Anda di halaman 1dari 34

ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI

I. TUJUAN
Agar mahasiswa dapat memahami langkah - langkah analisis obat didalam cairan
hayati.

II. DASAR TEORI
Farmakologi adalah ilmu yang mempelajari interaksi obat dengan makhluk
hidup. Berdasarkan interaksi tersebut, maka farmakologi dibagi menjadi dua yaitu
farmakodinamik dan farmakokinetik. Dalam farmakodinamik dipelajari mengenai
pengaruh (efek) obat terhadap makhluk hidup. Sedangkan farmakokinetika adalah ilmu
yang mempelajari tentang kinetika absorbsi, distribusi, metabolisme, dan eliminasi obat
dalam tubuh.
Farmakokinetik menentukan kecepatan mulai kerja obat, lama kerja dan
intensitas efek obat. Farmakokinetik sangat tergantung pada usia, seks, genetik, dan
kondisi kesehatan seseorang. Ada 4 fase dalam proses farmakokinetik:
1. Penyerapan (absorbsi) obat
Absorbsi ditentukan oleh bentuk sediaan, bahan pencampur obat, cara pemberian
obat. Absorbsi obat sudah dimulai sejak di mulut, kemudian lambung, usus halus,
dan usus besar. Tapi terjadi terutama di usus halus karena permukaannya yang
luas, dan lapisan dinding mukosanya lebih permeabel. Bioavailability artinya
jumlah dan kecepatan bahan obat aktif masuk ke dalam pembuluh darah, dan
terutama ditentukan oleh dosis dari obat
2. Distribusi obat
Distribusi artinya setelah obat masuk ke dalam sirkulasi darah, kemudian obat
diditribusikan ke dalama jaringan tubuh. Distribusi obat ini tergantung pada rata-
rata aliran darah pada organ target, massa dari organ target, dan karakteristik
dinding pemisah diantara darah dan jaringan. Di dalam darah obat berada dalam
bentuk bebas atau terikat dengan komponen darah albumin, gliko-protein dan
lipo-protein, sebelum mencapai organ target. Apabila obat telah terikat dengan
protein maka secara farmakologi obat tersebut tidak mempunyai efek terapetik
dan ditibusinya terbatas. Selain itu obat tidak dapat menembus membran sel
karena merupakan suatu komplek yang besar.
3. Metabolisme
Tempat utama metabolisme obat terjadi di hati, dan pada umumnya obat sudah
dalam bentuk tidak aktif jika sampai di hati, hanya beberapa obat tetap dalam
bentuk aktif sampai di hati. Obat-obatan di metabolisme dengan cara oksidasi,
reduksi, hidrolisis, hidrasi, konjugasi, kondensasi atau isomerisasi, yang tujuannya
supaya sisa obat mudah dibuang oleh tubuh lewat urin dan empedu. Kecepatan
metabolisme pada tiap orang berbeda tergantung faktor genetik, penyakit yang
menyertai(terutama penyakit hati dan gagal jantung), dan adanya interaksi
diantara obat-obatan. Dengan bertambahnya umur, kemampuan metabolisme hati
menurun sampai lebih dari 30% karena menurunnya volume dan aliran darah ke
hati.
4. Eksresi
Tempat utama terjadinya eksresi adalah di ginjal. Sedangkan sistem billier
membantu ekskresi untuk obat-obatan yang tidak diabsorbsi kembali dari sistem
pencernaan. Sedangkan kontribusi dari intestine (usus), ludah, keringat, air susu
ibu, dan lewat paru-paru kecil, kecuali untuk obat-obat anestesi yang dikeluarkan
waktu ekshalasi. Metabolisme oleh hati membuat obat lebih polar dan larut air
sehingga mudah di ekskresi oleh ginjal. Obat-obatan dengan berat lebih dari 300
g/mol yang termasuk grup polar dan lipophilic di ekskresikan lewat empedu.
Secara lebih jelasnya Farmakodinamik menggambarkan bagaimana obat
bekerja dan mempengaruhi tubuh, melibatkan reseptor, post-reseptor dan interaksi
kimia. Farmakokinetik dan farmakodinamik membantu menjelaskan hubungan antara
dosis dan efek dari obat. Respon farmakologis tergantung pada ikatan obat pada
target. Konsentrasi obat pada reseptor mempengaruhi efek obat. Farmakodinamik
dipengaruhi oleh perubahan fisiologis tubuh seperti proses penuaan, penyakit atau
adanya obat lain. Penyakit-penyakit yang mempengaruhi farmakodinamik contohnya
adalah mutasi genetik, tirotoksikosis (penyakit gondok), malnutrisi (salah gizi) dll.
Pada hakekatnya supaya bisa diserap oleh tubuh obat harus diubah menjadi
metabolit aktifnya. Biasanya obat-obat yang demikian disebut dengan Pro drug (Pra
obat). Prodrug bersifat labil, tidak mempunyai aktivitas farmakologis, tapi dalam
tubuh akan diubah menjadi aktif. Contoh : Bioavailabilitas parasetamol ditingkatkan
oleh ester propacetamol dan sumacetamol. Kemudian dengan atau tanpa
biotransformasi obat dieksresi dari dalam tubuh. Seluruh proses ini disebut proses
farmakokinetik dan berjalan serentak di dalam tubuh.
Darah merupakan tumpuan proses absorbsi, distribusi, dan eliminasi. Artinya
tanpa darah, obat tidak dapat menyebar ke lingkungan badan dan dikeluarkan dari
badan. Karena itu, logis bila adanya proses absorbsi dapat ditunjukkan dengan
peningkatan kadar obat dalam darah dan adanya proses distribusi serta eliminasi
ditunjukkan dnegan pengurangan kadar obat dalam darah. Dengan kata lain,
besarnya obat yang ada dalam darah mencerminkan besarnya kadar obat di tempat
absorbsi, distribusi, dan tempat eliminasi.
Penetapan kadar obat di dalam badan dapat dianalisis dari cairan hayati lain
seperti urin, saliva atau lainya. Namun, dalam praktik, uji dengan darah paling
banyak dilakukan. Di samping tempat dominan yang dilalui obat seperti yang
dijelaskan di atas, darah juga menjadi tempat yang paling cepat dicapai oleh obat.
Sedangkan urin merupakan cairan hayati yang biasanya digunakan dalam uji fase
farmakokinetik untuk mempelajari disposisi suatu obat dan menentukan kadar suatu
obat untuk obat-obatan yang dieksresikan lewat urin, minimal 10% nya terdapat
dalam urin dalam bentuk utuh yang belum dimetabolisme.
Hasil analisis dalam farmakokinetika dinyatakan dalam parameter
farmakokinetika. Parameter farmakokinetika didefinisikan sebagai besaran yang
diturunkan secara matematis dari hasil pengukuran kadar obat atau metabolitnya di
dalam cairan hayati (darah, urin,saliva dan lainnya). Parameter farmakokinetika obat
diperoleh berdasarkan hasil pengukuran kadar obat utuh dan metabolitnya.
Faktor-faktor penentu dalam proses farmakokinetika adalah :
a. Sistem kompartemen dalam cairan tubuh, seperti cairan intrasel, ekstrasel (plasma darah,
cairan interstitial, cairan cerebrospinal), dan berbagai fasa lipofil dalam tubuh.
b. Protein plasma, protein jaringan dan berbagai senyawa biologis yang mungkin dapat
mengikat obat.
c. Distribusi obat dalam berbagai system kompartemen biologis, terutama hubungan waktu
dan kadar obat dalam berbagai system tersebut, yang sangat menentukan kinetika obat.
d. Dosis sediaan obat, transport antar kompartemen seperti proses absorpsi, bioaktivasi,
biodegradasi dan ekskresi yang menentukan lama obat dalam tubuh
Terdapat tiga jenis parameter farmakokinetik yaitu parameter primer, sekunder,
dan turunan. Parameter farmakokinetik primer meliputi kecepatan absorbsi, Vd
(volume distribusi), Cl (klirens). Parameter farmakokinetik sekunder antara lain
adalah t
1
/
2
eliminasi (waktu paruh eliminasi), Ke (konstanta kecepatan eliminasi).
Sedangkan parameter farmakokinetik turunan harganya tergantung dari dosis dan
kecepatan pemberian obat Parameter farmakokinetik meliputi :
1. Parameter pokok
Tetapan kecepatan absorbsi (Ka)
Menggambarkan kecepatan absorbsi, yaitu masuknya obat ke dalam
sirkulasi sistemik dari absorbsinya (saluran cerna pada pemberian oral,
jaringan otot pada pemberian intramuskular).
Cl (Klirens)
Klirens adalah volume darah yang dibersihkan dari kandungan obat
persatuan waktu (Neal, 2006).
Volume distribusi (Vd)
Volume distribusi adalah volume yang menunjukkan distribusi obat (Neal,
2006).
2. Parameter Sekunder
Waktu paro eliminasi (t
1
/
2
)
Merupakan waktu yang dibutuhkan untuk mengubah jumlah obat
di dalam tubuh menjadi seperdua selama eliminasi (atau selama infus
yang konstan) (Katzung, 2001).
Tetapan kecepatan eliminasi ( Kel )
Kecepatan eliminasi adalah fraksi obat yang ada pada suatu waktu yang
akan tereliminasi dalam satu satuan waktu. Tetapan kecepatan eliminasi
menunjukkan laju penurunan kadar obat setelah proses kinetik mencapai
keseimbangan (Neal, 2006).
3. Parameter Turunan
Waktu mencapai kadar puncak ( tmak )
Nilai ini menunjukkan kapan kadar obat dalam sirkulasi sistemik mencapai
puncak.
Kadar puncak (Cp mak)
Kadar puncak adalah kadar tertinggi yang terukur dalam darah atau serum
atau plasma. Nilai ini merupakan hasil dari proses absorbsi, distribusi dan
eliminasi dengan pengertian bahwa pada saat kadar mencapai puncak
proses-proses tersebut berada dalam keadaan seimbang.
Luas daerah di bawah kurva kadar obat dalam sirkulasi sistemik vs waktu
(AUC)
Nilai ini menggambarkan derajad absorbsi, yakni berapa banyak obat
diabsorbsi dari sejumlah dosis yang diberikan. Area dibawah kurva
konsentrasi obat-waktu (AUC) berguna sebagai ukuran dari jumlah total
obat yang utuh tidak berubah yang mencapai sirkulasi sistemik .

