Anda di halaman 1dari 29

1

I. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Budidaya udang windu (Penaeus monodon) secara intensif telah
berkembang sangat cepat terjadi tahun 1980 an dan produktivitas meningkat
sampai sekitar tahun 1990 an, sehingga udang merupakan primadona ekspor
perikanan bagi ndonesia! "saha budidaya udang windu intensif pernah
menunjukkan hasil yang memuaskan, hingga ndonesia menjadi salah satu
produsen udang papan atas di dunia yang pada tahun 199# mampu mencapai
angka produksi 1$0!000 ton%tahun! &amun akhir'akhir ini produksinya mengalami
penurunan dan dilaporkan terjadinya kematian massal dihampir semua tempat
budidaya udang di ndonesia ()nonim,199$)!
*assa kejayaan udang windu terhenti setelah adanya serangan penyakit
virus yang menginfeksi udang dan bahkan mencemari induk udang di laut!
+eberhasilan produksi pada masa lalu, ternyata tidak menyisakan prosedur baku
yang dapat diterapkan untuk mengulang keberhasilan tersebut di masa kini!
+arenanya, alasan keberhasilan atau pun kegagalan budidaya pada masa
sekarang adalah merupakan interaksi beberapa faktor sekaligus dilakukan di
suatu tempat pada waktu tertentu, sehingga pelaksanaan budidaya terkesan
menjadi sangat subyektif bergantung kepada intuisi dan kejelian teknisi! ,alah
satu penyebab terjadinya kegagalan tersebut adalah serangan organisme
pathogen, penurunan kualitas air yang diikuti oleh keadaan kesehatan udang
memburuk (stress) (-aslihan, 1991)
.enis penyakit virus yang sering ditemukan di tambak seperti *onodon
,low /rowth ,yndrome (*,/,) adalah penyakit yang baru muncul yang
berdampak terhadap produksi P. monodon! "kuran penyakit ini menyebabkan
2
udang windu yang dipelihara di tambak mengalami kekerdilan dan ukurannya
tidak mencapai ukuran optimal yaitu laju pertumbuhan hariannya 0,00'0,11 g%hari
atau hanya mencapai berat 1$,8 g%ekor, jika dibandingkan dengan pertumbuhan
udang normal yang laju pertumbuhan hariannya 0,2 g%hari dengan berat badan
sekitar 2# g%ekor setelah # bulan pemeliharaan (3hayaburakul et al, 200#)!
,etelah pemeriksaan melalui 4olymerase 3hain 5eaction (435) pada udang
ditemukan beberapa jenis virus! Beberapa penyakit yang disebabkan oleh virus
yang umum ditemukan dalam budidaya udang windu di ndonesia diantaranya
adalah 1) *onodon Baculo 6irus (*B6) gejala utamanya menyerang organ
hepatopankreas dan usus bagian depan sehingga tidak berfungsi dengan baik,
2) nfectious 7ypodermal 7aematopoietic &ecrosis 6irus (77&6), dengan
gejala8 (a) udang berenang tidak normal, yaitu sangat perlahan'lahan (b) bila alat
geraknya (pleopod dan 4eriopod) berhenti bergerak, udang akan tenggelam di
bawah kolam9 (c) udang akan mati dalam waktu #'12 jam sejak mulai timbulnya
gejala tersebut! "dang penderita banyak yang mati pada saat moulting9 (d) pada
kondisi yang akut, kulitnya akan terlihat keputih'putihan dan tubuhnya berwarna
putih keruh9 (e) permukaan tubuhnya akan ditumbuhi oleh diatomae, bakteri atau
parasit jamur9 (f) pada kulit luar terlihat nekrosis pada kutikula, syaraf, antena,
dan pada mukosa usus depan dan tengah! 4engendalian8 perbaikan kualitas air!
:) 7epatopancreatic 4arvo'like 6irus (746), /ejala8 terutama menyerang
hepatopankreas, sehingga dalam pemeriksaan hepatopankreasnya secara
mikroskopik terlihat degenerasi dan adanya inklusion bodies dalam se'sel organ
tersebut ()nonim, 2009)!
+eberadaan virus *,/, pada benih udang windu akan membawa dampak
yang besar pada produksi budidaya udang windu di tambak! ,alah satu tindakan
pencegahan penyebaran virus di tambak adalah penyebaran benih bebas virus!
"saha yang dapat dilakukan untuk benih bebas virus adalah dengan tindakan
3
deteksi dini virus tersebut! ,alah satu metode deteksi yang cepat dengan akurat
adalah multipleks 435 (*'435)! *ultipleks 435 adalah varian dari 435 dimana
dua atau lebih lokus yang bersamaan diamplifikasi dalam reaksi yang sama
(;ightner, 1999)!
<ari latar belakang tersebut sehingga digunakan metode pengujian dengan
multipleks 435 yang saat ini paling banyak digunakan untuk mendeteksi virus'
virus tersebut!
Tujuan dan kegunaan
4enelitian ini bertujuan untuk mendeteksi jenis'jenis dan prevalensi virus
yang berasosiasi dengan penyakit kerdil pada pembenihan udang windu di
+abupaten Barru, ,ulawesi ,elatan dengan menggunakan multipleks 435, dan
melihat kondisi histologi benih udang
7asil penelitian ini diharapkan dapat menjadi bahan informasi bagi
pengelola dan pengembangan budidaya perikanan khususnya untuk kepentingan
penanganan penyakit yang timbul pada budidaya udang windu!
