
TUJUAN :
Praktikum ini bertujuan untuk membandingkan morfologi (bentuk, ukuran dan
susunan) bakteri dengan buluk dan ragi.

BAHAN DAN ALAT
Bhan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah (1) preparat jadi dari
beberpa species bakteri, buluk dan ragi, dan (2) oil immersion dan mikroskop.

CARA KERJA
Cara kerja praktikum ini mengikuti langkah-langkah sebagai berikut :
(1) Amati preparat yang sudah disediakan dengan pembesaran yang sesuai,
(2) Bandingkan bentuk, ukuran dan susunan dari mikroorganismr yang anda lihat.
(3) Catat dan gambar apa yang anda lihat.


IV PENGECATAN
Bakteri bersifat transparant, berukuran kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata
telanjang. Untuk mengetahui struktur, morfologi dan sifat kimia bakteri, kita perlu malakukan
pengecatan terhadap bakteri tersebut. Pengecatan bakteri tergantung dari sifat fisik dan
kimiawi zat warna tersebut. Persenyawaan zat warna harus memiliki komponen komponen
warna dalam tiap molekulnya. Pada pokoknya zat warna untuk meliht bakteri adalah bahan
kimia dari golongan aniline dan secara garis besar zat warna dibagi atas dua golongan, yaitu zat
warna asam dan zat warna basa. Istilah asam dan basa tidaklah menunjukan reaksi kimianya,
melainkan untuk menunjukan apakah zat warna tersebut bersatu dengan anion atau dengan
kation. Seabagai contoh dalam reaksi zat warna methylene blue chloride, yang bertindak
sebagai zat warnanya adalah kation methylene blue.
Methylene blue chlorida

Jadi dalam hal ini zat warna tersebut termasuk zat warna basa.
Beberapa pengecatan yang kita kenal ialah pengecatan tunggal atau sederhana dan
pengecatan majemuk. Pengecatan tunggal ialah pengecatan yang menggunakan satu macam
zat warna saja, misalnya fuchsin, crystal violet atau methylene blue. Sedangkan pengecatan
majemuk ialah pengecatan yang menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dalam
pengecatan majemuk kita kenal beberapa pengecatan khusus, seperti pengecatan Gram, Ziehl-
Neelsen, Klein, BurriGGins, dan lain-lain.











4. 1. PENGECATAN TUNGGAL
PRAKTIKUM II
Pengecatan Tunggal
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk melihat morfologi (bentuk, susunan) bakteri dengan
menggunakan satu macam zat warna.
Bahan dan alat
Praktikum ini menggunakan bahan dan alat sebagai berikut :
(1) Biakan murni Bacillus subtilis dan S. aureus,
(2) Zat warna carbol fuchsin / safranin, carbol gentian violet dan methylene blue,
(3) Gelas obyek, ose dan lampu spirtus.
Cara kerja
Pelaksanaan praktikum ini meliputi dua langkah, yaitu :
(1) Membuat film, dan (2) pengecatan
(1) Membuat film
Untuk mendapatkan hasil pengamatan yang baik, pembuatan film memegang peranan yang
penting. Bakteri yang terlalu bertumpuk atau terlalu tipis di atas gelas obyek akan
menghasilkan gambaran yang kurang jelas setelah pengecatan.

Cara membuat film
(1) Bersihkan gelas obyek dengan kapas yang sudah diberi alcohol 95% untuk
menghilangkan lemak dan mikroorganisme yang menempel, lalu keringkan di udara.
(2) Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas obyek untuk membatasi film.
(3) Ambil satu ose suspense bakteri secara aseptic (ose dibakar di atas lampu spirtus sampai
memijar, kemudian dinginkan sebentar), lalu tempelkan pada bagian dalam dari tabung
biakan sebelum mengambil suspensi bakteri. Buat film setipis mungkin di atas gelas
obyek di dalam batas lingkungan tadi.
(4) Lakukan fiksasi dengan cara melakukan film di atas api secara cepat dua sampai tiga kali.
Maksudnya untuk membunuh bakteri secara cepat sehingga tidak mengalami
perubahan bentuk. Disamping itu fiksasi juga dapat melekatkan bakteri pada gelas
obyek.

Langkah-langkah pembuatan film di atas senantiasa dilakukan sebelum kita melakukan
pengecatan.
(2) Pengecatan
(1) Tambahkan salah satu zat warna di atas film tadi dengan waktu yang sesuai, yaitu
untuk carbol fuchsin 15-20 detikk, carbol gentian violet 30-45 detik, dan
methyleneblue 3-5 menit.
(2) Buang zat warna tersebut lalu cuci dengan air untuk menghilangkan zat warna yang
tidak terpakai.
(3) Keringkan dengan kertas saring.
Langkah selanjutnya setelah membuat film dan mengecat ialah :
(3) Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat (lensa obyektif 100 x). untuk
pembesaran kuat ini harus selalu dipakai immersion oil untuk mengumpulkan
cahaya.
(4) Catat dan gambar apa yang anda lihat.

4. 2. PENGECATAN MAJEMUK

(1) Pengecatan Gram
CRISTIAN GRAM (1844) menemukan penggolongan bakteri Gram positif dan Gram negative.
Penggolongan bakteri ini berdasarkan atas :
(1) Terdapatnya kenyataan, bahwa beberapa golongan bakteri yang mengandung
asam ribo nukleat (Ribo nucleic acid) yang terikat kuat dengan crystal violet dan
jodium sehingga tidak dapat larut dalam alkohol. Bakteri demikian disebut
bakteri Gram positif. Sebaliknya bakteri yang tidak mengandung RNA tidak
terikat kuat oleh crystal violet dan jodium sehingga zat warna mudah terlepas
pada waktu pencucian dengan alcohol .
(2) Pada bakteri Gram positif banyak ditemukan Mg, sedangkan pada bakteri Gram
negatif tidak.
Penilaian Gram positif dan Gram negative dilakukan setelah pencucian dengan
alkohol. Apabila bakteri diwarnai dengan gentian violet kemudian diperiksa,
ternyata sebagian ada yang penuh dengan gentian violet dan sebagian ada yang
kosong, maka sebenarnya sudah dapat disebutkan bahwa bakteri Gram positif
adalah yang mengandung zat warna gentian violet (berwarna ungu), sedang bakteri
Gram negatif adalah yang kosong. Untuk memperjelas, maka bakteri yang belum
berwarna tadi diberi zat warna lain yang kontras dengan pewarnaan primer. Pada
waktu diberi zat warna kedua, yaitu fuchsin, maka bagian yang kosong tadi akan diisi
oleh fuchsin sehingga bakteri itu akan berwarna merah. Contoh contoh bakteri
Gram positif antara lain Bacillus subtillis, Streptococcus Lactis dan Staphylococcus
aureus. Contoh contoh bakteri Gram negative antara lain Corynebacterium
diptheri, Escherichia coli dan Salmonella typho



PRAKTIKUM III
PENGECATAN GRAM
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk membedakan bakteri yang bersifat Gram
positif dan Gram negatif.

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah
(1) Biakan murni S. aureus, E. coli dan B. subtillis.
(2) Zat kimia/warna carbol gentian violet, fuchsin/safranin, larutan lugol
(J+KJ+air) dan alcohol 95%.
(3) Gelas obyek, ose dan lampu spirtus.
Cara Kerja
Langkah langkah kerja praktikum ini adalah sebagai berikut :
(1) Buat film (seperti pada praktikum II),
(2) Tambahkan carbon gentian violet selama 3 menit,
(3) Buang, tambahkan larutan lugol 1 menit,
(4) Cuci dengan alcohol sampai tidak ada zat warna yang larut,
(5) Cuci dengan air, tambahkan fuchsin / safranin 1 2 menit,
(6) Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring, dan
(7) Amati dengan pembesaran kuat. Gram positif akan berwarna ungu
(violet) dan Gram negative akan berwarna merah.