Agar nilai parameter obat dapat dipercaya ,metode penetapan kadar harus
memeuhi berbagai criteria yaitu meliputi perolehan kembali,presisi dan akurasi
.Persyaratan yang dituntut adalah jika metode tersebut dapat memperoleh nilai
perolehan kembali yang tinggi(75-90% atau lebih ) ,kesalahan acak dan sistemik
kurang dari 10 %.
Parameter farmakokinetika sangat penting karena dapat menggambarkan
seberapa besar obat diabsorbsi, seberapa tepat obat dieliminasi, seberapa besar efek
terapeutik dan ketoksisikan suatu obat. Oleh karena itu agar parameter dapat
dipercaya, metode yang digunakan dalam menentukan kadar obat yang digunakan
harus memenuhi criteria sebagai berikut:
1. Selektif atau spesifik
Selektifitas metode adalah kemampuan suatu metode untuk membedakan suatu
obat dari metabolitnya, obat lahir(dalam kasus tertentu yang berkaitan) dan
kandungan endogen cuplikan hayati. Selektifitas metode menempati prioritas
utama karena bentuk obat yang akan ditetapkan dalam cuplikan hayati adalah
dalam bentuk tak berubah atau metabolitnya. Metode analisis yang digunakan
harus memiliki spesifitas yang tinggi terhadap salah satu obat yang akan
ditetapkan tersebut. Spesifik hendaknya diterapkan dengan percobaan melalui
bukti kromatografi bahwa metode spesfik untuk obat.Sebagai tambahan, standar
internal hendaknya dapat dipisahkan secara lengkap dan menunjukkan tidak
adanya gangguan senyawa-senyawa lain. Penetapan kadar secara kalorimetrik dan
spektrofotometrik biasanya kurang spesifik. Gangguan dari zat lain dapat
memperbesar kesalahan hasil (Shargel, 1998).
2. Sensitif atau peka
Sensitifitas metode berkaiatan dengan kadar terendah yang dapat diukur oleh
suatu metode analisis yang digunakan. Pemilihan metode analisis tergantung pada
tingkat sensitifitas yang dimiliki oleh metode tersebut. Hal ini dapat dipahami
karena dalam menghitung parameter farmakokinetika suatu obat, diperlukan
sederetan kadar dari waktu ke waktu. Sehingga metode analisis yang dipilih harus
dapat mengukur kadar obat tertimggi sampai yang terendah yang ada dalam
badan.
Perlu diperhatikan bahwa terdapat keterkaitan antara kespesifikan dan kepekaan
suatu metode analisis. Dalam berbagai kasus,kespesifikan suatu metode dapat
ditingkatkan dengan menurunkan kepekaan, karena dengan cara gangguan
komponen lain dalam sampel dapat ditekan. Akan tetapi, penurunan kepekaan
kadang-kadang mengakibatkan kekeliruan negative yang merugikan dalam
analissi kualitatif. Oleh karena itu, sebelum memilih suatu metode, perlu
dipertimbangkan dengan seksama manakah yang lebih dibutuhkan,kepekaan yang
maksimum atau kespesifikan yang tinggi.
3. Ketelitian (accuracy) dan ketepatan(precision)
Ketelitian(accuracy) ditunjukan oleh kemampuan suatu metode untuk
memberikan hasil pengukuran sedekat mungkin dengan true value (nilai
sesungguhnya). Ketelitian suatu metode dapat dilihat dari perbedaan anatara harga
penetapan kadar rata-rata dengan harga sebenarnya atau konsentrasi yang
diketahui.
Jika tidak ada data nilai sebenarnya atau nilai yang dianggap benar tersebut maka
tidak mungkin untuk menentukan berapa akurasi pengukuran tersebut.Presisi
menyatakan seberapa dekat nilai hasil dua kali atau lebih pengulangan
pengukuran. Semakin dekat nilainilai hasil pengulangan pengukuran maka
semakin presisi pengukuran tersebut.