II.TINJAUAN PUSTAKA
4
Sistematika dan Mr!lgi
+lasifikasi "dang windu (Penaeus monodon), (,unaryanto dan 4udjianto,
1980) 8
+elas 8 3rustacea
,ub +elas 8 *alacostraca
,uper =rdo 8 >ucarida
=rdo 8 <ecapoda
,ub =rdo 8 &atantia
?amili 8 4enaeidae
/enus 8 Penaeus
,pesies 8 Penaeus monodon
-ubuh udang secara morfologi dapat dibedakan dalam dua bagian yaitu
bagian depan (anterior) dan bagian belakang (posterior). Bagian depan disebut
bagian kepala dan bagian dada yang menyatu (cephalotrax)! Bagian perut
(abdomen) terdapat ekor pada bagian belakangnya, semua bagian badan
beserta anggotanya terdiri dari ruas'ruas (segmen)! +epala'dada terdiri dari 1:
ruas yaitu kepala terdiri 1 ruas dan dadanya 8 ruas, sedangkan bagian perut
terdiri dari $ ruas! ,eluruh tubuh tertutup oleh kerangka luar yang disebut
eksoskeleton yang terbuat dari bahan kitin! Bagian kepala'dada tertutup oleh
sebuah kelopak kepala (karapaks). <ibagian bawah pangkal cucuk kepala
terdapat mata majemuk yang bertangkai dan dapat digerak'gerakan! *ulut
terdapat dibagian bawah kepala diantara mandibula serta terdapat insang disisi
kanan kiri kepala yang tertutup oleh kelopak kepala (,unaryanto dan 4udjianto,
1980)!
5
,iklus hidup udang windu melalui beberapa stadia pertumbuhan mulai
dari telur, nauplius, @oea, mysis, pascalarva, juvenile sampai udang dewasa
(,usilowati, 1990)! +elangsungan hidup merupakan komponen utama yang perlu
diperhatikan dalam usaha budidaya! +elangsungan hidup udang ditentukan oleh
dua faktor utama yaitu sifat genetik dari udang itu sendiri sebagai faktor internal
dan faktor lingkungan dimana udang itu hidup sebagai faktor eksternal! >ffendie
(1990) menyatakan bahwa pertumbuhan dan kelangsungan hidup dipengaruhi
oleh dua faktor, yaitu faktor dalam seperti keturunan, seks dan umur serta faktor
luar diantaranya lingkungan perairan, makanan, penyakit dan parasit!
Pen"akit danTim#uln"a Pen"akit $ada Udang %indu
Beberapa permasalahan yang timbul dalam usaha budidaya udang windu
adalah serangan penyakit! 4enyakit umumnya timbul akibat adanya interaksi
antara udang sebagai inang, organisme patogen penyebab penyakit dan
lingkungan tempat pemeliharaan (tambak)! 4ada kondisi alamiah, umumnya
udang tidak mengalami gangguaan penyakit! )kan tetapi sistem budidaya yang
mengakibatkan perubahan lingkungan atau sistem pemeliharaan yang melebihi
daya dukung lingkungan, akan mengganggu keseimbangan antara ketiga faktor
tersebut sehingga timbul masalah penyakit (5ukyani, 2000)!
-imbulnya penyakit berhubungan erat dengan keadaan lingkungan!
=rganisme penyebab penyakit seperti parasit, jamur dan virus akan cepat
menimbulkan penyakit, karena lingkungan yang kurang baik! 7al ini sejalan
dengan pernyataan -ashlihan (1988) bahwa penyakit timbul apabila keadaan
lingkungan yang tidak stabil, misalnya salinitas yang tiba'tiba menurun secara
drastis akibat turun hujan, temperatur telalu tinggi, kadar oksigen terlalu rendah
sehingga udang mengalami stress ;ightner (199#)! *enurut -ancung (2001),
6
penyakit udang dapat disebabkan oleh berbagai jenis penyebab penyakit seperti
proto@oa, bakteri, cendawan dan virus! <itambahkan oleh -aslihan (1991),
penyakit pada organisme diklasifikasikan menjadi dua bentuk yaitu (1) 4enyakit
infeksi%parasit, apabila penyakit disebabkan oleh organisme seperti virus, jamur,
proto@oa dan cacing9 (2) 4enyakit noninfeksi%nonparasiter, apabila penyakit
bukan disebabkan oleh organisme tetapi dapat disebabkan berupa parameter
lingkungan, defisiensi nutrisi, keracunan dan faktor genetis!
Pen"akit &irus
MB& 'Mndn Ba(ul &irus)
.enis virus *B6 merupakan jenis virus yang umum ditemukan dalam
budidaya udang pada sekitar tahun 1990, dan dikenal sebagai penyebab
penyakit kematian udang umur 1 bulan (one month dead syndrome)! )kibat
serangan virus, banyak tambak yang gagal panen dan mengalami kematian
premature! )gensia penyebab 8 *onodon Baculo 6irus (*B6) merupakan virus
keluarga baculovirus ,yaitu virus bentuk batang berbahan genetik <&) untai
ganda (ds<&), double strand deoAyribonucleic acid)! 6irus ini dalam inti sel
inang yang terinfeksi membentuk occlusion body! +oloni virion dengan matriks
berupa protein sebagai perekat membentuk kristal seperti bola dalam inti sel
hepatopankreas udang yang terinfeks! +ristal virus seperti ini disebut sebagai
occlusion body! nti sel yang terinfeksi virus umumnya membesar
(hypertrophied), berisi beberapa kristal virus yang berbentuk bulat! .aringan yang
terinfeksi virus selanjutnya akan segera mengalami kerusakan ()nonim, 2000)!
HP& 'He$at*$an(reati( Par++irus)
4enyakit 746 disebabkan oleh <&) yang mengandung parvovirus
berukuran kecil dengan diameter 22'2# nm (;ightner, 1991)! 4enyakit ini
7
terutama menyerang organ hepato'pankreas udang, tetapi kadang'kadang juga
menyerang organ insang dan usus! ,esuai hasil pengamatan di lapangan
tampak bahwa bila serangan sudah cukup tinggi, tubuh udang menjadi berwarna
pucat dan hepatopankreas berwarna coklat! Bahkan kotoran yang dikeluarkan
udang menjadi berwarna putih! 7al ini terkait kerusakan dan pembusukan serta
disfungsi hepatopankreas sebagai pusat metabolisme tubuh! +emudian
pertumbuhan menjadi lambat dan bahkan mengalami kematian!
