PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN

PADA SEL EUKARIOT

Ayu Permata Ratu, MSi
Sekolah Tinggi Farmasi Muhammadiyah
Sistem Prokariot & Eukariot
Sistem Ekspresi prokariot umumnya lebih sering
digunakan untuk memproduksi protein rekombinan
daripada eukariot.
Protein eukariot yang disintesis di dalam bakteri sering
kali tidak stabil atau aktivitas biologinya rendah atau
tidak ada. (ada beberapa dr prokariot tk mengalami
perubahan gugus gula,deglikosilasi)
Bakteri yang memproduksi toksin dapat
mengkontaminasi produk akhir walau telah dilakukan
purifikasi = bahaya bagi manusia atau
hewan.(menempel pd produk akhir)
Untuk menghindari hal tersebut, menggunakan sistem
ekspresi eukariot untuk memproduksi protein
terapeutik
Sistem Prokariot & Eukariot
Di dalam eukariot ada bbrp modifikasi yang
dapat terjadi pada tingkat posttranslasi,
setelah sintesis protein selesai:
Formasi ikatan disulfida yang benar.
Pemotongan proteolitik pada bentuk awal
Glikosilasi (penmbahan gugus gula)
Penambahan asam amino dalam protein

Sistem Ekspresi Yeast
Ekspresi protein rekombinan pada S. cerevisiae telah
banyak berhasil dilakukan. Tetapi walaupun beberapa
hasil tinggi, ekspresi umumnya rendah.
Disebabkan:
Selama scale up, plasmid kehilangan jumlah
frekuensinya, walau telah diinduksi dengan adanya
promotor
Protein rekombinan biasanya terjadi
hyperglikosilasi, mengandung lebih dari 100 residu
mannosa di setiap rantai samping N-linked
oligosaccharide.
Kebanyakan trial, protein dirancang untuk
disekresikan ke ruang periplasma.(diantara dinding
sel dan setelah sitoplasma)
Protein Pharmaceuticals
Penggunaan utama teknologi DNA rekombinan adalah
memproduksi protein .
Pengembangan utama teknologi DNA rekombinan,
sebagian besar protein farmasetik manusia tersedia
dalam jumlah terbatas.
Produk Komersial Rekayasa Mikroba
Human Protein Pharmaceuticals
Jumlah sangat terbatas
Produksinya mahal
Biological mode of action belum dikarakteristik
jelas

300 macam protein terapeutik manusia yang
potensial telah diklon, dan telah melalui
berbagai uji selama bertahun-tahun sebelum
tersedia secara komersial

Pharmaceutical Biotechnology
Diseases Drug
Diabetes Insulin
Haemophilia Factor VIII
Stroke Tissue Plasminogen activator
Growth Failure Human Growth hormon
Anaemia Erythropoietin
Viral infection Interferon
Sistem Ekspresi Protein



bakteri




Yeast Mammalia
Insect
Sistem Ekspresi Protein pada Sel Eukariot


Saccharomyces cerevisiae
Pichia pastoris
Baculovirus-insect
Mammalian cels

Optimizing Gene Expression

- sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda
- jika menggunakan prokariot sebagai sel inang
akan menurunkan biaya
- namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis
bentuk fungsional protein heterogous masih
tetap??
Optimizing Gene Expression

Harus dipilih berdasarkan kriteria :
-memproduksi protein heterologus yang mirip dengan
mature authentic protein
-mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi
-mudah dipurifikasi
Contoh : human interleukin 3
Produksi paling baik di Bacillus licheniformis (mampu
menerima vektor secara alami)
meskipun produksi banyak di E. coli, tapi menghasilkan
protein interleukin-3 yang salah.
Sistem Prokariot VS Eukariot
Jumlah protein Jumlah protein
Medium sederhana Medium kompleks
Pertumbuhan Pertumbuhan
Modifikasi pasca-translasi (-) Modifikasi pasa-translasi (+)
Ukuran protein Ukuran protein
Konformasi protein sederhana Konformasi protein kompleks
Prokariot VS Eukariot
Terdapat organel bermembran yang memiliki fungsi spesific
(RE,AG)
Protein targeting in Eukaryot

Aparatus golgi ada penambahan gugus gula
= N-glycolylneuraminic acid
= Galactose
= N-acetylglucosamine
= Mannose
= Fucose
= N-acetylneuraminic acid
= Xylose
Glikosilasi pada protein berkaitan dengan:
Pelipatan protein : struktur tersier
Aktivitas biologis
Stabilitas
Waktu paruh in vivo
Kloning pada Yeast
Menggunakan vektor shuttle
Kloning awal dilakukan di Escherichia coli :
Penyiapan DNA sisipan dan DNA plasmid
Ligasi dan transformasi
Konfirmasi kebenaran klon
Purifikasi plasmid rekombinan
Transformasi ke dalam sel yeast
Vektor Shuttle
Vektor shuttle : vektor yang dapat melakukan
replikasi dalam lebih dari satu organisme (co/
E. coli dan S. cerevisiae).