=


100%= %




Metode yang baik memberikan hasil recovery yang tinggi yaitu 75-90% atau
lebih. Ketelitian berkaian dengan purata. Bila suatu hasil itu teliti (accurate) berarti
purata sama dengan harga sebenarnya, walaupun penyebarannya lebar (luas). Dalam
hubungan ini, adalah lebih baik hasil yang kurang teliti tapi tepat daripada teliti
namun kurang tepat. Ketepatan(precision) menggambarkan hasil yang berulang-ulang
tidak mengalami perbedaan hasil (reprodusibilitas data). Dengan kata lain, ketepatan
menunjukkan kedekatan hasil-hasil pengukuran berulang. Ketepatan pengukuran
hendaknya diperoleh melalui pengukuran ulang(replikasi) dari berbagai konsentrasi
obat dan melalui pengukuran ulang kurva konsentrasi standar yang disiapkan secara
terpisah pada hari yang sama. Ketepatan berhubungan dengan penyebaran harga
terhadapa purata kecil meskipun karena kesalahan sistematik, purata berbeda agak
besar dengan harga sebenarnya. Kemudian dilakukan perhitungan statistik yang sesuai
dengan penyebaran data, sperti datndar deviasi atau koefisien variasi.




4. Cepat
Kecepatan berkaitan dengan banyaknya cuplikan hayati yang harus dianalisis
dalam suatu macam penelitian farmakokinetika
5. Efisien
Metode tidak terlalu panjang karena dikhawatirkan akan menimbulkan suatu
kesalahan sistematik.



= 100%%
=


100%
=

100%

III. ALAT DAN BAHAN
ALAT
Labu takar 100 ml
Pipet volume 0,1; 0,2; 1,0; 2,0 ml
Tabung reaksi 15 buah
Pipet ukur 5 ml
Speltrofotometer
Kuvet
Scalpel/ silet
Sentrifuge
Stopwatch
Kertas grefik numeric dan semilog
BAHAN
Asam trikloroasetat (TCA)
Natrium nitrit 0,1 %
Ammonium sulfamat 0,5 %
N (1-naftil) etilebdiamin 0,1 %
Sulfadiazine (Na)
Antikoagulan: heparin
Darah tikus

IV. CARA KERJA
Ditetaapkanan prosedur kadar Bratton Marshall

Dibuat larutan stok Na sulfadiazine

Dibuat kurva baku internal

Sampel darah invivo diproses

Stok Na sulfadiazine ditambahkan darah sampel di campurkan dan
dipusingkan (sentrifuge)

Diambil beningan dan diencerkan

Ditambahkan NaNO2 didiamkan

Ditambahkan larutan N (1-naftil) etilendiamin dan dicampur dengan baik

Dipindahkan larutan kedalam kuvet dan dibaca intensitas warna pada
spektrofotometer


Dicari waktu larutan sulfadiazine

Digunakan larutan sulfadiazine

Diukur resapan

Dibuat kurva resapan versus

Ditetapkan waktu resapan

Dicari panjang gelombang

Dibuat kurva baku sulvadiazin menggunakan regersi

Ditentukan perolehan kembali, kesalahan acak dan kesalahan sistemik


Disediakan larutan dalam darah 50, 100, 300 g/ml

Diambil 0,1 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi dengan 3,9 ml air

Dianalisis sulfadiazine

Ditentukan kadar masing-masing

Dihitung kadar rata-rata dan simpangan baku

Dibuat 2 replikasi


V. HASIL PERCOBAAN
1. Kurva baku
Kadar 0; 25; 50; 100; 200; 400 g/ l
Volume pengambilan:

Kadar 25 g/ ml
V1.M1 = V2.M2
1000.V1 = 1000.25
V1 = 25 l
V Aquadest = 1000-25 l
V Aquadest = 975 l


Kadar 50 g/ ml
V1.M1 = V2.M2
1000.V1 = 1000.50
V1 = 50 l
V Aquadest = 1000-50 l
V Aquadest = 950 l

Kadar 100 g/ ml
V1.M1 = V2.M2
1000.V1 = 1000.100
V1 = 100 l
V Aquadest = 1000-100 l
V Aquadest = 900 l

Kadar 200 g/ ml
V1.M1 = V2.M2
1000.V1 = 1000.200
V1 = 200 l
V Aquadest = 1000-200 l
V Aquadest = 800 l

Kadar 400 g/ ml
V1.M1 = V2.M2
1000.V1 = 1000.400
V1 = 400 l
V Aquadest = 1000-400 l
V Aquadest = 600 l


Kadar (g/ ml)

Absorbansi
25 0,180
50 0,325
100 0,199
200 0,412
400 0,929






2. Volume pengambilan (Recovery)
Kadar 75; 150; 300 g/ l
Volume pengambilan:

Kadar 75 g/ ml
V1.M1 = V2.M2
1000.V1 = 1000.150
V1 = 150 l
V Aquadest = 2000-150 l
V Aquadest = 1850 l

