Anda di halaman 1dari 9

1

TITRASI FORMAL ASAM AMINO


Kadek Anggra Suprapta
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha
Email: Dekanggra5@gmail.com
Abstract
This experiment aims to determine the amount of amino acid nitrogen found in the sample
solution and to make the relationship between the volume of NaOH curve versus time curve mg
of nitrogen and amino acids for hours at a formal titration of amino acids.The method used in
this practicum is a quantitative method, namely by using titration. The results obtained from this
practicum is to menghidrolisis Trypsin protein, protein hydrolysis more time, the more the
volume of NaOH required in the titration, and the longer time of hydrolysis, the more nitrogen
mass was formed. It can be concluded that the pregnancy Trypsin protease that can
menghidrolisis and time of hydrolysis is directly proportional to the volume of NaOH used and
the mass of nitrogen is formed in the titration.
Keywords: protein, amino acids, formal titration.
1. PENDAHULUAN
Protein merupakan senyawa organik
kompleks berbobot molekul tinggi yang
merupakan polimer dari monomer-monomer
asam amino yang dihubungkan satu sama lain
dengan ikatan peptida. Molekul protein
mengandung karbon, hidrogen, oksigen,
nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor.
Suatu molekul protein disusun oleh sejumlah
asam amino tertentu dengan susunan yang
sudah tertentu pula dan bersifat turunan
(Aisjah Girindra dalam Tika, 2010).
Asam amino merupakan ion dipolar yang
pada umumnya mempunyai dua atau lebih
pKa. Asam amino yang menyusun suatu
protein tertentu, kadar asam aminonya tidak
sama. Asam amino tidak larut di dalam eter
karena merupakan senyawa dipolar dan dalam
air menunjukkan struktur kutub ganda
(Zwitter ion). Gugus amino diprotonasi dan
hadir sebagai ion ammonium, sedangkan
gugus karboksil kehilangan protonnya dan
hadir sebagai anion karboksilat. Struktur ini
konsisten dengan sifat asam amino yang
seperti garam, yang memiliki titik leleh agak
tinggi. Disamping itu asam amino bersifat
amfoterik yang artinya berperilaku sebagai
asam dan mendonasikan proton pada basa
kuat atau dapat juga berperilaku sebagai basa
dan menerima proton dari asam kuat.
Gambar 1. Struktur dipolar asam amino
Bila suatu protein dihidrolisis, akan
didapatkan asam aminonya. Hidrolisis protein
dapat dilakukan dengan menggunakan enzim
protease dari tripsin. Protein jika dihidrolisis
akan menghasilkan asam amino bebas. Asam
amino bebas ini bila direaksikan dengan
formaldehid berlebih akan membentuk derivat
metilol. Reaksi ini menyebabkan asam amino
bebas bentuk isoelektrik kehilangan satu
proton dari gugus NH
3
+
(Tika, 2010). Ion H
+
yang dilepaskan pada reaksi ini dapat dititrasi
langsung dengan NaOH sampai dengan pH
8,0 (titik akhir indikator ekuivalen). Titrasi
asam amino atau campuran asam amino dalam
keberadaan formaldehid disebut dengan titrasi
formal asam amino. Titrasi ini merupakan
NH
2
CH COOH R
NH
3
+
CH COO

R
2
metode analisis untuk mengikuti pembentukan
asam amino bebas yang dihasilkan pada
proses hidrolisis protein oleh enzim proteotik
(Tika, 2010).
H3N
+
CHRCOO
-
H
2
NCHRCOO
-
+ H
+
H
2
NCHRCOO
-
+ 2HCHO (HOCH
2
)
2
NCHRCOO
-
Gambar 2. Persamaan reaksi asam amino dengan formaldehida
Ion H
+
yang dilepas pada reaksi di atas
dapat dititrasi langsung dengan NaOH sampai
pH = 8,0 (titik akhir indikator fenolftalein).