;ightner (1991) menyatakan bahwa gejala serangan 746 ini tidak
spesifik, tetapi pada beberapa kasus tampak bahwa hepatopankreas berwarna
keputihan dan atropi, pertumbuhan lambat, anoreAia, gerakan lambat, cenderung
naik ke permukaan, dan insang dihinggapi organisme'organisme komensalisme,
dan infeksi kedua oleh organisme'organisme patogen opurtunistik seperti 6ibrio
spp! =leh karena 746 jarang teramati sendirian dalam serangan penyakit yang
mematikan, kematian akibat 746 sulit ditentukan (;ightner, 1991)! ,erangan
746 dengan agenagen penyakit lainnya ini menyebabkan kematian tinggi pada
tahap juvenis, dan dalam # minggu dapat mencapai 10'100B!
IHHN& 'In!e(tius H"$dermal Hemat$ieti( Ne(rsis &irus)
.enis virus lain yang menginfeksi udang dan mengakibatkan kerugian
adalah 77&6 (nfectious 7ypodermal and 7ematopoietic &ecrosis 6irus)!
"dang yang terinfeksi virus ini tumbuh kerdil! <alam satu tambak dengan ukuran
udang kerdil dengan porsi lebih dari :0B kemungkinan disebabkan oleh 77&6!
*ultiinfeksi virus juga dapat terjadi pada satu tubuh udang, misalnya kombinasi
dengan C,,6 dan *B6 (*onodon Baculo 6irus)!
6irus 77&6 merupakan virus dengan bahan asam nukleat untai tunggal
(ss<&)) dari kelas parvovirus, yang dicirikan dengan adanya benda inklusi,
inclussion body yaitu merupakan koloni virus dengan tanpa adanya matrik! nti
8
sel yang terinfeksi virus biasanya membesar dibandingkan dengan normal!
<iagnosis dilakukan dengan prosedur histopatologis, jaringan hepatopankreas
menggunakan larutan fiksatif <avidson! <iagnosis positif dengan ditemukannya
benda inklusi (koloni virus tanpa matriks) dalam inti sel yang terinfeksi!
,erangan penyakit dapat mengakibatkan kematian masal hingga
mencapai 100B dalam waktu yang sangat singkat yaitu hanya 2 hari sejak gejala
pertama tampak! "dang yang terserang biasanya berenang ke tepi dekat
pematang, lemah, kehilangan nafsu makan dan akhirnya mati! )gensia
penyebab8 4enyebab penyakit virus ini adalah termasuk virus berbahan genetik
<&), non'occluded virus, dan virion berbentuk batang! 4enularan penyakit yang
sangat cepat, menyebabkan sulitnya penanggulangan penyakit! =rganisme
penular (karier) dapat berupa rebon (mysid shrimp), udang putih, kepiting,
wideng, udang windu sendiri yang menularkan penyakit secara hori@ontal!
4enularan secara vertikal dapat terjadi melalui induk menular ke ;arva ()nonim,
2000)!
Multi$leks P,-
*ultipleks 435 adalah suatu metode deteksi secara simultan beberapa
agen penyakit secara molecular dalam stau kit yang sama, sehingga deteksi
secara cepat dan tepat dapat dilakukan !
Polymerase Chain Reaction (435) adalah suatu metode en@imatik in vitro
yang digunakan untuk menghasilkan gugus <&) yang spesifik dalam jumlah
besar dan dalam waktu yang singkat melalui tahapan' tahapan denaturation,
annealing dan eAtension pada temperatur yang berbeda!D ,ejak pertama kali di
perkenalkan pada tahun 1981, teknologi 435 telah menghasilkan terobosan'
terobosan besar dalarn penelitian dan pengembangan kesehatan di bidang
kedokteran dan kedokteran gigi untuk memahami berbagai patogenesis maupun
9
diagnosis penyakit! <iagnosis maupun patogenesis penyakit yang berkaitan
dengan faktor genetik kini mulai bisa terungkap dengan teknik ini seperti
abnormalitas ataupun mutasi gen (;ightner, 199#)!
-eknologi ini berkembang dari konsep replikasi <&), dimana gugus <&)
yang spesifik diperbanyak dengan menggunakan en@im <&) polymerase!: 4ada
reaksi ini, sesudah proses denaturasi, dua oligonukleotida yang berfungsi
sebagai primer akan menempel (annealing) pada ke dua pita <&) dan
selanjutnya akan di amplifikasi! Bila siklus ini terus berulang, maka terjadi
perbanyakan dari gugus <&) spesifik yang menjadi target analisis dalam waktu
yang singkat! ,elain <&), 5&) juga dapat menjadi target untuk diperbanyak
dengan teknologi ini yaitu dengan 5-'435!# <engan teknik ini 5&) dirubah
kedalam bentuk <&) dengan bantuan en@im reverse transcriptation dan
selanjutnya diamplifikasi dalam jumlah yang dikehendaki!
Km$nen P,-
,elain <&) template yang akan digandakan dan en@im <&) polymerase,
komponen lain yang dibutuhkan adalah8
Primer
4rimer adalah sepasang <&) utas tunggal atau oligonukleotida pendek
yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau
polimerisasi <&)! 435 hanya mampu menggandakan <&) pada daerah
tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa
sampai #0000 bp! 4rimer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen
dengan <&) template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu
yang kita inginkan!
10
dNTP ' deoxynucleoside triphosphate )
d&-4 alias building blocks sebagai Ebatu bataF penyusun <&) yang baru!
d&-4 terdiri atas # macam sesuai dengan basa penyusun <&), yaitu d)-4,
d3-4, d/-4 dan d--4!
Bu!!er
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan'bahan kimia untuk
mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan en@im <&)
polymerase!