Kadar 150 g/ ml
V1.M1 = V2.M2
1000.V1 = 1000.300
V1 = 300 l
V Aquadest = 2000-300 l
V Aquadest = 1700 l

Kadar 300 g/ ml
V1.M1 = V2.M2
1000.V1 = 1000.600
V1 = 600 l
V Aquadest = 2000-600 l
V Aquadest = 1400 l


y = 0.0018x + 0.1527
R = 0.9366
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 100 200 300 400 500
A
b
s
o
r
b
a
n
s
i

Kadar (g/ml)
Kurva Baku Sulfametoksazol dalam
Darah Tikus

Kadar (g/ ml)

Replikasi Absorbansi
75 I 0,515
II 0,386
III 0,319
150 I 0,831
II 0,817
III 0,834
300 I 0,877
II 0,783
III 0,828


VI. ANALISIS DATA

Diamati perubahan yang terjadi

Dicatat hasilnya

Dihitung kadar rata-rata , recovery, kesalahan acak dan kesalahan sistemik

VII. PERHITUNGAN

Y = 1,830.10
-3
x + 0,153
X = Y - 0,153
1,830.10
-3

X
75
= 0,407 0,153 = 138,797 g/mL
1,830.10
-3


X
150
= 0,827 0,153 = 368,306 g/mL
1,830.10
-3


X
300
= 0,829 0,153 = 369,398 g/mL
1,830.10
-3

Perolehan kembali



%PK75 = 138,797 x 100% =185,063%
75
%PK150 = 368,306 x 100% =245,537%
150
%PK300 = 369,398 x 100% =123,13%
300

Kesalahan Acak



%KA
75
= 0,0996 x 100% = 24,477%
0,407
%KA
150
= 9.10
-3
x 100% = 1,097%
0,827
%KA
300
= 0,047 x 100% = 5,671%
300

Kesalahan sistematik


%KS75 = 100% - 185,073% = -85,073%
Kadar terukur
Perolehan kembali = x 100%
Kadar diketahui
Simpangan baku
Kesalahan acak = x 100%
Harga rata-rata
Kesalahan sistemik = 100% - %PK

%KS150 = 100% - 245,537% = -145,537%
%KS300 = 100% - 123,130% = -23,130%

ONEWAY DATA RECOVERY
ONEWAY /VARIABLES= absorbansi BY kadar
Descriptives

95% Confidence Interval
for Mean


N Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
Lower
Bound
Upper
Bound
Minimum Maximum
absorbansi 75 3 .41 .10 .06 .16 .65 .32 .52

150 3 .83 .01 .01 .80 .85 .82 .83

300 3 .83 .05 .03 .71 .95 .78 .88

Total 9 .69 .22 .07 .52 .86 .32 .88
Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig.
absorbansi 3.49 2 6 .10

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.
absorbansi Between Groups .36 2 .18 43.66 .00

Within Groups .02 6 .00


Total .38 8


Uji Anova pada prinsipnya adalah melakukan analisis variabilitas data menjadi dua
sumber variasi yaitu variasi didalam kelompok (within) dan variasi antar kelompok
(between). Bila variasi within dan between sama (nilai perbandingan kedua varian mendekati
angka satu), maka berarti tidak ada perbedaan efek dari intervensi yang dilakukan, dengan
kata lain nilai mean yang dibandingkan tidak ada perbedaan. Sebaliknya bila variasi antar
kelompok lebih besar dari variasi didalam kelompok, artinya intervensi tersebut memberikan
efek yang berbeda, dengan kata lain nilai mean yang dibandingkan menunjukkan adanya
perbedaan.
Hasil uji Anova diketahui besarnya nilai F hitung adalah 43,66 dengan degree of
freedom/derajat bebas (df) regression sebesar 2 dan nilai df dari residual sebesar 6, maka
dapat diketahui besarnya nilai dari F-tabel pada tingkat signifikansi 5% (a = 0,05) yaitu
sebesar 5,14 (Lihat Tabel F).
Untuk pengujian yaitu dengan membandingkan besarnya nilai F hitung dan F tabel,
memberikan hasil bahwa nilai F hitung lebih besar dari F tabel atau 43,66 > 5,14. Diperkuat
dengan nilai p = 0.00 lebih kecil daripadanilai kritik =0,05. H0 ditolak sehingga kesimpulan
yang didapatkan adalah ada perbedaan yang bermakna rata-rata absorbansi berdasarkan
ketiga kelompok kadar tersebut.
Karena hasil uji Anova menunjukan adanya perbedaan yang bermakna, maka uji
selanjutnya adalah melihat kelompok mana saja yang berbeda. Untuk menentukan uji lanjut
mana yang digunakan, maka kembali kita lihat tabel Test of Homogeneity of Variances.
Hasil uji Homogeneity of Variances menunjukkan nilai sig. (p-value) sebesar 0,10, ini
mengindikasikan bahwa kita gagal menolak H0, dengan kata lain H0 diterima. Berarti tidak
cukup bukti untuk menyatakan bahwa mean dari tiga kadar kelompok tidak sama. Hasil yang
didapatkan 0,10 > 0,05 dapat disimpulkan bahwa data absorbansi berdasarkan kadar
mempuyai varian yang sama.