(2) PENGECATAN ZIEHL NEELSEN
Bakteri ada yang mempunyai sifat tahan asam dan ada pula yang tidak
tahan asam (PELCZAR, 1954). Bakteri mempunyai sifat dapat beradaptasi dengan
keadaan sekelilingnya apabila dirasakan akan merugikan dirinya. Dalam keadaan
demikian, dinding sel membentuk suatu lapisan semacam lilin yang tebal untuk
mempertahankan dirinya.

Untuk mengetahui apakah bakteri tahan asam atau tidak maka pada
metode Ziehl-Neelsen dilakukan pemanasan terhadap preparat yang telah dibubuhi
carbol fuchsin, maksudnya supaya zat lilinnya mencair sehingga zat warna dapat
meresap ke dalam badan bakteri. Pemanasan dilakukan selama 5 menit pada
temperature kurang lebih 80C.

Bakteri yang tahan asam akan tetap berwarna merah karena
mempertahankan zat warna utama (dalam hal ini carbol fuchsin), meskipun
ditambah asam sulfat, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melepaskan
kembali zat warna utamanya pada waktu penambahan dengan asam sulfat,
sehingga badan bakteri akan kosong. Pada waktu penambahan zat warna kedua
(methylene blue), bakteri yang tidak tahan asam ini akan menyerap methylene blue
sehingga bakteri berwarna biru.
Contoh contoh bakteri tahan asam ( Z. N. + ) antara lain Mycobacterium
tuberculosis, M. leprae dan M. smegmatis. Contoh bakteri tidak tahan asam (Z. N. -
) antara lain S. aureus.

PRAKTIKUM IV
PENGECATAN TAHAN ASAM MENURUT
METODE ZIEHL NEELSEN

TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk membedakan bakteri yang tahan asam dan yang tidak
tahan asam.

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dlam praktikum ini ialah :
(1) Biakan murni S. aureus, B. subtilis dan M. smegmatis.t
(2) Zat kimia/ wrna karbol fuchsin, methylene blue dan alkohol / asam sulfat pekat 5%.
(3) Gelas obyek, ose dan lampu spirtus.

CARA KERJA
Langkah kerja praktikum ini adalah sebagai berikut :
(1) Membuat pilm ,
(2) Tambahkan karbol fuchsin dan panaskan slama 3 5 menit pada temperature 80C.
jaga jangan sampai mendidih, kalau kering tambah lagi zat warnanya.
(3) Buang, celupkan ke dalam asam sulfat atau alkohol asam selama 10 30 detik,
(4) Cuci dengan air, tambahkan methylene blue 3 menit,
(5) Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring,
(6) Amati dengan pembesaran kuat. Bakteri tahan asam akan berwarna merah dan
bakteri yang tidak tahan asam akan berwarna biru.




(3) PENGECATAN SPORA BAKTERI

Menurut BUCHANAN dan BUCAHANAN (1957)dan SALLE (1954), beberapa bakteri
dapat mengubah dirinya dari bentuk vegetative menjadi spora ini kegiatan bakteri akan

berhenti, tidak bermetabolisme ataupun bereproduksi. Dalam bentuk ini bakteri sangat
resisten terhadap pengaruh luar.
Berdasarkan letak spora dikenal tiga macam letak, yaitu :
(1) Sentral, (2) subterminal, dan (3) terminal.


PRAKTIKUM V

PENGECATAN SPORA BAKTERI MENURUT METODE
KLEIN DAN METODE WIRTZ
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk melihat bentuk spora di dalam sel bakteri
Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Biakan murni B. subtillis,
(2) Zat kimia / warna carbol fuchsin, methylene blue,
Malachite green, safranin, asam sulfat dan alkohol,
(3) Gelas obyek, ose, safranin, tabung reaksi, pemanas air dan thermometer.

CARA KERJA

(1) Metode Klein I
(1) Campurkan suspensi bakteri dengan carbol fuchsin dalam tabung reaksi dengan
perbandingan 1 : 1 ; panaskan dalam pemanas air selama 10 menit pada
temperature 80C.
(2) Buat film dari campuran suspensi tadi,
(3) Celupkan kedalam asam sulfat selama 1 2 detik.
(4) Cuci dengan air, tambahkan methylene blue 3 menit.
(5) Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
(6) Amati dengan pembesaran kuat. Spora berwarna merah sedangkan bentuk
vegetatif berwarna biru.

(2) METODE KLEIN II
(1) Buat film dari suspense bakteri,
(2) Tambahkan carbol fuchsin, panaskan sampai keluar uap (80C) selama 10 menit,
(3) (langkah-langkah selanjutnya sama dengan Metode Klein I dari langkah 3 6.


(3) METODE WIRTZ
(1) Buat film,
(2) Tambahkan malachite green, panaskan sampai menguap 2 menit,
(3) Cuci dengan air, tambahkan safranin selama 39 detik,
(4) Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring, dan
(5) Amati dengan pembesaran kuat. Spora berwarna hijau dan badan bakteri berwarna merah
muda.


(4) PENGECATAN KAPSUL BAKTERI
Pada bagian sebelah luar dari dinding sel beberapa jenis bakteri terdapat suatu zat
semacam lender (gum). Karena zat tersebut terdapat mengelilingi bakteri dan menyerupai
kapsul, maka struktur demikian disebut kapsul bakteri.

Strutur itu dapat tipis atau tebal tergantung pada jenis bakteri itu sendiri dan jenis
bahan makanan yang terkandung dalam media atau substrat. Kapsul merupakan ekskresi
dari dinding sel bakteri itu sendiri dan berfungsi untuk melindungi dirinya.
Ada kapsul pada bakteri pathogen mempunyai hubungan erat dengan virulensi bakteri
itu sendiri. Bakteri dengan kapsul yang tebal mempunyai virulensi lebih tinggi daripada
bakteri dengan kapsul yang tipis atau dengan yang tidak berkapsul sama sekali.
Pengecatan kapsul bakteri ini disebut juga pengecatan negative, karena disini yang
diwarnai adalah latarbelakangnya sedangkan obyektifnya sendiri (dalam hal ini kapsul) tidak
diwarnai.
Pada metode Burri-Gins dipakai tinta cina untuk mewarnai latar belakangnya,
sedangkan untuk mewarnai badan bakterinya sendiri digunakan larutan fuchsin, sehingga
badan bakteri berwarna merah dan kapsulnya tidak berwarna (transparent) pada latar
belakang yang hitam.
Pada metode maneval, untuk mewarnai badan bakteri digunakan Congo-red, sedangkan
untuk latarbelakangnya digunakan cat maneval. Badan bakteri akan berwarna merah
sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang berwarna hijau.







PRAKTIKUM VI

PENGECATAN KAPSUL BAKTERI DENGAN
METODE BURRI-GINS DAN METODE MANEVAL

Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk melihat adanya kapsul bakteri.
Bahan dan Alat
Bahan dan Alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Biakan murni K. pneumonia,
(2) Zat kimia / warna larutan fuchsin, Congo red, tinta cina, cat Maneval dan media cair.