In Lgam
on logam bivalen, umumnya *g
GG
, fungsinya sebagai kofaktor bagi en@im
<&) polymerase! -anpa ion ini en@im <&) polymerase tidak dapat
bekerja!
on logam monovalen, kalsium (+
G
)!
Ta*a$an -eaksi
,etiap siklus reaksi 435 terdiri atas tiga tahap, yaitu8
Pra.denaturasi
<ilakukan selama 1'9 menit diawal reaksi untuk memastikan
kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi <&) 4olymerase (jenis hot'start
alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu)!
11
Denaturasi
<enaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 9$H3 selama :0'$0
detik! 4ada suhu ini <&) utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal!
Annealing
,etelah <&) menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran #0'$0H3
selama 20'#0 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel
pada <&) template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer!
Ekstensi/elngasi
<ilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum en@im
<&) polymerase, biasanya 00'02H3! 4ada tahap ini <&) polymerase akan
memasangkan d&-4 yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template
adalah ), maka akan dipasang d&-4, begitu seterusnya (ingat pasangan )
adalah -, dan 3 dengan /, begitu pula sebaliknya)! >n@im akan memperpanjang
rantai baru ini hingga ke ujung! ;amanya waktu ekstensi bergantung pada
panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk
setiap 1000 bp!
,elain ketiga proses tersebut biasanya 435 didahului dan diakhiri oleh tahapan
berikut8
0inal Elngasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum en@im (00'02H3) selama 1'11
menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah
diperpanjang secara sempurna! 4roses ini dilakukan setelah siklus 435 terakhir
435 dilakukan dengan menggunakan mesin -hermal 3ycler yang dapat
menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus
435! 4ada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk
12
melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari
satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan! -api syukurlah sekarang mesin
-hermal 3ycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan!
III. MET1DE PENELITIAN
%aktu dan Tem$at Penelitian
4enelitian ini dilaksanakan pada bulan =ktober 2010 sampai bulan
.anuari 2011! 4engambilan sampel dilakukan pada pembenihan di +abupaten
Barru, kemudian dianalisis *ultipleks 435 dan 7istopatologi di ;aboratorium
4arasit dan 4enyakit kan, .urusan 4erikanan "&7),!
Alat dan Ba*an
13
Alat
)dapun alat I alat yang digunakan selama penelitian adalah sebagai berikut 9
-able 1! )lat ' alat yang digunakan pada penelitian serta kegunaannya
No. alat Fungsi
1 micropipet
Untuk memindakan secara akurat suatu
larutan!cairan dalam "olume kecil.
2
sentri#ugator
Untuk memutar sampel dalam kecepatan
tinggi.
3
$lat elektro#oresis
Untuk memisakan segmen %N$
&erdasarkan aliran listrik.
4
"orte' mi'er
Untuk mencampur larutan dalam proses
ekstraksi %N$.
5
(ater&at )it saker
Untuk inku&asi sesuai temperature *ang
diinginkan.
6 +a&ung eppendor# Untuk mengekstrak %N$.
7 +a&ung koleksi Untuk mengumpulkan asil ekstrak %N$.
8 +ermalc*cler Untuk mengapli#ikasi segmen %N$.
9 U, iluminator Untuk mem"isualisasi "irus *ang terdeteksi.
10 %eck glass Untuk mengalas -aringan.
11 +a&ung ./0 Untuk ./0
12
1ikrotom Untuk memotong -aringan.
13
1ikroskop Untuk mengamati -aringan.
Ba*an
)dapun bahan yang digunakan selama penelitian adalah sebagai berikut 9
-abel 2! Bahan'bahan yang digunakan pada penelitian serta kegunaannya
Nama Ba*an Kegunaan
-abung 435 435!
4rimer 435%,ekuensing <&)!
*aster *iA 5eagen 435!
)garosa >lektroforesis <&)!
-abung >ppendort 5eaksi!
-ip mikroliter 4engambilan sampel!
J)amp <&) *ini +it >kstraksi <&)!
Benur "dang 4emeriksaan dan +oleksi virus!
14
>thidium Bromida 6isualisasi produk 435!
*arka <&) +arakterisasi <&)
-)> 1K >lektroforesis <&)!
)lcohol 10B,00B,80B,90B, 100B
,ebagai bahan pada proses
washing,dehidrasi,dan rehidrasi!
4araffin
,ebagai bahan impregnasi dan
embedding!
;arutan <avidson ,ebagai larutan fiksasi!
)Luadest ,ebagai bahan pengencer!
>ntellan ,ebagai bahan perekat!
>osin
,ebagai bahan pewarna
jaringan!
7aematoAylin
,ebagai bahan pewarna
jaringan!
Kylol ,ebagai bahan penetrasi!
Prsedur Kerja
Pengum$ulan Sam$el
"dang sampel adalah benih udang windu yang siap ditebar atau dijual ke
petani tambak dari beberapa pembenihan di +abupaten Barru! .umlah sampel
yang diambil sebanyak :00 ekor dari : pembenihan ),B, dan 3 di +abupaten
Barru! +emudian sampel yang diambil yaitu benih udang stadia 4ost ;arva 12'
1#! ,elanjutnya sampel dibawa ke laboratorium kemudian dilakukan pengacakan
secara bertingkat yaitu :00 ekor dibagi ke dalam : sub sampel masing'masing
100 ekor dan dari 100 ekor kemudian diambil : ekor secara acak untuk dilakukan
ekstraksi!
15
Ekstraksi DNA
<eteksi keberadaan virus *B6, 77&6, dan 746 dilakukan dengan
terlebih dahulu melakukan ekstraksi <&) dari udang dan selanjutnya dilakukan
amplifikasi <&) dengan menggunakan teknik 435! >kstraksi <&) dilakukan
dengan terlebih dahulu melakukan homogensi seluruh tubuh udang sampai
halus! ,elanjutnya ekstraksi dilakukan dengan menggunakan kit komersial
(Liagen)! 4rosedur ekstraksi <&) mengikuti petunjuk seperti yang tertulis dalam
petunjuk pabrikan!