VIII. PEMBAHASAN
Tujuan praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat memahami langkah-langkah
analisis obat didalam cairan hayati. Obat yang dianalisis dalam percobaan kali ini adalah
sulfametoksazol. Dalam percobaan ini digunakan metode bratton-marshall. Metode bratton-
marshall merupakan cara umum untuk menentukan kadar senyawa yang mempunyai senyawa
amin primer didalamnya. Metode ini berdasarkan kolorimetri, yaitu terbentuknya senyawa
berwarna yang intensitasnya dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer uv-
visibel.
Analisis ini bertujuan untuk menguj seberapa besar ketepatan dan ketelitian metode
yang digunakan, maka ditetapkan beberapa parameter farmakokinetika yang berhubungan
dengan metode penetapan kadar suatu obat dalam cairan hayati, seperti recovery (P%), dan
kesalahan sistematik (100%-P%) sebagai parameter ketelitian serta perhitungan SD dan
kesalahan acak (CV) sebagai parameter ketepatan. Parameter farmakokinetik merupakan
tolak ukur yang digunakan untuk mengevaluasi pola absorbsi, distribusi, metabolisme,
ekskresi suatu obat. Parameter farmakokinetik merupakan besaran yang diturunkan secara
sistematis dari hasil pengukuran kadar obat atau metabolitnya dalam darah atau urin. Analisis
ini dilakukan dengan membuat seri kadar obat tertentu dalam darah dan urin yang kemudian
diproses lebih lanjut sehingga dpaat dibaca absorbannya dan dibuat kurva bakunya.
Cairan hayati yang digunakan sebagai media obat adalah darah dan urin. Darah yang
digunakan untuk analisis obat karena darah merupakan tempat yang paling cepat dicapai oleh
obat dan merupakan tempat dominan yang dilalui oleh obat, baik ketika proses metabolisme
maupun organ eliminasi, sehingga kadar obat dalam darah paling mencerminkan kadar obat
sebenarnya dalam tubuh. Proses absorbsi ditunjukan dengan adanya peningkatan kadar obat
dalam darah. Sedangkan proses distribusi dan eliminasi ditunjukan dengan adanya penurunan
kadar obat dalam darah pada waktu tertentu.
Sedangkan penggunaan urin dalam analisis kadar obat memiliki beberapa persyaratan,
antara lain bentuk obat dalan keadaan unchanged, teknik penetapan harus spesifik,
frekuensi cuplikan harus besar, dan cuplikan yang diambil harus ketika semua obat telah
diekskresi atau sekitar 7-10 kali waktu paruhnya. Keterbatasan penggunaan cuplikan urin
diantaranya karena pengosongan kandung kemih sulit utnuk dikerjakan, banyak obat
mungkin mengalani dekomposisi selama penyimpanan, dan kemungkinan terhidrolisisnya
konjugat metabolit yang tidak stabil dalam urin. Pada akhirnya keterbatsan tersebut dapat
mempengaruhi jumlah total obat dalam bentuk unchanged yang diekskresikan pada waktu
tak hingga.

Berikut bahan bahan yang digunakan dalam praktikum ini:
1. sulfametoksazol:


Rumus molekul : C
10
H
11
N
3
O
3
S
Berat molekul : 253,28
Pemerian : serbuk hablur, putih sampai hampir putih, praktis tidak berbau
Kelarutan : praktis tidak larut dalam air, dalam eter dan dalam kloroform, mudah
larut dalam aseton dan dalam larutan natrium hidroksida encer, agak
sukar larut dalam etanol.
Sulfametoksazol mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,0%
C
10
H
11
N
3
O
3
S, dihitung terhadap zat yang etlah dikeringkan.
Pemerian : Serbuk hablur, putih sampai hampir putih; praktis tidak berbau
Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air, dalam eter, dan dalam kloroform; mudah
larut dalam aseton dan dalam natrium hidroksida encer; agak sukar
larut dalam etanol.
Sulfametoksazol merupakan derivat dari Sulfisoxasol yang mempunyai absorbsi dan
ekskresi yang lebih lambat. Bersifat tidak larut dalam air, tetapi larut dalam NaOH encer.
Dari sifat-sifat itu, larutan obat ini dibuat dengan melarutkan terlebih dahulu SMZ dalam
NaOH kemudian diencerkan dengan menggunakan aquadest hingga konsentrasi yang
dikehendaki. Obat ini biasa digunakan dalam bentuk sediaan tablet, injeksi, suspensi, tetes
mata, dan salep mata.
Waktu paruh plasma Sulfametoksazol adalah 11 jam
Sulfametoksazol merupakan sulfonamid turunan dari sulfanilamid dan mempunyai
peranan sebagai obat anti bakteri. Sulfametoksazol merupakan sulfonamid yang mempunyai
kecepatan absorpsi dan ekskresi cepat. Pasangan elektron bebas yang dimiliki
Sulfametoksazol terdapat pada atom-atom N-primer, N-sekunder, N-tersier, O pada SO dan
rantai siklik serta S pada SO, dimungkinkandapat mengikat tembaga(II) pada protein azurin
yang dibutuhkan oleh bakteri untuk proses fotosintesis.
Sulfametoksazol dalam dewasa ini hampir selalu digabungkan dengan trimetropin
dalam penggunaanya. Trimetoprim dan sulfametoksazol menghambat reaksi enzimatik
obligat pada dua tahap yang berurutan pada mikroba, sehingga kombinasi kedua obat
memberikan efek sinergi. Penemuan sediaan kombinasi ini merupakan kemajuan penting
dalam uasaha meningkatkan efektivitas klinik antimikroba. Kombinasi ini lebih dikenal
dengan kotrimoksazol.
Mikroba yang peka terhadap kombinasi trime toprim-sulfametoksazol ialah ; S.
pneumoniae, C. diphtheria, dan N meningitis, 50-59 % strain S. aureus, S. epidermidis, S.
pyogenes, S. viridians, S. faecalis, E. coli, P. mirabilis, P. morganii, P. rettgeri,
Enterobacter, Aerobacter spesies, Salmonela, Shigela, Serratia dan Alcaligenes spesies dan
Klebsiela spesies. Kedua komponen memperlihatkan interaksi sinergistik. Kombinasi ini
mungkin efektif walaupun mikroba telah resisten terhadap tirmetropim.
Aktifitas antibakteri kotrimoksazol berdasarkan atas kerjanya pada dua tahap yang
berurutan dalam reaksi enzimatik untuk membentuk asam tetrahidrofolat. Sulfonamide
menghambat masuknya molekul PABA ke dalam molekul asam folat dan trimetoprim
menghambat terjadinya reaksi reduksi dari dihidrofolat menjadi tetrshidrofolat.
Tetrahidrofolat penting untuk reaksi-reaksi pemindahan satu atom C, seperti pembentukan
basa purin (adenin, guanin, dan timidin) dan beberapa asam amino (metionin, glisin). Sel-sel
mamalia menggunakan folat jadi yang terdapat dalam makanan dan tidak mensintensis
senyawa tersebut. Trimetoprim menghambat enzim dihidrofolat reduktase mikroba secara
sangat selektif. Hal ini penting, karena enzim tersebut juga terdapat pada sel mamalia.