Titrasi asam amino atau campuran asam
amino dalam keberadaan formaldehid disebut
dengan titrasi formal asam amino. Titrasi ini
merupakan metode analisis untuk mengikuti
pembentukan asam amino bebas yang
dihasilkan pada proses hidrolisis protein oleh
enzim proteotik.
Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi
dari asam amino yang diperoleh dari hasil
hidrolisis protein dengan menggunakan enzim
protease. Selama hidrolisis suatu protein,
sejumlah gugus karboksil dan gugus amino
bertambah terus. Penentuan secara kuantitatif
salah stau gugus akan dapat memberikan
indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis
protein. Menurut teori zwiiterion, kalau suatu
asam amino dalam larutan dititrasi dengan
basa, berarti ion hydrogen dari ammonium
yang dititrasi. Gugus ammonium dari asam
amino yang bersifat buffer pada daerah pH
tinggi atau di atas pH 11, sehingga tidak
mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal yang
sama juga terjadi pada gugus karboksil yang
bersifat buffer pada pH rendah sehingga tidak
mungkin juga dititrasi dengan basa (Tika,
2010).
Untuk mengatasi hal tersebut, maka
formaldehid ditambahkan ke dalam larutan
asam amino agar bereaksi dengan gugus
amino yang tidak bermuatan sehingga
memungkinkan gugus ammonium membuffer
pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat
dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif
menggunakan indicator (Tika, 2010). Reaksi
yang terjadi selama titrasi formal asam amino
adalah:
C R COO
-
H
NH
3
+
+
C
O
H H
C R COOH
H
N H CH
2
OH
C
O
H H
C R COOH
H
N HOH
2
C CH
2
OH
dimethilol
Gambar 3. Reaksi asam amino dengan formalin
3
C R COOH
H
N HOH
2
C CH
2
OH
+ NaOH
C R COO
-
Na
+
H
N HOH
2
C CH
2
OH
+ H
2
O
Gambar 4. Reaksi dhimetilol dengan NaOH pada saat titrasi.
Penambahan formalin ke dalam larutan
asam amino akan membentuk dimetilol.
Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus
amino dari protein sudah terikat dan tidak
akan mempengaruhi titik akhit titrasi sehingga
titik akhir titrasi dapat ditentukan dengan
tepat. Indikator yang digunakan adalah
fenolptalein (Tika, 2010).
2. METODE PENELITIAN
Pada praktikum titrasi formal asam amino
yang dilakukan pada tanggal 7 Maret 2014 di
Laboratorium Kimia Organik Universitas
Pendidikan Ganesha diawali dengan tahap
persiapan yaitu menyiapkan alat dan bahan.
Adapun alat yang digunakan adalah sebagai
berikut: 3 buah gelas kimia 100 mL, 3 buah
labu erlenmeyer 100 mL, 1 set buret dan
statif, 1 buah spatula, 1 buah batang
pengaduk, 1 buah labu ukur 100 mL, 1 buah
kaca arloji, 1 buah termometer, 1 buah
pemanas listrik, dan 2 buah pipet tetes.
Sedangkan bahan yang digunakan terdiri dari
larutan gelatin 5%, larutan NaOH 0,2 M,
larutan HCl 0,1 M, indikator fenolftalein 1%,
larutan formaldehida 40%, larutan tripsin 1 %,
dan akuades.
Prosedur kerja dalam praktikum ini adalah
sebagai berikut:
Disiapkan 100 mL gelatin, dengan
melarutkan sebanyak 5,0056 gram padatan
gelatin ke dalam akuades sampai volume 100
mL. Setelah itu, ditambahkan 1 mL larutan PP
ke dalam larutan gelatin kemudian
ditambahkan dengan larutan NaOH 0,2 M
tetes demi tetes hingga timbul warna merah
muda. Kemudian ditambahkan tetes demi
tetes larutan HCl 0,1 M sampai warna
merahnya hilang. Selanjutnya larutan tersebut
direndam dalam incubator air pada suhu 38
o
C.
Pada tabung lain, 25 mL larutan Tripsin
ditambahkan dengan beberapa tetes
fenolftalein dan tetes demi tetes larutan NaOH
0,2 M sampai timbul warna merah muda.