4rosedur >kstraksi <&) adalah sebagai berikut 8
>kstraksi <&) dilakukan dengan menggunakan J)amp <&) *ini +it
(10) menggunakan protokol untuk tissues dengan mengikuti petunjuk pabrikan
dengan beberapa modifikasi! ,ecara berurutan ekstraksi <&) dilakukan dengan
prosedur sebagai berikut 8
1! "dang yang telah difiksasi pada alkohol 91 B dibersihkan beberapa kali,
sehingga tidak ada jaringan lain yang terikut kecuali hanya jaringan dari
udang!
2! )mbil : buah tabung eppendorf 1,1 m; dan tambahkan larutan )-;
sebanyak 180 M;!
:! ;etakkan sampel dalam 1 buah tabung eppendorf 1,1 m; tersebut
#! ,elanjutnya ditambahkan larutan proteinase + sebanyak 20 M; kedalam
tabung, lakukan vorteks dan selanjutnya lakukan sentrifus cepat!
1! -abung kemudian diinkubasi pada suhu 1$
o
3 selama semalam atau : jam
tergantung jenis jaringan!
16
$! ,etelah inkubasi lakukan sentrifus cepat sehingga seluruh cairan yang
melengket pada dinding tabung akan menuju ke dasar tabung! Buang
supernatan!
0! -ambahkan larutan 200 M; air buffer )l, vorteA selama 11 detik, lalu inkubasi
pada 00
o
3 selama 10 menit! ;akukan sentrifus cepat dan buang supernatant
8! ,elanjutnya tambahkan 200 M; ethanol 99,9 B (ethanol absolut)
9! ;arutan dari tabung eppendorf selanjutnya dipindahkan pada J)amp mini
spim kolom (dalam 2 M; tabung koleksi), pada saat memindahkan larutan
agar tidak menyentuh dinding tabung! -utup penutup tabung dan sentrifus
pada 8000 rpm selama 1 menit, letakkan J)amp kolom pada tabung koleksi
yang baru dan buang tabung koleksi yang sudah mengandung filtrate!
10! -ambahkan 100 M; buffer )C1 tanpa menyentuh dinding tabung, tutup
penutup, lalu sentrifus 8000 rpm selama 1 menit, letakkan kembali kolom
pada tabung koleksi yang baru dan buang tabung koloeksi yang
mengandung filtrate!
11! -ambahkan 100 M; buffer )C 2 pada kolom tanpa menyentuh pinggir
tabung, tutup lalu sentrifus pada 1#000 rpm selama : menit
12! Buang filtrate lalu tempatkan kembali column pada tabung koleksi yang
sama, lalu sentifus kembali pada 1#00 rpm selama 1 menit!
1:! ,elanjutnya J)amp column diletakkan pada tabung eppendorf 1,1 m; dan
ditambahkan buffer )> sebanyak 100 M;, inkubasi pada suhu kamar selama
1 menit, sentrifus pada 8000 rpm selama 1 menit
17
1#! ;angkah 1: diulangi dengan menambahkan lagi larutan buffer )> sebanyak
100 M; pada tabung yang sama, lalu diinkubasi selama 1 menit dan
selanjutnya disentrifus pada 8000 rpm selama 1 menit! -otal larutan <&)
yang diperoleh adalah 200 M;!
11! ,impan hasil ekstrak <&) pada suhu '20
o
3 sebelum digunakan!
Am$li!ikasi DNA &irus
)mplifikasi <&) dengan teknik *'435 dilakukan dengan komposisi dan kondisi
435 sebagai berikut8
Km$sisi P,-
1aster mi' 1225
.rimer
028 3 43
psg5
+emplate %N$ 220
1ili6 322
/oral 7and 225
8umla 25 9l
Primer S$esi!ik (+hawsak, et. al!, 2008)
4rimer ,pesifik 6irus *B6 Naitu 4rimer yang berukuran :01 bp
dengan urutan nukleotida
1F
-)33)-))/3-)/3)-)3/33
/////3)3))/-3-3)3))/
:F
4rimer ,pesifik 6irus 77&6 yaitu 4rimer yang berukuran :02 bp
<engan urutan nukleotida
1F
)---3-33))/33--3-3)33
-/)-/-))/-))--33-3-3-/-
:F
4rimer ,pesifik 6irus 746 yaitu 4rimer yang berukuran $19 bp
<engan urutan nukleotida
1F
3)-)3)-3/-3---3--3-33
//3-3)-3/-3---3--3-33
:F
kndisi P,-
.roses :uu 7ama
.redenaturasi 94 / 10;
18
%enaturasi 94 / 30;
$nnealing 56 / 30;;
<'tension 72 / 1;
Final <'tension 72 / 5;
:iklus 1./0 35 siklus
Elektr!resis Hasil P,-
Persia$an gel agarse. )garose ditimbang sesuai dengan keperluan,
kemudian dilarutkan dalam larutan -)> 1 K! <alam penelitian ini konsentrasi
agarose yang digunakan adalah 1,1B! <engan menggunakan pemanas
(hotplate) agarose dilarutkan sampai mendidih dan setelah mendidih dibiarkan
selama kurang lebih 21 menit sampai suhunya sekitar 10
o
3, kemudian dicetak
dalam tray agarose yang telah dilengkapi dengan sisir untuk membentuk sumur'
sumur gel! ,etelah agarose dingin, dengan sangat hati'hati sisir tray diangkat
kemudian gel dimasukkan kedalam elektroforesis apparatus yang telah diisi
dengan -)> 1 K sebagai buffer elektroforesis!