2. HEPARIN
Heparin adalah sediaan steril mengandung polosakarida sulfat seperti yang terdapat
dalam jaringan hewan yang menyusui, mempunyai sifat khas menghambat pembekuan darah.
Potensi tiap mg tidak kurang dari 110 IU dan tidak lebih dari 13 Iu dihitung terhadap zat yang
telah dikeringkan dan tidak kurang dari 90% dan tidak lebih dari 110% dari jumlah yang
tertera dalam etiket.
Struktur heparin:

Pemerian: Serbuk, putih atau putih daging agak higroskopis
Kelarutan: Larut dalam 2,5 bagian air
Heparin merupakan anti-koagulansia langsung, yang mengandung gugus karboksil
dan sisa sulfat, sehingga heparin merupakan salah satu asam terkuat dalam tubuh. Heparin
bekerja dengan menghambat pembekuan darah yang kerjanya bergantung adanya Anti-
trombin III (suatu
2
-globulin dan kofaktor dari heparin dan memperkuat kerja heparin)
sehingga membentuk kompleks heparin-antitrombin yang ammpu mengaktifkan faktor-faktor
Ixa, Xa, XIa, XIIa sehingga menghambat pembentukan trombin. Pqdq konsentrasi tinggi,
heparin menghambat juga agregasi trombosit.
Heparin juga mempunyai kerja menjernihkan plasma yang berlipid (membebaskan
lipoproteinlipase dari endotelium pembuluh yang mampu melarutkan khilomikron). Heparin
mempercepat penguraian histamin dengan membebaskan diaminoksidase yang mengoksidasi
histamin dan mereduksi pembentukan aldosteron.
Mekanisme anti koagulan :
Heparin + Anti trombin III + Faktor penggumpalan Kompleks terner

Protrombin X Trombin
Heparin beraksi dengan mengikat anti trombin III membentuk kompleks yang berafinitas
lebih besar daripada anti trombin III itu sendiri terhadap beberapa faktor pembekuan darah
aktif (trombin dan faktor Xa/faktor stuart power). Heparin juga menginaktivasi faktor
VIIIa/AHG dan mencegah terbentuknya fibrin yang stabil. Oleh karena itu heparin
mempercepat inaktivasi faktor pembekuan darah. (Ian Tahu, 1995).

3. ASAM TRIKLORO ASETAT(TCA)

Rumus molekul :
C
2
HCl
3
O
2
BM : 163,39
Pemerian : massa hablur, sangat rapuh, tidak berwarna, rasa lemah dan
khas.
Kelarutan : sangat mudah larut dalam air, dalam etanol, dan dalam eter P.
Asam trikloroasetat (nama sistematis: asam trikloroetanoat) adalah analog dari asam
asetat, dengan ketiga atom hidrogen dari gugus metil digantikan oleh atom-atom
klorin. Senyawa ini merupakan asam yang cukup kuat (pKa = 0.77, lebih kuat dari
disosiasi kedua asam sulfat). Senyawa ini dibuat melalui reaksi klorin dengan asam
asetat bersama katalis yang cocok.
CH
3
COOH + 3Cl
2
CCl
3
COOH + 3HCl
(anonim,1979)

4. NATRIUM NITRIT 0,1%

Nama lain : sodium nitrit, nitrous acid sodium salt, orinitrit.
Pemerian : putih atau sedikit kuning, granul higrokopis, batang atau serbuk.
Kelarutan : larut dalam 1,5 bagian air dingin, o,6 bagian air mendidih
(windohlz, 1976).

5. AMONIUM SULFAMAT

Nama lain : sulfamic acid monoamonium salt, AMS, amcide, ammate.
Pemerian : kristal higroskopis.
Kelarutan : sangat mudah larut dalam air, sedikit larut dalam etanol, cukup larut
dalam gliserol,glikol,formalmida.
(windohlz, 1976)