Setelah itu, ditambahkan tetes demi tetes
larutan HCl 0,1 M ke dalam larutan tersebut
sampai warna merahnya hilang. Kemudian
larutan ini diinkubasi dalam incubator air pada
suhu 38
o
C selama beberapa menit.
Selanjutnya, ditambahkan larutan tripsin ke
dalam larutan gelatin dan aduk perlahan.
Setelah tercampur merata, diambil 10 mL
campuran dan dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer 100 mL (larutan ini digunakan
sebagai kontrol atau waktu nol). Dilakukan
pendidihkan untuk merusak enzim kemudian
didinginkan. Kemudian ditambahkan 15 mL
formalin netral dan 3 tetes fenolftalein
kemudian titrasi dengan NaOH 0,02 M. Pada
interval waktu 15, 30, 45. Pembuatan Larutan
Gelatin
Larutan gelatin 5% dibuat sebanyak 500
mL dibuat dengan melarutkan 25 gram serbuk
gelatin dengan akuades sampai volume 500
mL. Larutan gelatin ini digunakan oleh satu
kelas yang terdiri dari 12 kelompok. Larutan
gelatin diambil sebanyak 100 mL kemudian
ditambahkan 1 mL fenolftalein dan NaOH 0,2
M tetes demi tetes hingga timbul warna merah
muda. Larutan gelatin yang berwarna merah
muda ditambahkan tetes demi tetes larutan
HCl 0,1 mL sampai warna merah mudanya
hilang. Larutan kemudian direndam pada
inkubator air dengan suhu 38
o
C.
Pembuatan Larutan Tripsin
Larutan tripsin sebanyak 25 mL
ditambahkan dengan 1 mL larutan fenolftalein
dan tetes demi tetes larutan NaOH 0,2 M
sampai timbul warna merah muda. Larutan
tripsin yang berwarna merah muda
direaksikan dengan tetes demi tetes larutan
HCl 0,1 M sampai hilang warna merah
mudanya hilang. Larutan kemudian diinkubasi
4
dalam inkubator air pada suhu 38
o
C selama
beberapa menit.
Titrasi Formal Asam Amino
Larutan tripsin dan larutan gelatin yang
sudah dibuat, kemudian dicampurkan dan
diaduk perlahan. Setelah tercampur merata, 10
mL campuran diambil dan dimasukan ke
dalam Erlenmeyer 100 mL (larutan ini
digunakan sebagai kontrol atau waktu nol)
kemudian dididihkan untuk merusak enzim
kemudian didinginkan. Larutan yang sudah
dingin ditambahkan 15 mL formalin netral
dan 3 tetes fenolftalein kemudian dititrasi
menggunakan NaOH 0,02 M. Langkah di atas
diulang pada interval waktu 15, 30, 45, 60, 75,
90 menit dari waktu nol. Data yang didapat
digunakan untuk membuat kurva titrasi.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam percobaan ini, dilakukan titrasi
formal asam amino. Titrasi formal asam
amino merupakan titrasi asam amino atau
campuran asam amino dalam keberadaan
formaldehida. Asam amino yang digunakan
merupakan hasil degradasi dari gelatin
(polipeptida) yang didegradasi menggunakan
enzim protease yaitu tripsin. Adapun prinsip
dari percobaan ini mengikuti kenyataan
bahwa suatu protein mengikuti teori zwitter
ion, dimana suatu asam amino walaupun
memiliki dua sisi aktif (gugus COOH dan
gugus amina NH
2
), sehingga dapat dititrasi
menggunakan asam dan basa. Namun
kenyataannya, gugus ammonium dari asam
amino merupakan buffer pada pH tinggi (di
atas pH 11) sehingga tidak mungkin untuk
mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator.
Hal ini mengingat dimana suatu indikator
pada umumnya memiliki trayek pH sedapat
mungkin mendekati pH 7 karena titrasi asam
basa merupakan suatu reaksi penetralan.