Cara Kerja
(1) Metode Burri-Gins
(1) Bersihkan gelas obyek,
(2) Teteskan satu ose suspense bakteri diatas gelas obyek pada bagian ujungnya,
(3) Teteskan 1-2 ose tinta cina didekatnya, lalu campurkan,
(4) Buat preparat hapus dengan cara mendorong ke depan dengan mempergunakan
gelas obyek lain,
(5) Keringkan di udara, tambahkan karbol fuchsin selama 1-2 menit,
(6) Keringkan dengan kertas saring,
(7) Amati dengan pembesaran kuat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri
berwarna merah dengan latar belakang berwarna hitam.

(2) METODE MANEVAL
(1) Teteskan 5-6 OSE Congo red pada gelas obyek,
(2) Ambil satu ose suspense bakteri, campurkan dengan Congo red tadi. Buat film
setipis mungkin,
(3) Keringkan di udara, tambahkan Cat Maneval satu menit,
(4) Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring,
(5) Amati dengan pembesaran kuat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri
berwarna merah dengan latar belakang biru.









V. MEDIA
Syarat mutlak yang harus diperhatikan dan diperlakukan untuk mempelajari
mikroorganisme tersebut pada media buatan di laboratorium. Untuk ini kita perlu mengetahui
bahan-bahan / zat-zat yang diperlukan serta kondisi fisik yang diinginkan oleh setiap
mikroorganisme.
Berdasarkan hasil penelitian, para ahli dapat menentukan bahan-bahan yang baik untuk
pertumbuhan mikroorganisme yang selanjutnya disebut medium (media). Setiap jenis
mikroorganisme mempunyai kebutuhan yang berbeda-beda. Meskipun demikian, kebanyakan
bakteri tumbuh baik pada media dasar, yaitu media yang terdiri dari ekstrak daging + pepton +
NaCL + aquadest. Untuk memadatkan media dasar tersebut dapat ditambahkan agar, misalnya
untuk media padat ditambah 3% agar dan untuk media setengah padat ditambahkan 1,5% agar.
Ada beberapa bakteri yang tidak tumbuh baik pada media dasar. Untuk mendapatkan
pertumbuhan yang baik dari bakteri tersebut, kepada media harus ditambahkan beberapa zat
yang diperlukan, misalnya darah, serum, ekstrak toge, kentang dan lain-lain. Media demikian
disebut media diperkaya ( enrichment media).

Berdasarkan kepadatannya media dibagi atas :
(1) Media cair, tidak ditambah agar,
(2) Media setengah padat (media semi solid), ditambah 1,5% agar, dan
(3) Media padat (media solid), ditambah 3% agar.

Berdasarkan fungsinya dikenal tiga media, yaitu :
(1) Media agar plat, yaitu media agar padat dalam petridist ; digunakan untuk isolasi
bakteri dan penghitungan bakteri.
(2) Media agar tegak, yaitu media agar setengah padat dalam tabung reaksi ; digunakan
untuk menguji gerak bakteri secara makkroskopis, dan
(3) Media agar miring, yaitu media agar padat yang letaknya miring dalam tabung reaksi ;
digunakan untuk menyimpan biakan murni.

5. 1. PENYEDIAAN MEDIA

(1) Mencampurkan bahan-bahan, seperti pepton, ekstrak daging, aquadest, dan lain-lain.
(2) Mengatur pH media sampai batas optimum. Kebanyakan bakteri mempunyai pH
optimum antara pH 6,5 sampai pH 7,5.
(3) Untuk membuat media cair, larutan ini bisa langsung disaring, sedangkan untuk
membuat media padat atau setengah padat harus ditambah agar. Untuk media cair
penyaringan dapat mempergunakan kertas saring, sedangkan untuk media padat
dengan kain saring dan kapas.
(4) Masukkan media kedalam tempat yang sesuai dengan keperluannya, misalnya tabung
reaksi atau Erlenmeyer yang kemudian ditutup.
(5) Sterilisasi.

5. 2. STERILISASI

Sterilisasi adalah cara untuk membebaskan alat-alat atau media dari mikroorganisme.
Prinsip dari sterilisasi ialah membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme
dengan cara mengubah keadaan lingkungan, baik secara fisik maupun secara kimia.
Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan antara lain dengan cara :

(1) Mempergunakan temperature tinggi, artinya temperature diatas batas maksimum bagi
kebanyakan bakteri. Ada dua macam sterilisasi dengan temperature tinggi yaitu :
(1) Sterilisasi kering (dry heat)
Sterilisasi dengan cara ini biasanya digunakan untuk sterilisasi alat-alat dari gelas.
Caranya yaitu dengan mempergunakan udara kering panas dalam alatyang disebut
oven. Alat-alat gelas sesudah dicuci dibungkus dengan kertas, kecuali tabung reaksi
yang cukup dengan ditutup kapas pada mulut tabungnya. Sterilisasi alat-alat ini
biasanya berlangsung antara 2-3 jam pada temperature 170C. cara lain dari
sterilisasi kering ialah dengan menggunakan sinar matahari langsung (dijemur) atau
dengan asap (pengasapan).

(2) Sterilisasi basah (moist heat)
Cara ini merupakan cara yang paling baik untuk mengsterilkan media. Ada dua cara
sterilisasi basah, yaitu (1) mempergunakan uap panas dan tekanan, dan (2)
mempergunakan uappanas tanpa tekanan. Pada cara pertama alatnya disebut
autoclave dan pada cara kedua digunakan semacam langseng biasa dan disebut
armold 9Tyndalisasi). Dalam autoclave, tekanan dimaksudkan untuk mendapatkan
temperature yang lebih tinggi dari 100C, karena pada temperature kurang dari
100C spora bakteri tidak mati. Pada autoclave digunakan tekanan 15 lbs, dan pada
tekanan tersebut temperature dapat mencapai 121.2C yang dapat mematikan
spora bakteri. Pada system Arnold, temperature hanya mencapai 100C karena
tekanan tidak dapat melampaui satu atmosfir. Untuk membunuh spora bakteri
pada sistim ini digunakan sterilisasi bertingkat, yaitu dengan cara memanaskan
media sebanyak tiga kali (tiga hari berturut-turut selama masing-masing satu jam)
dengan masa inkubasi masing-masing 24 jam untuk member kesempatan pada
spora untuk berubah bentuk menjadi vegetative yang dapat dibunuh pada
pemanasan 100C berikutnya.

Ada beberapa media yang apabila dipanaskan dengan temperature tinggi akan
mengalami perubahan susunan kimianya. Untuk mengalami hal ini maka digunakan
cara Pasteurisasi yang hanya mencapai temperature 70C sehingga hanya dapat
membunuh beberapa jenis bakteri tertentu, misalnya dalam pasteurisasi susu,
cream, bird an media gula gula.


(2) sterilisasi dengan mempergunakan temperatur rendah
Berlainan dengan temperature tinggi yang dapat dianggap sebagai bakterisida
(pembunuh bakteri), maka temperature rendah hanya dapat dianggap sebagai
bakteriostatik (penghambat pertumbuhan bakteri). Hal ini disebabkan karena pada
umumnya bakteri bentuk vegetative mati pada temperature 80-100C dan spora pada
120C, sedangkan pada temperature rendah bakteri hanya dapat dihambat
pertumbuhannya saja akan tetapi tidak mati. Ada beberapa bakteri dan virus yang tetap
hidup pada -20C, bahkan ada yang tahan pada -70C. biasanya temperature rendah
(4.5-7.0C dalam refrigator) dipergunakan untuk menyimpan media yang sudah steril
supaya tidak terjadi kontaminasi dan supaya tidak cepat kering.