-unning elektr!resis! "ntuk mengetahui apakah suatu sampel
terinfeksi dengan 77&6,746 atau *B6, maka hasil 435 sebanyak 10 M; di'
running dalam gel elektroforesis bersama'sama dengan <&) marker 100bp!
,etelah semua hasil 435 diinjeksikan ke dalam sumur'sumur gel elektroforesis,
selanjutnya elektroforesis dijalankan dengan kondisi 100 volt, selama #1 menit!
&isualisasi DNA
/el hasil elektroforesis direndam dalam larutan ethidium bromida
(konsentrasi 1 mg%m;) selama 10 I 11 menit! ,elanjutnya gel dicuci dengan
akuadest selama 1 I 10 menit! "ntuk mengetahui ada tidaknya infeksi 746,
77&6 dan *B6 terhadap sampel'sampel yang dideteksi maka gel hasil
elektroforesis diamati menggunakan uv transilluminator yang sekaligus dilakukan
pengambilan gambar!
19
Hist$at*lg"
4rosedur kerja histologi udang windu adalah sebagai berikut8
1! *emfiksasi jaringan yang terinfeksi pada ;arutan <avidson selama #8 jam
2! *elakukan washing pada )lkohol 00B selama 11 menit
:! *elakukan dehidrasi pada )lkohol 00B, 80B, 90B, dan 100B masing'
masing selama 1 jam
#! *elakukan 3learing dengan menggunakan Kylol selama 2A:0 menit
1! *enyimpan jaringan pada paraffin murni selama (2A1 jam)
$! *emasukkan paraffin di dalam jaringan (>mbedding)
0! 3utting
8! 4ewarnaan menggunakan metode *ayers'Bennet
a) *enghilangkan paraffin dengan perendaman pada Kylol dan Kylol
masing'masing selama 1 menit
b) 4enghilangan Kylol
<isimpan pada )lkohol 100B selama 2A1 menit
<isimpan pada )lkohol 90B selama 2A1 menit
<isimpan pada )lkohol 80B selama 2A1 menit
<isimpan pada )lkohol 00B selama 2A1 menit <isimpan pada )lkohol
10B selama 1A1 menit
*embilas dengan )Luadest sebanyak $A bilasan
c) *erendam 4reparat pada ;arutan 7aematoAylin selama 1 menit
d) *embilas pada air mengalir selama #'1 menit
e) +emudian di celupkan pada ;arutan selama 2': menit
20
f) *elakukan dehidrasi dengan )lkohol 90B (2A1 menit) dan )lkohol 100B
(2A1 menit)
g) *erendam pada Kylol selama 1 menit
Kylol selama 1 menit
Kylol selam 1 menit
Kylol selama 1 menit
Kylol 6 selama 1 menit
9! *emberi entellan kemudian dicover
10! *elakukan pengamatan histopathology menggunakan mikroskop!
Parameter Penelitian
Pre+alensi &irus
4engukuran prevalensi 77&6,*B6,dan 746 menggunakan rumus
?ernando et al (1902) sebagai berikut8
<imana 8
4rev 8 4ersentase udang yang terserang virus (B)
& 8 .umlah sampel udang yang terinfeksi virus (ekor)
n 8 .umlah sampel yang diamati (ekor)
Hist$atlgi
21
7istopatologi udang yang terinfeksi virus diketahui dari kondisi histology
seperti hypertropeid nukleat, inclusion body, respon eosinofilik atau basofilik
jaringan (;ightner,199$)
Analisis Data
<ata penelitian mengenai prevalensi virus yang berasosiasi dengan
penyakit kerdil dan kondisi histopatologis dianalisis secara deskriptif dengan
bantuan gambar!
I&. HASIL DAN PEMBAHASAN
2. Am$li!ikasi DNA
Berdasarkan hasil pengamatan di ;aboratorium 4arasit dan 4enyakit kan
.urusan 4erikanan "&7), yang dilakukan pengujian dengan teknik multipleks
435 (Polymerase chain reaction) terhadap sampel benih udang windu dari lokasi
22
pembenihan di +abupaten Barru, diperoleh hasil bahwa benih udang windu
terinfeksi oleh virus *B6 dan 77&6 sedangkan virus 746 tidak ditemukan!
Berikut gambar visualisasi <&) sampel yang terinfeksi virus tersebut!
3am#ar 2. Elektr!regram Hasil P,- Beni* Udang %indu Ka#u$aten
Barru M4Marker.Lane 2.5 MB& dan Lane 2.6 IHHN&).
Berdasarkan gambar di atas diketahui bahwa pita <&) yang tampak
berada pada kisaran yang sesuai dengan pita <&) 6irus *B6 pada ukuran :02
bp,dan 6irus 77&6 yaitu pada ukuran :01 bp sedangkan virus 746 tidak
ditemukan! 7al tersebut membuktikan bahwa pengujian terhadap infeksi virus
penyebab penyakit kerdil dengan multipleks 435 dari beberapa lokasi
pembenihan di +abupaten Barru dapat dilakukan! 6irus 746 tidak ditemukan
karena kemungkinan disebabkan kondisi 435 yang belum optimal dan
kombinasi ketiga pasang primer tidak cocok,sehingga diperlukan upaya untuk
optimasi!
4enyakit akibat virus *B6 disebabkan oleh Baculovirus tipe ) yang
mengandung <&) stranded ganda sebagai tipe asam nukleatnya (;ightner,
199$)! ,erangan penyakit *B6 terjadi pada semua stadia udang, tetapi
timbulnya penyakit ini paling sering pada stadia juvenil dan dewasa (<ana dan
100
100
500
305
&p
302
23
7adiroseyani, 1989)! *eskipun begitu benih udang di hatchery juga tidak luput
dari serangan virus ini! 7al tersebut sesuai dengan hasil pengujian multipleks
435 dari sampel benih yang positif terinfeksi virus *B6! ,edangkan virus
77&6 termasuk virus berbahan genetik <&), non'occluded virus, dan virion
berbentuk batang! 4enularan penyakit yang sangat cepat, menyebabkan sulitnya
penanggulangan penyakit!