Dalam percobaan ini, reagen yang digunakan
adalah larutan gelatin. Gelatin merupakan
polipeptida (protein) yang larut dalam air, hal
ini terbukti dengan mudah larutnya gelatin
ketika ditambahkan ke dalam akuades. Gelatin
merupakan gelting agent (bahan pembuat gel),
sehingga perlu diinkubasi pada suhu 38
o
C.
Bila suhu inkubasi diatas 38
o
C, maka
kemungkinan akan terbentuk gel yang akan
mempengaruhi proses degradasi untuk
menghasilkan asam amino.
Sebelum dilakukan proses titrasi
dalam percobaan ini terlebih dahulu dilakukan
proses pembuatan larutan gelatin dengan cara
melarutkan padatan gelatin ke dalam akuades.
Setelah dilarutkan dan diaduk terbentuk
larutan gelatin yang berwarna kuning. Larutan
gelatin ini kemudian ditambahkan indikator
fenolftalein sebanyak 1 mL dan ditambahkan
larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sehingga
larutan gelatin berwarna jingga kemerahan.
Adapun tujuan penambahan NaOH adalah
agar larutan bersifat sedikit basa. Larutan
yang berwarna jingga kemerahan ini
kemudian ditambahkan larutan HCl 0,1 M
tetes demi tetes. Penambahan larutan HCl
menyebabkan warna larutan kembali
berwarna kuning. Penambahan larutan HCl
bertujuan agar pH menjadi 8 dimana pada pH
ini enzim tripsin akan mampu bekerja secara
optimal. Setelah warna jingga kemerahan ini
hilang akibat penetesan dengan HCl maka
dilakukan uji pH dengan kertas indikator
universal, untuk memastikan pH larutan sudah
8.
Gambar 5.
(a) (b) (c)
(a) Larutan Gelatin; (b) Larutan Gelatin + Fenolftalein + NaOH; (c) Larutan gelatina
+ Fenolftalein + NaOH + HCl
5
Hal yang sama juga dilakukan terhadap
larutan tripsin. Larutan tripsin ditambahkan
dengan indikator fenolftalein dengan tujuan
untuk mengetahui perubahan pH yang terjadi
pada sistem larutan. Larutan kemudian
ditambahkan NaOH yang bersifat basa.
Penambahan NaOH ini mengakibatkan warna
larutan berubah menjadi merah muda pada pH
8 ke atas. Selanjutnya ditambahkan HCl untuk
mengkondisikan pH larutan berada pada pH 8.
Kondisi larutan berada pada pH 8 dilakukan
dengan menggunakan kertas indikator
universal. Pengkondisian ini bertujuan agar
enzim protease dapat bekerja secara optimal.
Larutan kemudian diinkubasi pada suhu 38
0
C
agar enzim protease dapat bekerja secara
optimal.
Gambar 6.
Setelah itu, larutan gelatin dan tripsin ini
diinkubasi dengan incubator air pada suhu
38
o
C, suhu ini dijaga supaya tidak melebihi
suhu 38
o
C karena dapat menyebabkan enzim
rusak yang ditandai dengan pembentukan gel
yang sangat mempengaruhi proses degradasi
menghasilkan asam amino. Setelah diinkubasi
selama beberapa menit, kedua larutan ini
kemudian dicampur. Dari pencampuran ini
terbentuk larutan berwarna kuning kecoklatan.
Tujuan pencamuran ini adalah untuk
mengdegradasi larutan gelatin dengan
menggunakan enzim tripsin. Tripsin
merupakan enzim proteolitik yang hanya
terdiri dari suatu rantai polipeptida. Enzim ini
akan mendegradasi gelatin menghasilkan
asam amino penyusunnya. Ketika dicampur
menghasilkan warna kuning pada larutan.
Penambahan larutan tripsin mampu
menghidrolisis protein khususnya gelatin.