(3) FILTER
atau dibekukan. Pada dasarnya filter ini terdiri dari tabung yang pada salah satu
ujungnya ditutup dengan lempeng yang berpori-pori dengan ukuran lebih kecil dari
ukuran bakteri. Dengan sistim Filter biasanya digunakan untuk mengsterilkan media
yang sama sekali tidak boleh dipanaskan isap tau tekanan, media dipaksa melewati pori-
pori dan hasil saringannya yang sudah bebas bakteri ditampung dalam tempat yang
steril.

(4) RADIASI
Sinar yang biasa digunakan untuk sterilisasi dengan cara ini ialah sinar ultra violet, sinar
X, sinar Gama, sinar Katode, dan lain-lain.
(5) CENTRIFUGE
Prinsifnya ialah memisahkan bakteri dengan media berdasarkan perbedaan beratny
dengan cara memutar bahan dengan kecepatan yang tinggi.

(6) TEKANAN OSMOSIS
Penggunaan garam dan gula sebagai bahan pengawet adalah didasarkan atas perbedaan
tekanan osmosisnya.

Sterilisasi secara kimia dengancara menggunakan bahan-bahan kimia sehari-hari sebagai
bahan untuk membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme telah banyak
dilakukan dan digunakan. Bahan-bahan kimia yang banyak digunakan antara lain phenol,
alcohol, jodium tincture, formalin, dan lain-lain (lihat praktikum X).







PRAKTIKUM VII

PENANAMAN BAKTERI PADA BERMACAM-MACAM MEDIA

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Biakan murni,
(2) Suspense campuran dua macam bakteri,
(3) Media agar plat, agar tegak, agar miring dan media cair steril, dan
(4) Ose dan lampu spirtus.

CARA KERJA
(1) Menanam / mengisolasi bakteri pada agar plat dengan cara goresan (streak method)

Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk memisahkan bakteri dari suspense yang
mengandung beberapa macam bakteri.

Metode
(1) Tuangkan media agar bulyon steril yang masih panas sebanyak 10 ml ke dalam
petridist steril. Pada waktu menuangkan media, petridist tidak boleh dibuka
lebar-lebar supaya tidak terjadi kontaminasi.
(2) Biarkan media menjadi padat dan dingin.
(3) Ambil satu ose suspense campuran bakteri, kemudian goreskan menurut
goresan sebagai berikut :








(4) Simple streak cross strek

(5) Inkubasikan satu atau dua hari untuk member kesempatan pada bakteri untuk
membentuk koloni.

(6) Lihat koloni koloni yang terbentuk, bedakan berdasarkan sifat sifat
koloninya,


(2) Menanam bakteri pada agar tegak semi solid

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk melihat gerak bakteri secara makroskopis.

Metode

(1) Sediakan media agar semi solid kurang lebih 5 ml dalam tabung reaksi,
kemudian sterilkan.
(2) Setelah dingin, tusukan satu ose jarum suspense bakteri pada bagian tengah
media secara aseptic.
(3) Inkubasikan paling sedikit 24 jam.
(4) Lihat penyebaran pertumbuhan bakteri tersebut. Bila pertumbuhan banyak
terlihat pada permukaan media, bakteri tersebut disebut mempunyai gerak
positif, dan bila pertumbuhannya hanya terdapat di sekitar bekas tusukan, maka
bakteri tersebut disebut mempunyai gerak negative.

(3) Menanam bakteri pada agar miring
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk menyimpan biakan murni bakteri sebagai persediaan
bakteri di Laboratorium.

Metode
(1) Sediakan kurang lebih 5 ml media agar bulyon pada tabung reaksi, lalu sterilkan.
Pada waktu media masih panas, tabung diletakkan miring (sudut kurang lebih
15 ) sampai media membeku.
(2) Ambil satu ose bakteri secara aseptic, buatlah goresan sebanyak mungkin pada
permukaan media (garis zigzag). Jagalah supaya media tidak tercongkel.
(3) Inkubasikan 24 jam
(4) Lihat apakah ada pertumbuhan atau tidak.
(4) Menanam bakteri pada media agar
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk memperbanyak bakteri.
Metode
(1) Sediakan media cair yang sudah disterilkan pada tabung reaksi.
(2) Tanamkan satu ose bakteri pada media tersebut.
(3) Inkubasikan 24 jam.
(4) Lihat apakah ada pertumbuhan atau tidak. Apabila terdapat pertumbuhan,
cairan akan kelihatan keruh.


VI. ISOLASI DAN DETERMINASI

Untuk mendeterminasi setiap bakteri yang terdapat dalam bahan yang mengandung
beberapa macam bakteri, kita perlu membuat biakan murni dari masing-masing bakteri
tersebut. Dari biakan murni inilah kita menyelidiki semua sifat yang dipunyai bakteri yang
selanjutnya diperlukan untuk mendeterminasi bakteri tersebut.

Untuk membuat biakan murni ini digunakan secara isolasi (memisah-misahkan bakteri),
kemudian dari hasil isolasi ini kita pilih koloni yang terpisah lalu kita tanamkan pada media agar
miring. Setelah kita inkubasikan akan terlihat pertumbuhan. Biakan inilah yng disebut biakan
murni (biakan yang hanya terdiri dari satu macam bakteri).

6. 1. Isolasi

Terdapat dua macam isolasi, yaitu :

(1) Cara goresan ( steak plate method )
Cara mengisolasinya dapat dilihat pada praktikum VII
(1). Setelah kita beda-bedakan koloni yang terbentuk berdasarkan sifat-sifat koloninya, kita
ambil koloni yang terpisah lalu kita pindahkan pada media agar miring. Kalau terdapat tiga
macam koloni, maka kita dapatkan tiga biakan murni.

(2) Cara tuang ( pour plate method )
Pada cara ini kita tuangkan media agar bulyon steril yang masih belum membeku
(temperature kurang lebih 45C) ke dalam petridist yang sudah diisi suspense bakteri yang
akan diisolasi. Pada temperature ini agar masih mencair dan bakteri tidak mati. Petridist
diletakkan terbalik, lalu diinkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasikan akan terlihat
pertumbuhan bakteri dalam bentuk koloni. Bedakan berdasarkan sifat koloninya. Ambil
koloni yang terpisah, tanamkan pada media agar miring, inkubasikan dan kita akan
mendapatkan biakan murni.

6. 2. Determinasi

Setelah kita mendapatkan biakan murni dari bahan yang akan dideterminasi, mulailah
dilakukan pengujian-pengujian terhadap bakteri tersebut, baik secara morfologis, fisiologis,
biokimia serologis maupun dengan cara-cara lainnya. Setelah kita peroleh data mengenai
bakteri tersebut, kita kumpulkan data itu dalam suatu daftar yang disebut descriptive chart,
yang untuk selanjutnya dibandingkan dengan sifat-sifat bakteri yang sudah dikenal yang
terdapat dalam buku Bergeys Manual of Determinative Bacteriology.
Dengan cara membandingkan sifat-sifat ini maka kita dapat memperkirakan termasuk
kedalam golongan mana bakteri tersebut.
Pengujian-pengujian yang biasa dilakukan untuk determinasi bakteri antara lain :
(1) Pengujian terhadap morfologi bakteri (bentuk, ukuran, susunan, ada-tidaknya spora,
kapsula, dan lain-lain) dan sifat fisiologis.
(2) Pengecatan untuk melihat adanya spora bakteri serta letaknya didalam sel bakteri
(metode Klein, Schaefer & Fulton)
(3) Pengecatan untuk melihat kapsula bakteri (metode Burri-Gins)
(4) Pengecatan untuk melihat adanya flagella
(5) Pengecatan Gram untuk membedakan bakteri Garm + dan Gram -.
(6) Pengecatan Ziehl-Neelsen untuk membedakan bakteri yang tahan asam dan bakteri
yang tidak tahan asam.