=rganisme penular (karier) dapat berupa rebon (mysid shrimp), udang
putih, kepiting, wideng, udang windu sendiri yang menularkan penyakit secara
hori@ontal! 4enularan secara vertikal dapat terjadi melalui induk menular ke ;arva
()nonim, 2000)!
7. Pre+alensi +irus
4revalensi virus *,/, pada benih udang windu di kab! Barru dapat
dilihat pada table berikut!
Ta#el 8. Pre+alensi &irus MB&9 IHHN&9 dan HP& Pada Beni* Udang %indu
di Ka#u$aten Barru
Pembenih
an
JMLH
SAMPE
L
+ MBV
PREVALE
NSI MBV
+
IHHNV
PREVALE
NSI IHHNV
+ HPV
PREVALE
NSI
HPV
$ 3 3 100= 3 100= 0 0=
> 3 3 100= 0 0= 0 0 =
/ 3 2 66266= 1 33233= 0 0=
% 3 1 33233= 0 0 = 0 0 =
Rata-rata 74= 33= 0=
Berdasarkan tabel di atas menunjukkan tempat pembenihan di
+abupaten Barru terjangkit virus *B6 dan 77&6 sedangkan virus 746 tidak
ditemukan! -ingkat prevalensi di lokasi ini virus *B6 menunjukkan sangat tinggi
dengan rata'rata yaitu 0#B,hal ini disebabkan Baculovirus tipe ) yang
mengandung <&) stranded ganda sebagai tipe asam nukleatnya sehingga
multiplikasi <&) nya lebih banyak (;ightner, 199$)! ,erangan penyakit *B6
terjadi pada semua stadia udang, tetapi timbulnya penyakit ini paling sering pada
stadia juvenil dan dewasa (<ana dan 7adiroseyani, 1989)!
24
77&6 dengan rata'rata prevalensi yaitu ::B! 6irus 77&6 memiliki
pengaruh bervariasi lebih banyak mengakibatkan berat badan yang rendah pada
udang windu dan perubahan bentuk tubuh atau deformasi pada udang dewasa!
)pabila virus 77&6 ditemukan pada benih udang selama stadia post larva,
kemungkinan deformasi tubuh udang lebih cepat terjadi dan memberikan
dampak bobot tubuh dewasa yang tidak normal! 4engaruh infeksi virus ini
bervariasi, misalnya pada udang P.vannamei dan P. monodon yang terinfeksi
virus ini tidak menyebabkan kematian (+arunasagar 2009), sehingga
penggunaan 435 dapat dilakukan untuk mendeteksi penyakit tersebut (;ightner
et al! 199#)! ,edangkan prevalensi virus 746 dengan rata'rata 0B,hal ini
disebabkan karena kondisi 435 yang belum optimal dan kombinasi ketiga
pasang primer tidak cocok sehingga dianalisis diperlukan upaya untuk optimasi!
&amun demikian, keberadaan virus *B6 dan 77&6 pada benih "dang Cindu
dapat mengancam prosuksi udang windu di tambak!
8. Hist$atlgi
Berdasarkan pengamatan histopatologi yang dilakukan terhadap sampel
benih udang windu di panti'panti benih +abupaten Barru, didapatkan sebuah
gambar mikroskopis yang sesuai dengan ciri bentuk infeksi virus *B6 dan
77&6!! /ambar dapat dilihat di bawah ini!
25
3am#ar 7.Kndisi Jaringan Udang %indu 'P.monodon) "ang terserang
+irus. 2. MB& dan 7. IHHN& ':;;< H=E)
<ari hasil pengamatan histologi hepatonkreas memperlihatkan adanya
virus dalam jaringan tersebut yang ditandai dengan adanya inclusion bodi atau
area'area yang kosong dimana sel'sel virus pernah ada akan tetapi telah
ditinggalkan oleh virus! 7al ini sesuai dengan pendapat Bower, (199$)9
+asarnchandra et al (1998) yang menyatakan bahwa pada udang yang positif
terinfeksi *B6, inti sel akan mengalami pembesaran (hipertropi) sehingga berisi
benda'benda inklusi dan mengalami penyusutan kromatin! 7ipertropoid intra
nuklear yang dilihat pada jaringan sel menjadi berbeda dari stadia sejak infeksi
virus ini! +ondisi hepatopankreas yang mengalami hipertropi nuclei ditandai
dengan adanya inclusion bodi atau banyaknya area'area yang kosong yang telah
ditinggalkan oleh virus! 7al ini menunjukkan bahwa perkembangan virus ini
sangat cepat! *B6 membentuk badan oklusi (=cclusion body) yang berbentuk
elips dan berwarna merah jambu (eosinofilik) dengan pewarnaan 7ematoAylin'
>osin (7O>)! +epekatan warna dan diameter badan oklusi tersebut bervariasi
tergantung tahap perkembangan infeksi!
1
2
26
6irus yang ditemukan pada histology ini yaitu virus 77&6, selain
hipertropi yang lebih besar melebar dari normal,terlihat pula ada tubulusnya
mengalami degenerasi dan nekrosis (penyusutan dan penghancuran)! &ekrosis
merupakan pengurangan dalam ukuran sel! 7al ini sesuai dengan pendapat
-akashima dan 7ibiya (1991) yang menyatakan bahwa perubahan patologi pada
pankreas menyangkut atrophy dan nekrosis! ,elain itu juga terlihatbentuk
kolumnernya yang mengalami penghancuran! "dang windu yang terjangkit virus
ini juga akan mengalami penurunan nafsu makan dimana keadaan seperti ini
akan mengakibatkan hepatopankreas tidak berfungsi normal!