Penghidrolisisan ini disebabkan oleh enzim
protease yang terkandung dalam tripsin yang
mampu memotong ikatan peptida pada sisi C
dari gelatin yang menghasilkan asam amino
bebas sehingga dapat dititrasi. Hasil dari
hidrolisis ini menghasilkan glisin (26-34%),
prolin (10-18%), hidroksiprolin (7-15%),
alanin (8-11%), arginin (8-9%), asam aspartat
(6-7%), dan asam glutamat (10-12%) serta
sedikit mengandung asam amino isoleusin,
treonin, metionin, sistein, dan sistin. Setelah
tercampur merata, 10 mL campuran diambil
dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL
(larutan ini digunakan sebagai kontrol atau
waktu nol) kemudian dididihkan. Pendidihan
ini bertujuan untuk merusak enzim protease
sehingga proses hidrolisis tidak terjadi lagi
kemudian didinginkan. Larutan yang telah
didinginkan kemudian ditambahkan dengan
15 mL formalin netral dan 3 tetes fenolftalein.
Penambahan fenolftalein ini sebagai indikator
perubahan pH yang terjadi pada sistem larutan
yang ditandai dengan perubahan warna
sehingga dapat diketahui titik akhir titrasi.
Penambahan formalin ini bertujuan untuk
mereaksikan asam amino bebas yang
dihasilkan dari hidrolisis enzim protease yang
membentuk derivat metilol. Reaksi ini
menyebabkan asam amino bebas pada bentuk
isoelektriknya kehilangan satu proton dari
gugus NH
3
+
sesuai dengan reaksi berikut
.
(a) (b) (c)
(a) larutan tripsin; (b) larutan tripsin + PP + NaOH; (c) larutan tripsin + PP + NaOH
+ HCl
6
C R COO
-
H
NH
3
+
+
C
O
H H
C R COOH
H
N H CH
2
OH
C
O
H H
C R COOH
H
N HOH
2
C CH
2
OH
dimethilol
C R COOH
H
N HOH
2
C CH
2
OH
+ NaOH
C R COO
-
Na
+
H
N HOH
2
C CH
2
OH
+ H
2
O
Gambar 7. Persamaan reaksi pada proses titrasi formal asam amino
Berdasarkan hasil eksperimen, volume
NaOH yang diperlukan pada saat titrasi
formal asam amino ini pada menit ke- 0, 15,
30, 45 adalah sebagai berikut:
Tabel 1. Volume NaOH yang diperlukan dalam titrasi formal asam amino
Menit Ke Volume NaOH (mL)
0 16,53
15 17,50
30 18,56
45 19,46
Berdasarkan data yang terdapat pada
tabel tersebut dapat dibuat kurva titrasi antara
volume NaOH (ordinat) terhadap waktu
(absis) sebagai berikut.
7
Gambar 8. Kurva Hubungan Volume NaOH (mL) Terhadap Waktu
Garis Linier Volume NaOH
Volume NaOH (mL)
Berdasarkan kurva di atas, dapat
diketahui bahwa semakin lama larutan
didiamkan, maka semakin banyak volume
NaOH yang digunakan untuk proses titrasi.
Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis
gelatin oleh tripsin menghasilkan sejumlah
asam amino yang konsentrasinya bertambah
seiring dengan bertambahnya kontak antara
larutan gelatin dengan larutan tripsin. Enzim
tripsin yang semakin lama menghidrolisis
gelatin menyebabkan gugus karboksil dan
gugus amino yang dihasilkan semakin banyak.
Dengan bertambahnya gugus ini, maka jumlah
NaOH yang digunakan pada saat titrasi juga
bertambah.
Selanjutnya adalah penentuan massa N
yang ditentukan melalui hasil titrasi pada
setiap menit dimana 1 mL larutan NaOH 0,1
N ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam
amino (Redhana, 2010). Karena konsentrasi
NaOH yang digunakan adalah 0,02 M yang
sama dengan 0,02 N (karena N = n . M) maka:
0, 1 N = 1,4 mg nitrogen
0,02 N = x mg nitrogen
x =
mg
N
N
4 , 1
1 , 0
02 , 0

x = 0,28 mg
Jadi 1 mL larutan NaOH ekivalen dengan
0,28 mg nitrogen sehingga massa nitrogen
dalam setiap jeda waktu dapat ditentukan.