(2)Pengujian terhadap gerak bakteri
Gerakan bakteri disebabkan oleh gerakan flagella.
Bakteri yang tidak mempunyai flagella tidak dapat bergerak. Tedapat dua cara untuk
melihat gerak bakteri, yaitu :

(1) Secara makroskopis (cara tidak langsung )
Dalam cara ini yang dilihat bukanlah gerakannya secara langsung, melainkan hasil
dari gerakan itu sendiri. Caranya ialah dengan menusukkan satu ose suspense
bakteri yang akan diuji pada tengah-tengah media agar tegak semi solid, lalu
diinkubasikan. Bila bakteri bergerak, maka pertumbuhannya akan terlihat paling
banyak pada permukaan media, sedangkan bila tidak bisa bergerak,
pertumbuhannya hanya pada sekitar bekas tusukan saja.

(2) Secara mikroskopis (cara langsung)
Dengan cara ini kita dapat langsung melihat gerakan bakteri. Caranya ialah dengan
membuat preparat hidup lalu dilihat dibawah mikroskop dengan pembesaran sedang
(lensa objektif 45 x).

(1) Tetes tegak
Suspense bakteri diteteskan di atas gelas objek dan disekelilingnya dibuat
lingkaran dari vaselin putih. Gelas penutup diletakkandi atas suspense
sedemikian rupa sehingga antara gelas penutup dengan vaselin tidak terdapat
celah yang memungkinkan masuknya udara. Guna dari vaselin putih adalah
untuk mencegah supaya tidak ada udara yang masuk yang dapat mengakibatkan
suspense menjadi kering. Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran
sedang.

(2) Tetes gantung
Di sini suspense diteteskan di atas gelas penutup, kemudian letakkan terbalik di
atas gelas objek cekung yang pinggirnya sudah diolesi vaselin, sehingga suspense
tepat berada di atas bagian cekungnya sehingga suspense menggantung.
Amati dengan pembesaran sedang.
(3) Pengujian terhadap sifat biokimia bakteri.


PRAKTIKUM VIII
Cara-cara Membuat Biakan Murni
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk membuat biakan murni dari suatu campuran bakteri
dengan cara isolasi.

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Suspense campuran bakteri,
(2) Media agar padat steril, dan
(3) Ose dan petridist

Cara kerja
(1) Isolasi dengan cara goresan
(1) Tuangkan 10 ml media agar bulyon steril yang masih panas ke dalam petridist
steril. Biarkan membeku,
(2) Ambil satu ose suspense bakteri,
(3) Buatkan goresan goresan pada permukaan media (seperti dalam praktikum
VII. 1. ),
(4) Inkubasikan selama 24 jam. Amati koloni yang tumbuh, ambil koloni yang
terpisah, pindahkan satu ose ke dalam tabung agar miring dengan membuat
goresan sebanyak mungkin.
(5) Inkubasikan paling sedikit 24 jam. Inilah yang disebut biakan murni.

(2) Isolasi dengan cara tuang
(1) Ambil 1 ml suspense bakteri encer, masukkan ke dalam petridist steril secara
aseptic,
(2) Tuang media agar bulyon steril yang masih cair (kurang lebih 40C) ke dalam
petridist tadi.
(3) Goyangkan perlahan-lahan untuk meratakan bakterinya,
(4) Inkubasikan selama 24 jam. Amati koloninya, ambil koloni yang terpisah,
tanamkan pada agar miring,
(5) Inkubasikan selama 24 jam. Amati apakan terdapat pertumbuhan atau tidak.






PRAKTIKUM IX
DETERMINASI BAKTERI

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang dipergunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Biakan murni yang diperoleh dari praktikum VIII,
(2) Zat kimia/warna untuk pengecatan Gram, Klein dan lain-lain,
(3) Media agar tegak semi solid untuk test gerak,
(4) Media gula-gula untuk test biokimia, dan
(5) Media serum darah untuk test aglutinasi.

Cara Kerja
(1) Lakukan pengecatan Gram terhadap masing-masing biakan murni yang akan
dideterminasi,
(2) Lakukan pengecatan spora,
(3) Lakukan test gerak
(1) Secara makroskopis (lihat Praktikum VII.2)
(2) Secara mikroskopis
(1) Cara tetes tegak
(1) Bersihkan gelas objek dengan alcohol,
(2) Buat lingkaran kecil dengan vaselin,
(3) Teteskan 1-2 ose suspense dalam lingkaran tadi,
(4) Tutup dengan gelas penutup, dan
(5) Amati dengan pembesaran sedang.
(2) Cara tetes gantung (hanging drop preparation)
(1) Bersihkan gelas obyek cekung,
(2) Buat lingkarang dengan vaselin pada pinggiran cekungannya,
(3) Teteskan suspense di atas gelas penutup,
(4) Letakkan terbalik di atasbagian yang cekung dari gelas objek sehingga
suspense menggantung di tengah lingkaran vaselin, dan
(5) Amati dengan pembesaran sedang.

(3) lakukan test biokimia (pengujian daya fermentasi bakteri terhadap
karbohidrat).


Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk menguji apakah bakteri dapat
merombak gula menjadi asam dan gas atau tidak.




BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang dipergunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Sederet (lima tabung) media cair yang di tambah gula (karbohidrat yang
berbeda-beda ),
(2) Tabung Durham diletakkan terbalik di dalam media,
(3) Biakan murni dari bakteri yang akan diuji, dan
(4) Ose dan lampu spirtus.

Cara Kerja
(1) Sediakan deretan media gula-gula steril yang ditambah indicator phenol-red
(berwarna merah dalam suasana basa dan berwarna kuning dalam suasana
asam). Deretan gula gula itu tetap susunanya yaitu :
(2) Tanamkan bakteri yang akan diuji ke dalam lima tabung tersebut sebanyak satu
ose secara aseptic,
(3) Inkubasikan pada temperature kamar 1 2 x 24 jam,
(4) Amati hasilnya.
Bila cairan berubah menjadi kuning berarti suasana berubah menjadi asam. Ini
berarti bakteri merombak gula menjadi asam organic. Tabung yang demikian
kita beri tanda (+). Sedangkan apabila media tetap berwarna merah berarti
bakteri tidak dapat merombak gula. Untuk ini kita beri tanda (-). Apabila dalam
tabung Durham terdapat gelembung gas, berarti selain asam juga dihasilkan
gas. Tandailah dengan (+) g. akan tetapi apabila tidak terdapat gelembung gas,
tidak diberi tanda apa apa.
(5) Susunlah tanda tanda tersebut berurutan sehingga diperoleh susunan,
misalnya :
+ - - +g +g untuk Proteus vulgaris
Reaksi gula gula ini selalu tetap bagi setiap macam bakteri.

(5)Lakukan test Serologis

(6) Kumpulkan data di atas dalam suatau daftar descriptive chart. Bandingkan dengan
bakteri yang sudah dikenal dalam buku Bgs Manual of Determinative
Bag.









VII. PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP MIKROORGANISME

Keadaan lingkungan sangat berpengaruh terhadap aktifitas mikroorganisme. Setiap species
akan tumbuh optimum pada keadaan yang tertentu. Pada keadaan optimum organisme akan
tumbuh dan berkembang secara maksimum. Apabila terdapat perubahan keadaan
lingkungannya, maka akan terjadi perubahan dalam morfologi dan fisiologi dari organism itu.
Meskipun demikian, mikroorganisme mempunyai kemampuan yang besar untuk baradaptasi
terhadap lingkungannya yang baru, sehingga mikroorganisme tersebut akan bertahan hidup
dalam beberapa jenis keadaan.