Dalam percobaan ini digunakan metode Bratton-Marshall. Metode Bratton-Marshall
merupakan cara umum untuk menentukan kadar senyawa yang mempunyai senyawa amin
primer didalamnya. Metode ini berdasarkan kolorimetri, yaitu terbentuknya senyawa
berwarna yang intensitasnya dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-
visibel. Metode Bratton-Marshall meiliki 3 tahap, yaitu :
1. Hidrolisis gugus asetil
Salah satu syarat reaksi diazotasi adalah senyawa harus memiliki gugus amina aromatik
primer. Apabila senywa gugus aminanya terikat pada molekul lain, maka senywa harus
dihidrolisis terlebih dahulu.
2. Diazotasi
Reaksi antara senyawa amina aromatik primer dengan asam nitrit ( HNO
2
) membentuk
suatu garam diazonium. Asam nitrit merupakan senyawa yang tidak stabil dalam keadaan
normal sehingga untuk mendapatkan asam nitrit perlu dilakukan reaksi anatara natrium
nitrit dengan HCl. Asam nitrit akan membentuk ion nitronium dan akan bereaksi dengan
amina membentuk garam diazonium. Reaksi diazotasi p-aminofenol :
NaNO2 + HCl
3. Kopling
Mula-mula dilakukan pengambilan darah hewan uji yaitu tikus.. Digunakan
tikus putih karena tikus memiliki sistem faal mirip dengan manusia. Pengambilan darah
dilakukan dengan menyayat vena lateralis dari ekor tikus.Vena disayat sejajar dengan
arah aliran darah (bukan melintang) karena dapat memutus vena tersebut sehingga
darah yang keluar tidak kontinyu. Pengambilan pada daerah tersebut karena di tempat
itu banyak terdapat pembuluh darah vena sehingga darah yang keluar lebih banyak
selain itu karena pada bagian ekor pembuluh darahnya dekat dengan permukaan kulit,
sehingga pengambilannya lebih mudah dan dapat mencegah dari kematian. Sebelum
diambil darahnya,bulu pada daerah ekor tikus dicukur terlebih dahulu agar darah tidak
menempel dan tertinggal pada bulu tikus. Dengan pencukuran diharapkan darah dapat
menetes keluar tanpa hambatan. Ekor yang telah disayat diurut untuk mendilatasi untuk
pembuluh darahsehingga darah dapat keluar dengan lebih mudah dan cepat. Apabila
darah sudah tidak keluar lagi maa ekor tikus lagi atau dapat pula luka goresan tadi
sigores sedikit lagiagar luka dapat terbuka kembali dan darah dapat mengalir keluar.
Jika darah yang terkumpul tidak cukup banyak,maka dapat dilakukan dengan
pengambilan darah dari pembuluh darah tepi mata dari tikus. Namun pada percobaan
kali ini darah diambil hanya melalui vena lateralis.
Pada praktikum ini diambil darah dari pembuluh vena pada ekor tikus dengan skalpel.
Pengambilan darah dilakukan dengan cara memasukkan tikus kedalam holder dan dilewatkan
ekornya pada lubang holder lalu holder ditutup sehingga yang berada di luar holder hanya
bagian ekor tikus. Kemudian dipegang ekor tikus dengan posisi menurun dan dicukur bulu
tikus pada ekor dengan menggunakan skalpel sehingga tampak daerah kebiruan yang
merupakan vena. Lalu skalpel digoreskan pada pembuluh vena sehingga darah bisa menetes,
darah yang menetes tersebut ditampung dengan eppendorf yang telah diberi heparin sebanyak
5,0 ml sebagai koagulan. Maksud penambahan antikoagulan adalah agar darah tidak
membeku. Jika darah mengalami koagulasi maka pada proses sentrifugasi akan diperoleh
supernatan berupa serum sedangkan yang digunakan dalam pemeriksaan adalah plasma darah
sebagai cairan hayati. Jika darah mulai tidak menetes, diusap bagian luka dengan kapas lalu
diurut bagian ekor dari atas ke bawah sehingga darah keluar. Darah yang ditampung dari
seluruh kelompok memenuhi syarat yaitu minimal 4 ml. Darah yang keluar ditampung dalam
efendorf 1 mL tiap kelompok.
Sulfametoksazol akan berikatan dengan protein plasma membentuk kompleks obat
makromolekul yang disebut kompleks protein-obat. Protein dalam plamsa darah antara lain
albumin danglobulin. Albumin bertangggung jawab terhadap ikatan obat, sedangkan
globulinmerupakan bagian terkecil dari keseluruhan protein plasma. Obat akanberikatan
dengan protein plasma jika plasma darah memebentuk suatu agregat besar. Oleh karena itu,
digunakan plasma darah yang tidak terkoagulasi. Kelompok kami menyayat sampai 3 kali
dan jumlah darah yang didapat hampir memenuhi eppendorf.
Setelah itu dibuat larutan baku yang bertujuan agar kita dapat menghitung persamaan
regresi linier hubungan kadar sulfametoksazol dengan absorbansi sehingga dapat menghitung
kadar sulfametoksazol dalam darah tikus. Untuk kurva baku dibuat masing-masing seri kadar
larutan baku dengan mengencerkan larutan sulfametoksazol dengan kadar1, mg/mL
menggunakan aquadest lalu dimasukkan dalam tabung reaksi berisi sampel hingga didapat
konsentrasi sulfametoksazol dalam sampel 25, 50, 100, 200, 400. Untuk blangko digunakan
aquadest dengan tujuan untuk mengoreksi absorbansi senyawa yang terbentuk.
Lalu dilakukan pembuatan kurva baku internal, karena menggunakan darah pada
sampel bukan aquadest. Caranya dengan blanko (250 mikro liter) yang mengandung
koagulan ditambahkan 250 mikro liter larutan stok sulfametoksazol sehingga kadarnya 0, 25,
50, 200, dan 400 mikrogram/mL darah, campur homogen.
Selanjutnya adalah pemrosesan sampel darah invivo dengan cara masukan 250
mikroliter darah yang mengandung anti koagulan. Maksud penambahan antikoagulan adalah
agar darah tidak membeku. Campuran tersebut ditambahkan dengan 250 mikroliter aquadest
lalu campur homogen. Setelah homogen ditambahkan dengan 2 mL TCA 5% dengan
votexing. Maksud penambahan TCA adalah agar protein terdeprotonasi. TCA mendenaturasi
struktur sekunder dan tersier protein melalui ikatan disulfida yang merupakan pembentuk
kedua struktur tersebut sehingga bagian nonpolar dari protein akan keluar serta protein
mengendap. TCA juga berfungsi sebagai donor proton pada reaksi berikutnya. TCA juga
berfungi sebagai pemberi suasana asam pada reaksi diazotasi sehingga dapat menghentikan
kerja enzim pemetabolisme obat sekaligus menyebabkan denaturasi protein plasma tanpa
memecah protein menjadi asam amino penyusunnya. Lalu maksud dari votexing adalah agar
terjadi pencampuran antara TCA dengan darah yang mengandung anti koagulan secara
merata sehingga proses denaturasi protein berjalan lebih cepat.
Berikut ini adalah proses denaturasi protein oleh TCA:
















Pada reaksi diazotasi yang biasa, digunakan HCl (suatu asam mineral kuat) sebagai
pemberi suasana asam. Tetapi pada percobaan ini tidak digunakan HCl karena HCl berefek
memecah protein menjadi asam amino-asam aminonya sehingga pada saat sentrifugasi asam
amino-asam amino tersebut tidak akan memisah dari plasmanya karena terlalu kecil untuk
bisa diendapkan. Asam amino tertentu memiliki ikatan rangkap terkonjugasi akan
memberikan serapan pada UV-Vis sehingga akan mengganggu pembacaan absorbansi.
Sedangkan bila digunakan TCA akan mengikat protein sehingga protein dapat terdenaturasi
dalam suasana asam tanpa terpecah menjadi fragmen-fragmennya.
Lalu larutan kurva baku internal yang telah dibuat digabung dengan sampel darah in vivo
yang telah di votexing dicampur lalu dipusingkan selama 5 menit dengan kecepatan 2500
rpm. Maksud dari dipusingkan adalah agar terpisah antara zat padat dalam hal ini protein
terdenaturasi dengan cairan yang berupa supernatan. Sentrifugasi juga menyempurnakan dan
mempercepat pemisahan endapan protein dari supernatan yang mengandung sejumlah
sulfametoksazol yang tidak ikut mengendap bersama protein. Sulfametoksazol yang berada
pada supernatan merupakan obat bebas yang tidak terikat protein, sedangkan obat yang
terikat dengan prtein tidak aktif scara farmakologis dan tidak memberikan efek terapeutik.
Setelah dipusingkan maka diambil beningan sebanyak 1,50 mL dengan menggunakan
mikropipet secara hati hati agar endapan protein tidak diambil, sehingga didapatkan obat
bentuk bebas pada sampel. Lalu diletakkan di tabung reaksi setelah itu diencerkan dengan
aquadest sebanyak 2,0 mL. Lalu disetiap tabung reaksi ditambahkan larutan NaNO2 0,1%
sebanyak sebanyak 0,1 mL lalu diamkan selama 3 menit agar terjadi reaksi secara sempurna.
Maksud dari penambhan natrium nitrit adalah agar terjadi reaksi diazotasi reaksi diazotasi
merupakan reaksi antara amina aromatik primer dengan natrium nitrit akan menghasilkan
garam diazonium. Kondisi yang paling baik untuk reaksi diazotasi pada pH sekitar 0-3. Suhu
harus rendah bertujuan untuk mengubah natrium nitrit menjadi asam nitrit yang akan bereaksi
dengan sulfametoksazol. Digunakan natrium nitrit sebab natrium nitrit lebih stabil
dibandingkan asam nitrit yang mudah rusak.