Pada menit ke-0, massa nitrogen yang
dihasilkan dapat dihitung dengan cara sebagai
berikut.
=
1
0,28
=
16,53
1
0,28
= 4,6284
Dengan perhitungan yang sama dapat
dihitung pula untuk menit ke-15, 30, 45, 60,
75 dan 90. Data mg asam amino untuk tiap
volume NaOH dapat dilihat pada tabel
berikut.
y = 0.065x + 16.53
R = 0.999
16
16.5
17
17.5
18
18.5
19
19.5
20
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
V
o
l
u
m
e

N
a
O
H
Waktu
Kurva Hubungan Volume Naoh Terhadap Waktu
8
Tabel 2. Asam Amino (mg) Untuk Tiap Volume NaOH
Waktu (menit) Volume NaOH (mL) Nitrogen Asam Amino (mg)
0 16,53 4,63
15 17,50 4,90
30 18,56 5,19
45 19,46 5,45
Berdasarkan data diatas, maka dapat
dibuat kurva hubungan antara mg nitrogen
yang dihasilkan oleh asam amino terhadap
waktu yaitu sebagai berikut:
Gambar 9. Kurva Hubungan antara mg Asam Amino terhadap Waktu
Hubungan mg asam amino terhadap waktu
Linear (Hubungan mg asam amino terhadap waktu)
Berdasarkan kurva tersebut dapat dilihat
peningkatan jumlah mg asam amino seiring
dengan bertambahnya waktu kontak antara
larutan gelatin dengan larutan tripsin. Enzim
tripsin yang semakin lama menghidrolisis
gelatin menyebabkan gugus karboksil dan
gugus amino yang dihasilkan semakin banyak.
Dengan bertambahnya gugus ini, maka
nitrogen yang terdapat pada dimetilol juga
ikut bertambah.
4. SIMPULAN
Berdasarkan pembahasan di atas, maka
disimpulkan bahwa: (1) Jumlah mg asam
amino dapat ditentukan dengan
menghidrolisis Protein dengan enzim protease
dan melalui titrasi formal asam amino. (2)
Kurva hubungan antara volume NaOH
terhadap waktu dan kurva mg nitrogen asam
amino terhadap waktu pada titrasi formal
asam amino berbanding lurus dimana semakin
lama larutan didiamkan, maka semakin
banyak volume NaOH yang diperlukan untuk
mentitrasi larutan asam amino tersebut maka
semakin banyak pula mg nitrogen dari asam
amino yang dihasilkan.
5. UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai
y = 0.018x + 4.63
R = 0.999
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
5
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
M
a
s
s
a

n
i
t
r
o
g
e
n

a
s
a
m

a
m
i
n
o
Waktu
Kurva Hubungan antara mg Asam Amino terhadap Waktu
9
dosen pengampu mata kuliah Praktikum
Biokimia, Kadek Dewi Wirmandianthy, S.Pd
selaku asisten dosen, dan I Dewa Subamia
selaku laboran di Jurusan Pendidikan Kimia
atas masukan dan sarannya sehingga
percobaan ini dapat dilaksanakan dengan baik.
6. REFERENSI
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun praktikum
Biokimia. Singaraja: Universitas
Pendidikan Ganesha
Chairil Anwar, dkk. 1994. Pengantar
Praktikum Kimia Organik.
Yogyakarta: Departemen Pendidikan
dan Kebudayaan
Thenawijaya, Maggy. 1982. Dasar-Dasar
Biokimia jilid 1. Jakarta: Erlangga
Redhana. 2010. Penuntun Pratikum Biokimia.
Singaraja: Universitas Pendidikan
Ganesha
Nurcahyo, Heru. 2005. Regulasi Metabolisme
Protein. Yogyakarta :
Universitas Negeri Yogyakarta
Purba, Michael. 2004. Kimia Untuk SMA
Kelas XII. Jakarta : Erlangga
Redhana, I Wayan. 2004. Buku Ajar Biokimia
Jilid I. Singaraja : Institut Keguruan
dan Ilmu Pendidikan Negeri
Singaraja

Beri Nilai