Factor factor lingkungan yang sangat besar pengaruhnya terhadap kehidupan
mikroorganisme itu dapat diringkas sebagai berikut :

(1) Factor Fisik
(1) Kelembaban
Sel bakteri mengandung 83% air. Semua aktifitas bakteri tergantung dari kelembaban,
misalnya bila makanannya tidak larut dalam air maka makanan itu tidak dapat masuk ke
dalam sel hingga bakteri tersebut dapat mati. Hal ini penting terutama untukk sel sel
vegetatif.

(2) Tekanan osmotic
Apabila sel bakteri dikelilingi oleh larutan garam yang tinggi, maka bakteri akan
mengalami dehigrasi sehingga akan dapat mematikan. Bakteri bakteri pembusuk
sangat sensitive terhadap keadaan ini. Pada konsentrasi NaCL 5% - 10% saja organism
itu akan berhenti tumbuh. Oleh karena itu cara penggaraman dipakai untuk
mengawetkan makanan.

(3) Temperatur
Sehubungan dengan temperatur ini dikenal mikroorganisme : (1) psychrofil, yaitu
mikroorganisme yang tumbuh baik pada temperatur +6C sampai +10C, (2) mesofil,
yaitu organisme yang tumbuh baik pada temperature 20C sampai 35C, dan (3)
thermofil, yaitu organisme yang tumbuh optimum pada temperatur 50C sampai 60C.
Umumnya bakteri pembusuk berhenti tumbuh pada temperature rendah. Mereka tidak
memperbanyak diri tetapi juga tidak mati. Cara ini dipakai sebagai salah satu cara
pengawetan makanan. Temperatur tinggi sangat merusak mikroorganisme. Isi sel
bakteri pada temperature tinggi akan menggumpal dan semua enzym menjadi tidak
aktif. Pada temperatur 80C sampai 100C semua organisme dalam bentuk vegetatif
akan mati.
(4) Cahaya



Sinar matahari langsung dan sinar-sinar lainnya, seperti sinar X dan sinar ultra violet,
sangat mematikan mikroorganisme. Pemakaian sinar ultra violet telah dikembangkan
dalam proses pengawetan makanan.


PRAKTIKUM X
PENGARUH TEMPERATUR RENDAH


Tujuan :
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh temperature lingkungan terhadap
pertumbuhan bakteri.

Bahan dan alat :
Bahan dan alat yang dipergunakan dalam praktikum ini ialah ;
1. Biakan murni Eschericia coli dan Bacillus subtilis, dan
2. Enam buah tabung agar miring

Cara kerja :
1. Goreskan satu ose E. coli pada tiga tabung agar miring,
2. Goreskan satu ose B. subtilis pada tiga tabung agar miring lainnya,
3. Inkubasikan masing-masing pada refrigator, incubator, dan di luar (temperature kamar, dan
4. Catat hasil pengamatan anda.

PRAKTIKUM XI
PENGARUH TEMPERATUR TINGGI
Tujuan :
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh temperature lingkungan yang tinggi
terhadap petumbuhan bakteri.
BAHAN DAN ALAT :
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah ;
1. Biakan murni Eschericia coli berumur 24 jam, Staphylococcus aureus berumur 24 jam dan
Bacillus subtilis berumur 72 jam.
2. 12 tabung reaksi steril,
3. 17 tabung berisi nutrient agar,
4. 17 pipet steril dan 12 petridish steril, dan
5. Thermometer dan water bath.

Cara kerja :
1. Petridish diberi tanda sesuai dengan jenis organisme dan temperature yang diberikan,
2. Isikan masing-masing suspensi sebanyak 1 ml pada empat tabung reaksi steril secara
aseptic,
3. Panaskan masing-masing pada temperatur yang telah di tentukan selama 10 menit kecuali
kontrol,
4. Tuangkan masing-masing ke dalam petridish steril,
5. Panaskan nutrient agar sampai 50C, tuangkan ke dalam petridish, goyang-goyangkan
supaya rata,
6. Inkubasikan selama 24 jam, dan
7. Hitung jumlah koloni yang terjadi pada setiap petridish



PRAKTIKUM XII
PENGARUH TEKANAN OSMOSIS

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Ikan segar atau daging segar,
(2) Larutan garam 20% dan 30%,
(3) Larutan garam fisiologis steril,
(4) Pipet, petridist dan tabung reaksi steril, dan
(5) Pinset dan pisau.

Cara Kerja
(1) Ikan atau daging segar dicuci, timbang masing masing dua kali a 1 g,
(2) Pipet masing masing 9 ml larutan garam fisiologis, larutan 20% NaCL dan larutan 30% NaCl
ke dalam tabung reaksi steril secara aseptic,
(3) Masukkan 1 g irisan ikan/daging ke dalam tabung reaksi, biarkan kira kira 15 menit,
(4) Pipet masing masing 1 ml ke dalam petridit yang sudah diberi tanda sesuai dengan larutan
NaCL,
(5) Panaskan nutrient agar sampai 50C, tuangkan secara aseptic ke dalam petridist, goyang
goyangkan dan inkubasikan selama 24 jam, dan
(6) Hitung koloni yang terjadi dan catat hasilnya.



(2) Factor Kimia
Secara tidak sadar sehari hari kita telah biasa menggunakan zat zat kimia yang bersifat
anti mikroorganisme, misalnya penggunaan sabun, detergen, obat merah, alcohol. Karbol,
dan lain lain.
Jenis jenis senyawa kimia yang bersifat anti mikroba dapat di bedakan menjadi :
(1) Fenol dan senyawa senyawa fenol,
(2) AlKohol,
(3) Jodium,
(4) Chlor atau senyawa senyawanya,
(5) Logam logam berat dan senyawa senyawanya,
(6) Zat warna,
(7) Sabun dan detergen, dan
(8) Senyawa senyawa lainnya seperti HO, asam asam atau alkali alkali, dan
sebagainya.

Pengaruh senyawa senyawa kimia terhadap sel bakteri berbeda beda dan cara
pemakaiannyapun tidak sama. Fenol berpengaruh terhadap denaturasi protein sel bakteri
dan merusak dinding sel. Pemalkaian terhadap urine, faeces, sputum dan sebagainya.
AlKohol adalah protein koagulan disamping juga sebagai dehydrating agent. Digunakan
untuk desinfektan permukaan kulit.
Obat obatan yang sudah umum digunakan dari senyawa senyawa jodium sebagai
germicidal agent ialah jodium tincture. Sedangkan obat obat dari senyawa logam berat
ialah mercurochrome.
Zat warna yang mempunyai daya penghambat terhadap aktifitas bakteri ialah crystal
violet. Crystal violet menghambat sebagian besar bakteri yang Gran positif. Juga malachite
green dan brilliant green menghambat secara selektif Gram positif.
Sabun dan detergent akan mengurangi tegangan permukaan sehingga organisme
terlepas dari permukaan.














PRAKTIKUM XIII
PENGARUH ZAT WARNA

Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh zat warna terhadap
pertumbuhan bakteri.

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Biakan murni dari Eschericia coli dan Bacillus subtilis,
(2) 1 : 1.000 larutan crystal violet,
(3) Empat tabung nutrient agar steril ( 9 cc ),
(4) Empat buah petridist steril, dan
(5) Pipet 1 ml steril.