,edangkan virus 746 tidak ditemukan karena penyakit 746 disebabkan
oleh <&) yang mengandung parvovirus berukuran kecil dengan diameter 22'2#
nm (;ightner, 199$)! 4enyakit ini terutama menyerang organ hepato'pankreas
udang, tetapi kadang'kadang juga menyerang organ insang dan usus! ,esuai
hasil pengamatan di lapangan tampak bahwa bila serangan sudah cukup tinggi,
tubuh udang menjadi berwarna pucat dan hepatopankreas berwarna coklat
;ightner (199$)!
&! KESIMPULAN DAN SA-AN
KESIMPULAN
27
Berdasarkan hasil penelitian, maka dapat disimpulkan sebagai berikut8
1! Benih "dang Cindu +abupaten Barru terinfeksi *B6 dan 77&6 melalui
deteksi multipleks 435!
2! 4revalensi *B6 dan 77&6 melalui multipleks 435 pada benih "dang Cindu
di +abupaten Barru masing'masing dengan rata'rata 0#B *B6,::B
77&6,dan 0B 746!
:! +ondisi 7istopatologi benih "dang Cindu yang terserang *B6 dan 77&6
memperlihatkan adanya 7yperthopi &ulei dan nclusion Body!
SA-AN
*engingat virus *B6,77&6, dan 746 dapat ditularkan secara vertikal
(dari induk) dan horisontal (kontak antar larva), sehingga perlu kajian lanjutan
tentang asal mula keberadaan *B6,77&6, dan 746 yang menginfeksi udang di
tempat pembenihan.
DA0TA- PUSTAKA
)hmad! 1988! 4eubah Penting Mutu ir tambak !dang dalam seminar "udidaya
!dang intensif! 4atra utama 7! 5! < dan 4etro "tama -eknik, .akarta!
28
)nonim, 199$! #istem Resirkulasi pada $ambak !dang, *ajalah 4rimadona
4erikanan, >disi =ktober 199$, .akarta!
)nonim,2010!4enerapan435!7ttp8%%www!dkp!go!id%upload%.uknisB204enerapan
B20BestB20*anagementB204racticesB20 PB*4P!pdf , pada tanggal
28 &ovember 2010, pukul 08!00 wita di *akassar!
)nonim,2010! *engenal 435!7ttp8%%sciencebiotech!net%mengenal'pcr'
polymerase'chain'reaction% , pada tanggal 28 &ovember 2010, pukul
08!00 wita di *akassar!
)nonim, 2010! 7ama dan penyakit! http8%%agromaret!com%artikel pada tanggal 28
&ovember 2010, pukul 08!00 wita di *akassar!
Bower, ,!*! 199$! ,ynopsis of infectious disease add parasities of commercially
eAploited baculovirus in eAperimentally infected wild shrimp, crab and
lobsters by in situ hybridi@ation! )Luaculture 1$$8 1'10
3hayaburakul, +!, &ash, /!, 4ratanpipat, 4!, ,riurairatana, ,!,
Cithyachumnarnkul, B!, 200#! *ultiple pathogens found in growth'
retarded black tiger shrimp Penaeus monodon cultivated in -hailand! <is!
)Luat! =rg! $08 89I9$!
>ffendi, ! 1990! Metode "iologi Perikanan! Nayasan <ewi ,ri! Bogor! 1$: hal
+hawsak, 4!, <eesukon, C!, 3haivisutangkura, 4!, and ,ukhumsirichart, C!
2008! *ultipleks 5-'435 )ssay to ,imultaneous detection of siA viruses
of penaeid shrimp! *olecular and celluler probes! 228100'18:
;ightner! 199#. Racun dan Penyakit dalam $eknologi Pembenihan !dang!
>ditor.!*! ?oA 3entral .aya nterprise development project dan 4-!
.egera )mindo ,arana! .akarta!
;ightner, <!6! 199$! ) 7andbook of ,hrimp 4athology and <iagnostic
4rocedures for <iseases of 3ultured 4enaeid ,hrimp! Baton 5ouge, ;)8
Corld )Luaculture ,ociety!
;ightner, <! 6! 1999! -he 4enaeid ,hrimps 6iruses -,6, 77&6, C,,6, and
N76 8 3urrent status in the )mericas, )vailable <iagnostic *ethods, and
*anagement ,trategies! n the &utrition ?ish 7ealt! >ditor 8 3hhorn ;im,
3arl <! Cebster! ?ood 4roduction 4ress! &ew Nork I ;ondon I =Aford!
5antetondok, )! 198$! %ama dan Penyakit &kan! ;embaga penerbitan
"niversitas 7asanuddin! "jung 4andang
29
5ohmana, <! 1991! +erentanan Benih "dang Cindu (penaeus monodon) ,tadia
4; 10 )sal 3ilacap .awa -engah terhadap nfeksi 6irus *B6! ,kripsi ,1
?akultas 4erikanan nstitut 4ertanian Bogor! Bogor!
5ukyani, )!, 2000! Penanggulangan Penyakit udang 'indu! *akalah ,eminar
,ehari 4enanggulangan 4enyakit "dang Cuidu <itambak! Balitkandita!
*aros!
,usilowati, -! 1990! +etidaksamaan Caktu 4anen *ember 4eluang bagi
-umbuh Berkembangnya 7ama dan 4enyakit pada "dang -ambak! Balai
4enelitian 4erikanan ;aut! ,ub Balitdita! Bojonegara! ,erang!
,unaryanto, ),!, )! *ariam dan 4udjianto! 1980! Penyakit !dang! .aringan
nformasi 4erikanan ndonesia! <irektoral .endral 4erikanan <epartemen
4ertanian! .akarta!
-ancung, B! 2001. Pengembangan "udidaya !dang (indu "erbasis $eknologi.
<inas 4erikanan dan +elautan bekerja sama dengan 7asanuddin
"niversity 4ress! *akassar!
-aslihan, )! 1991! Penyakit !dang dan Cara Pengendaliannya. Balai Budidaya
)ir 4ayau! .epara!