Vektor Shuttle
Ori bakteri dan Yeast
Resisten AB (bakteri)
Marka seleksi
G418,zeocin
resistance
Gene for production
of URA, HIS, TRP,
LEU, ADE
Marka Seleksi
Gen resistensi terhadap inhibitor :
methotrexat dan tembaga.
Gen pengkode biosintesis asam amino :
Gen LUE2 : mengkode -isopropil-malat
dehidrogenase yang mengkatalisis perubahan
asam piruvat menjadi leusin.
Gen TRP1 : terlibat dalam biosintesis triptofan
Gen URA3 : mengkode orotidin-5-fosfat
dekarboksilase (enzim yang mengkatalisis 1 tahap
biosintesis nukleotida pirimidin).
Advantages for P. pastoris
Grow to extremely high cell densities
Intracelullar or secreted
Pichia secretes low levels of native protein
Easier purification!
High product yields
Example : Sea Raven anti-freeze protein
40 mg/L (secreted)
Example : Hepatitis B Virus surface antigen
Yield : 400 mg/L (intra celluar)
Pertimbangan Pemilihan Sistem
Ekspresi (Inang)
Ukuran protein ((disesuaikan dengn selnya)
Terjad proses modifikasi ato tdk
Glikoprotein atau protein (glikosilasi
menentukan aktivitas atau tidak)
Ada tidaknya ikatan disulfida
26
FUNGSI RE : Sintesis Protein
RE adl tempat sintesis protein yg ditujukan untuk disimpan
dlm organel bermembran lain atau dieksport ke luar sel
Protein di buat di REK dengan signal hidrofobik
Urutan signal penting untuk protein mencapai targetnya di
RE
Intermediate diantara translasi dan pengikatan adalah
kompleks ribonucleoprotein yg disebut signal recognition
particle (SRP)
Setelah urutan signal diputus, tetapi masih terjadi translasi
protein, terdapat empat kemungkinan modifikasi yang
terjadi pd protein
27
28
Apa yg akan terjadi pd protein setelah
translokasi ke dlm RE?
Glikosilasi protein(dilakuan oleh enzim2 RE)
mol. Karbohidrat (gula) diikatkan ke asam
amino dr protein
Dilakukan oleh enzim yg ada di terletak di RE
Mol. Gula selanjutnya dimodifikasi di Golgi
Sebagian besar protein yg ditranslokasi ke RE
mengalami glikosilasi, beberapa protein
sitosol juga di glikosilasi
Fungsi glikosilasi (?) :
inhibitor glikosilasi memp. sedikit efek pd fungsi protein
meningkatkan resistensi thd protease (protease utk memotong,krn udh da penambahan gula jd gbs diganggu protease,stabil

beberapa interaksi protein-protein tergantung pd glikosilasi
Struktur Apparatus Golgi
1. Aparatus golgi terdiri dari setumpuk kantong pipih yang dikelilingi membran
yang strukturnya sama dengan membran sel
2. Kantong-kantong pipih ini dinamakan sisterna.
3. Terdapat hampir di semua sel eukariotik dan banyak dijumpai pada organ
tubuhyang melaksanakan fungsi ekskresi, misalnya ginjal.
4. Setiap sel hewan memiliki 10 - 20 A. Golgi dan ratusa badan golgi pada
tumbuhan.
5. Disekitar sisterna terdapat vesikel-vesikel dengan berbagai ukuran,
diantaranya berfusi dengan bagian tepi sisterna.
6. Aparatus golgi biasanya berasosiasi dengan RE kasar yang terpisah oleh jarak
yang sempit.
Sisi Aparatus golgi yang menghadap ke RE kasar disebut cis(daerah
pembentukan vesikel).Muka cis berfungsi sebagai penerima vesikula transpor dari
RE
sisi yang berlawanan dengan RE kasar disebut trans(daerah pemasakan
vesikel). muka trans berfungsi mengirim vesikula transpor. Vesikula transpor adalah
bentuk transfer dari protein yang disintesis RE. Apabila protein ini tidak dikeluarkan
oleh badan golgi, maka akan disimpan di dalam sel sebagai lisosom.
Aparatus golgi terdiri dari tiga komponen :
1. Cisternae
Merupakan bangunan dasar.yang menjadi ciri apparatus golgi Terdiri Dari
sekitar 5 lempeng cisterna yang sejajar melengkung bentuk piala tiap cisterna
berupa kantung gepeng tertekuk.Bagian tepi tiap cisterna biasanya
menggembung dan berlobang-lobang .dibagian tepi itu ada pembuluh yang
menghubungkan semua cisternae sesamanya.daerah tepi itu juga memiliki
tonjolan-tonjolan yang akan cepat membentuk vasikula-vasikula atau mungkin
juga bakal membentuk cisterna baru

2. Vesikula
Bagian vesikula terdapat dibawah (sebelah kedalam sel) bagian cisternae yang
terdiri dari banyak gelembung serta memiliki warna yang terang.vesikula
tumbuh dari reticulum endoplasma. Mungkin dekat kebagian cisternae vesikula
tergabung membentuk cisterna baru.

3. Vakuola
Bagian ini berada dibagian atas (sebelah puncak) yang terdiri dari
banyak gelembung.vakuola berisi bahan sekresi (getahan) cisterna bagian
atas akan pecah dan membentuk vakuola
Ada tiga macam protein yang dihasilkan oleh
Golgi, antara lain:
1) Protein membran inti, membran plasma
dan protein membran organel
2) Protein sekretori yang disimpan dalam
bentuk vesikel
3) Protein enzim yang disimpan dalam
vesikel (lisosom)
Fungsi Aparatus Golgi Antara Lain:
1.Glikosilasi
2.Menyiapkan sekter untuk sekresi sel
3.Reparasi membaran sel
4.Pembentukan senyawa penyusun dinding sel
Cisterna
After initial glycosylation and quality-control in the
RER lumen, most proteins pass into the Golgi body.
The Golgi has stacked cisternae, which, unlike the
RER, are not contiguous. Each cisterna plays a
specific role:
cis Golgi network (CGN)
cis cisterna
medial cisterna
trans cisterna
trans Golgi network (TGN)