Cara Kerja
(1) Panaskan empat tabung nutrient agar,
(2) Pindahkan 1 ml larutan crystal violet 1 : 1.000 pada tabung reaksi yang berisi 9 ml air
hingga terjadi larutan 1 : 10.000,
(3) Pindahkan dengan pipet yang sama 1 ml larutan 1 : 10.000 ke petridist 1 dan tempatkan
tabung reaksi yang berisi air 9 ml air hingga terjadi larutan 1 : 100 000,
(4) Pipet larutan 1 : 100 000 ke petridist dank e tabung reaksi lain untuk mendapatkan
larutan 1 : 1 000 000,
(5) Pindahkan 1 ml larutan 1 : 1 000 000 ke petridist terakhir,
(6) Tuangkan nutrient agar 50C ke dalam tiga petridist, goyang goyangkan.
(7) Tuangkan nutrient agar terakhir ke dalam petridist yang tidak diberi crystal violet,
(8) Apabila agar sudah membeku, beri tanda pada petridist dengan membagi dua,
(9) Masing masing bagian diinokulasi dengan E. coli dan B. subtilis. Inkubasikan selama
48 jam pada temperature 37C, dan
(10) Catat pertumbuhan yang terjadi.












VIII. BAKTERI TANAH

Secara langsung dan tidak langsung sisa sisa tumbuhan, hewan maupun manusia
semuanya jatuh ke tanah. Bahan bahan ini diubah menjadi senyawa senyawa pembentuk
tanah. Perubahan perubahan terjadi karena hadirnya mikroorganisme di dalam tanah.

Tanah merupakan habitat bagi berjenis jenis mikroorganisme, seperti bakteri, jamur,
protozoa, algae, dan sebagainya, yang merupakan system biologis bersama sama dengan akar
akar tumbuhan tingkat tinggi, insekta ataupun hewan tingkat tinggi lainnya.

Semua mikroorganisme tanah mempunyai aktifitas biokimia di dalam tanah, seperti yang
berperan dalam siklus N, yaitu proses proses proteolitis, amonifikasi, nitrifikasi, denitrifikasi
dan fiksasi. Di dalam siklus carbon banyak mikroorganisme yang terlibat dalam pemecahan
senyawa senyawa karbon organic menjadi senyawa senyawa yang lebih sederhana.
Transpormasi sulfur, fosfat, besi dan mineral lainnya, banyak yang disebabkan oleh aktifitas
bakteri. Oleh karena itu, jumlah populasi mikroorganisme tanah dapat dipakai sebagai ukuran
untuk menentukan kesuburan tanah.






PRAKTIKUM XIV
PENGHITUNGAN BAKTERI TANAH SECARA MAKROSKOPIS

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Tanah dari berbagai vegetasi dan tak bervegetasi,
(2) Tabung reaksi dan petridist steril,












SKEMA PENGENCERAN









































PRAKTIKUM XV
PENGHITUNGAN BAKTERI TANAH SECARA MIKROSKOPIS

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Tanah dari berbagai vegetasi,
(2) Tabung reaksi dan pipet steril,
(3) Bilik hitung,
(4) Aquades steril, dan
(5) Mikroskop.


Cara Kerja
(1) Timbang 1 g tanah,
(2) Pipet 10 ml dan pipet 1 ml yang steril, hewan
(3) Nutrient agar steril dan aquadest steril, dan
(4) Timbangan.

Cara Kerja
(1) Timbang amsing masing 1 g tanah,
(2) Petridist dan tabung reaksi diberi tanda sesuai dengan tingkat pengenceran,
(3) Masukkan 1 g tanah ke dalam tabung I,
(4) Kocok diantara kedua telapak tangan kira kira 15 menit,
(5) Panaskan enam tabung nutrient,
(6) Pipet dari tabung I 1 ml suspense dan masukkan ke dalam tabung II hingga diperoleh
pengenceran 10 , kocok dengan mempergunakan pipet tadi,
(7) Pipet masing masing 1 ml suspense dari tabung II ke dalam tabung III dan ke dalam
petridist,
(8) Demikian dilakukan berturut turut terhadap tabung dan petridist selanjutnya, sehingga
didapat pengenceran 10.
(9) Tuangkan nutrient 50C ke dalam petridist secara aseptic, goyang goyangkan dan biarkan
membeku,
(10) Inkubasikan pada temperature kamar selama 24 48 jam, dan
(11) Hitung koloni yang tumbuh dari setiap petridist.

Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada skema pengenceran di halaman berikut.






(1) Pipet 9 ml aquadest steril ke dalam enam tabung reaksi steril secara aseptic,
(2) Masukkan 1 g tanah ke dalam tabung reaksi I,
(3) Kocok selama 15 menit,
(4) Buat pengenceran seperti pada praktikum XIV sehingga didapat pengenceran 10 ,
10 , 10 , 10 , 10 , 10.
(5) Bersihkan bilik hitung dengan skema,
(6) Lihat dibawah mikroskop apakah benar benar bersih, yaitu tidak terlihat adanya kotoran,
(7) Pipet dari berbagai pengenceran berurutan ke dalam bilik hitung yang mempunyai voleme
tertentu, tutup dengan gelas penutup,
(8) Lihat dibawah mikroskop dengan lensa okuler 8 x dan lensa objektif 45 x.
(9) Hitung dari setiapkotak yang terlihat. Ambil angka rata ratanya.



IX BAKTERI NODULA AKAR

Salah satu bakteri tanah yang penting bagi dunia pertanian ialah bakteri nodula akar atau
Rhizobium species. Bakteri ini sanggup mengikat N dari udara dan hidup bersimbose dengan
tanaman legume (kacang-kacangan). Kecuali yang hidup bersimbose di dalam tanah, masih
banyak bakteri yang sanggup mengikat N dari udara dan hidupnya non simbose. Dari
golongan ini dapat diambil contoh Azotobacter dan Clostridium pasteurianum. Yang pertama
hidup dalam keadaan aerob dan yang kedua hidup dalam keadaan an-aerob.

Bakteri Rhizobium sp. Hidup didalam akar rambut tanaman Legumenosa dan
membentuk gelembung pada akar tersebut. Gelembung inilah yang disebut nodula.

Untuk memperoleh pertumbuhan dan produksi yang baik maka sebelum penanaman biji
kacang kacangan di inokulasi dahulu dengan Rhizobium yang sesuai. Untuk keperluan inilah
kita perlu memperbanyak Rhizobium yang diinginkan. Sebelum diperbanyak bakteri ini harus
diisolasi dahulu sehingga diperoleh biakan murni.












PRAKTIKUM XVI
ISOLASI BAKTERI RHIZOBIUM DARI
NODULA AKAR TANAMAN LEGUMINOSA

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Tanaman kacang kacangan yang berumur satu bulan,
(2) Larutan HgCl 1,
(3) Larutan alcohol 70%,
(4) Sebuah plat agar kentang/toge,
(5) Aquadest steril dan air pencuci,
(6) Pinset, gunting, ose, dan gelas objek,
(7) Enam buah petridist steril dan mikroskop.


Cara Kerja
(1) Cabut tanaman secara hati hati supaya akarnya tidak tertinggal, potong pada pangkal
batang,
(2) Bersihkan dari tanah dengan air pencuci,
(3) Deretkan petridist di atas meja,
(4) Isi berturut turut dengan HgCl 1 / , alcohol , aquadest steril (tiga petridist) danyang
terakhir biarkan kosong,
(5) Gunting dengan hati hati akar rambut yang mengandung nodula, masukkan ke dalam
petridist I, aduk aduk dengan pinset selama tiga menit ; jaga agar nodula tidak terluka,
(6) Pindahkan nodula nodula ke dalam petridist II selama sartu menit,
(7) Bilas tiga kali dengan aquadest steril pada petridist berikutnya,
(8) Simpan nodula yang telah bersih tadi pada petridist steril terakhir,
(9) Pecah nodula dengan pinset steril, ambil satu ose cairan nodula dan gores goreskan pada
plat agar kentang/toge,
(10) Inkubasikan pada temperature kamar,
(11) Amati dan determinasi koloni yang timbul,
(12) Ambil satu ose cairan nodula, lihat geraknya dengan tetes gantung,
(13) Ambil satu ose cairan nodula, cat dengan pengecatan gram. Rhizobium sifatnya Gram - .









X. DISTRIBUSI MIKROORGANISME DI ALAM

Mikroorganisme terbesar luas di alam. Mereka terdapat di udara, di air, di tanah, pada
makanan, pada manusia dan sebagainya. Bahkan tempat tempat yang tidak terdugapun
seringkali masih didapatkan mikroorganisme.

Jumlah dan jenis mikroorganisme tergantung dari banyak factor, seperti lingkungan, tempat,
dan sebagainya. Untuk mengetahui lebih lanjut kita kerjakan Praktikum XVIII.





PRAKTIKUM XVIII
DISTRIBUSI MIKROORGANISME DI ALAM

BAHAN DAN ALAT
Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini ialah :
(1) Empat buah nutrient agar,
(2) Bahan bahan untuk pengecatan Gram,
(3) Gelas objek, ose dan mikroskop.

Cara Kerja
(1) Buka petridist yang mengandung media steril selama lima menit ditempat-tempat yang akan
anda periksa,
(2) Tutup kembali petridist tersebut dan dibungkus dengan kertas, lalu diinkubasikan selama 24
jam,
(3) Amati dan hitung koloni yang tumbuh,
(4) Lakukan pengecatan Gram terhadap bakteri dari koloni koloni yang berbeda, dan
(5) Lihat morfologinya di bawah mikroskop.












XI. SUSUNAN PEMBENIHAN

11. 1. Ekstrak Toge

Ekstrak toge dibuat dengan bahan dan cara sebagai berikut :

(1) Bahan : toge 500 gr
Aquasest 1 liter
(2) Cara : (1) toge digodog dengan aquadest selama satu jam
(2) saring dan tambahkan lagi aquadest sampai volume
tepat satu liter
(3) atur pH sampai 7. 4-7.6
(4) sterilkan dalam autoklaf.


11. 2. Ekstrak kentang

Ekstrak kentang dibuat dengan bahan dan cara sebagai berikut :

(1) Bahan : kentang 500 gr
Aquadest 1 liter
(2) Cara : (1) kentang yang sudah dikupas dipotong kecil-kecil
(2) godog dengan aquadest selama satu jam
(3) saring dan tambahkan lagi aquadest sampai volume tepat
satu liter.
(4) atur pH sampai 7. 4-7. 6.

Agar Kentang
(1) Bahan : ekstrak kentang 1 liter
Agar 30 gr
(2) Cara : (1) ekstrak kentang dan agar digodog sampai semua agarnya larut
(2) saring
(3) sterilkan dalam autoklaf






11.3. Ekstrak daging ( bulyon )


Ekstrak daging (bulyon) dibuat dengan menggunakan bahan dan cara sebagai
berikut :

(1) Bahan : daging sapi segar 500 gr
Aquadest 1 liter
Pepton 5 gr
NaCL 5 gr
(2) Cara : (1) daging segar dibersihkan dari lemak kemudian
dicingcang halus
(2) Daging digodog dengan aquadest selama 30 menit
(3) saring dengan kain kasar, lalu saring lagi dengan
kertas saring
(4) tambahkan lagi aquadest sampai volume tepat satu
leter
(5) tambahkan pepton dan NaCL
(6) atur pH sampai 7. 4-7.6
(7) sterilkan dalam autoklaf

Bulyon Agar

(1) Bahan : ekstrak daging 1 liter
Agar 30 gr
(2) Cara : (1) agar dengan ekstrak daging digodog sampai agar
larut semua
(2) saring
(3) sterilkan dalam autoklaf

Bulyon agar semi solid
(1) Bahan : ekstrak daging 1 000 ml
Agar 4 gr
(2) Cara : (1) agar dengan ekstrak daging digodog sampai agar larut
semua
(2) saring
(3) sterilkan dalam autoklaf




11. 4. Media agar gula gula

Media agar gula gula dibuat dengan menggunakan bahan dan cara sebagai berikut :

(1) Bahan : pepton 10 gr
Aquadest 1 liter
Phenol red 2 gr
Glukosa 2 gr
Laktosa 2 gr
Manit 2 gr
Maltose 2 gr
Sacharosa 2 gr

(2) Cara : (1) buat air pepton 1% (pepton 10 gr +
aquadest 1 liter)
(2) Tambahkan phenol red sebagai indikator
(3) bagi menjadi lima bagian masing-masing
200
(4) tambahkan glukosa / laktosa / manit
kedalam larutan tadi masing-masing 2 gr.
(5) saring dengan kertas saring
(6) sterilkan pada temperature 80-100C
selama kira-kira satu jam.


XII. FORMULA LARUTAN ZAT WARNA DAN REAGEN

11. 1. Pengecatan Tunggal (S-I)
(1) Zat warna 10 gr
Alcohol 96% 100 ml
(2) Campuran (1) 10 ml
Akuadest 90 ml

11.2. Pengecatan Gram (S-II)
Zat Warna I
(1) Crystal violet 2 gr
Alkohol 95% 20 ml
(2) Ammonium oksalat 0,8 gr
Akuadest 80 ml
Campurkan (1) dengan (2)




Mordan
Larutan Lugol
Jodium 1 gr
KJ 2 gr
Akuadest 300 ml

Zat Warna II
Safranin (2,5%) larutan dalam
95% alkohol 10 ml
Akuadest 100 ml


11.3. Pengecatan Ziehl-Neelsen (S-III)

Carbol Fuchsin
Larutan (1) : basic fuchsin 3 gr
Alkohol 10 ml
Larutan (2) phenol 5 gr
Akuadest 95 ml
Campurkan Larutan (1) dan (2)

Methylene blue (Loefflers)
Larutan (1) : methylene blue 0,3 gr
Alkohol 30 ml
Larutan (2) : KOH 0,01 gr
Akuadest 100 ml
Campurkan Larutan (1) dan (2).


11.4. Pengecatan Spora (S-IV)

Metode Klein
Karbol Fuchsin (seperti pada Ziehl-Neelsen)
Methylene blue (------------- sda-----------------)

Metode Wirtz
Malachite green 5%
Akuadest 100 ml
Safranin 0,55 %
Safranin 0,5 gr
Akuadest 100 ml







11.5. Pengecatan Kapsula (S-V)

Metode Burr-Gins
Larutan safranin (seperti pada pengecatan Gram)

Metode Maneval
Larutan (1) : congo red 1 gr
Akuadest 100 ml
Larutan (2) : phenol 5% 30 ml
Asam asetat 20% 10 ml
FeCL 30% 4 ml
Asam fuchsin 1% 2 ml

11.6. Alkohol Asam (R I)
HCL (conc.) 3 ml
Alkohol 95% 100 ml

11.7. Alkohol 70% ( R II)
Untuk membuat 500 ml alkohol 70% dari alkohol dipakai
rumus : 70/95 x 500 = 368,4
Kemudian 368,4 ml alkohol 95% ditambah akuadest hingga menjadi 500 ml alkohol
70%.

11.8. Larutan Pembersih (R III)
Na atau KCr 120,0 gr
Air 1000,0 ml
HSO pekat 1600,0 ml

11.9. Larutan HgCL 1 : 1 000 (R IV)

HgCL 1,0 gr
Akuadest 1 000,0 ml