Lalu setelah itu ditambahkan larutan ammonium sulfamat 0,5% sebanyak 0,2 mL lalu
diamkan selama 2 menit agar proses reaksi berlangsung dengan sempurna. Maksud dari
penambahan dari ammonium sulfamat agar sisa nitrit dari reaksi diazotasi dapat ditangkap
oleh ammonium sulfamat. Asam nitrit yang bersifat sebagai oksidator dapat mengoksidasi
senyawa hasil reaksi kopling diazo sehingga dapat lepas menjadi gas nitrogen dan fenol. Oleh
karena itu kelebihan asam nitrit harus dihilangkan. Pada saat penambahan ammonium
sulfamat harus dilakukan secara hati hati karena akan timbul gelembung gas.

Selanjutnya larutan yang telah didiamkan selama 2 menit ditambah N(1-
naftil)etilendiamin 0,1% sebanyak 0,2 mL campur baik baik lalau diamkan selama 5 menit
ditempat gelap. N(1-naftil)etilendiamin sebagai pengompling lebih disukai untuk analisis
kuantitatid karena produk biasanya berupa larutan dalm air dan punya absortivitas yang
tinggi. N(1-naftil)etilendiamin bekerja dalam suasana asam.
Setelah didiamkan selam 5 menit, larutan dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 545 nm menggunakan spektrofotometer visibel terhadap blanko pereaksi yang
telah dibuat. Digunakan panjang gelombang 545 nm karena merupakan panjang gelombang
tersebut merupakan panjang gelombang maksimum untuk senyawa yang terbentuk.
Digunakan panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang maksimum
absorbansi yang dihasilkan maksimal dan kesalahan pembacaan pada panjang gelombang
maksimal paling kecil. Hal ini disebabkan karena pada panjang gelombang maksimal terdapat
keseimbangan antara energi yang dibutuhkan untuk eksitasi dengan energi yang diberikan
untuk eksitasi.
Sebelum dilakukan pengkuran absorbansi sampel harus terlebih dahulu dipersiapkan
kurva baku sebagai kalibrasi. Manfaatnya kita dapat mengetahui kisaran absorbansi untuk
sampel agar masuk dalam kisaran kurva baku. Sebelum dilakukan pembacaan absorbansi,
perlu dilakukan terlebih dahulu penentuan operating time, yang merupakan waktu yang
menunjukkan nilai absorbansi yang konstan terhadap larutan yang dianalisis. Hal ini perlu
dilakukan, karena pada percobaan ini terjadi suatu reaksi kopling dengan penambahan NED
pada suatu senyawa yang berupa garam diazonium sebagai hasil reaksi diazotasi suatu
senyawa aromatik primer dalam suasana asam. Reaksi tersebut memerlukan waktu hingga
terbentuk seyawa kopling yang stabil, yang ditunjukkan dengan diperolehnya nilai / angka
yang konstan pada beberapa kali pembacaan absorbansi dengan spektrofotometer. Akan
tetapi, pada percobaan ini tidak dilakukan penentuan nilai max dan operating time-nya,
namun sebelum pembacaan absorbansi dilakukan pendiaman terhadap campuran yang telah
ditambahkan NED selama + 5 menit. Dengan waktu 5 menit, diperkirakan merupakan
operating time untuk campuran tersebut dan kemungkinan dalam waktu 5 menit tersebut
reaksi kopling sudah berjalan dengan sempurna.
Hasil absorbansi yang diperoleh kemudian digunakan untuk menghitung kadar
terukur obat dalam sampel, lalu dihitung beberapa paranmeter fisika:
1. Akurasi
Akurasi dianggap baik jika kesalahan sistematik tidak lebih dari 10%. Harga
kesalahan sistematik menunjukan kemampuan metode ini memberikan hasil
pengukuran sedekat mungkin dengan nilai sebenarnya.
2. Presisi
Presisi dianggap baik jika kesalahan acak tidak lebih dari 10%. Ketepatan
menunjukan hasil pengukuran yang berulang pada sediaan hayati yang sama.
3. Efisiensi
Nilai recovery atau perolehan kembali hasil yang didapat. Recovery merupakan
tolak ukur efisiensi analisis. Analisis memenuhi syarat jika recovery berkisar
antara 75-90%. Jika diluar rentang kadar tersebut maka percobaan dianggap
kurang efisien. Recovery menunjukan kemapuan suatu metode memberikan hasil
sedekat mungkin dengan hasil sesungguhnya.
Sedangkan syarat yang harus dipenuhi oleh metode analisis yang digunakan yaitu:
1. Selektif dan spesifik
2. Akurat dan teliti
3. Sensitif
4. Efisien, cepat, dan mudah digunakan.
Pada praktikum kali ini didapatkan data berupa nilai absorbansi. Dari berbagai seri
kadar sulfametoksazol, akan didapatkan hasil berupa nilai absorbansi untuk masing-masing
kadar. Data yang diperoleh kemudian dilakukan regresi linier, dimana kadar sulfametoksazol
sebagai nilai X dan absorbansi yang diperoleh sebagai nilai Y, sehingga didapatkan
persamaan kurva baku.
Pembuatan seri kadar larutan baku sulfametoksazol dengan cara mengencerkan stok larutan
sulfametoksazol 1,0 mg/ml menggunakan pelarut aquadest dengan rumus yaitu:
V
1
.M
1
=V
2
.M
2
, dimana V
1
menunjukan volume sulfametoksazol yang diambil dalam satuan
mililiter, serta nilai V
2
menunjukan nilai volume dari labu takar. Lalu nilai M
1
menunjukan
nilai kadar sulfametoksazol yang tersedia dengan M
2
menunjukan konsentrasi yang kita
inginkan. V
1
.M
1
=V
2
.M
2
. Sehingga didapatkan konsentrasi sulfametoksazol : 25; 50; 100;
200; 400 g/ml. Sulfametoksazol dan aquadest diambil menggunakan mikropipet karena
jumlah yang dibutuhkan sedikit. Dengan kadar sulfametoksazol sebesar 25g/mL didapatkan
volume sulfametoksazol yang harus diambil sebesar 25 mikroliter. Dengan kadar sebsar 50
g/mL didapatkan kadar sulfametoksazol yang harus diambil sebesar 50 mikroliter.
Berikutnya dengan kadar 100 mg/mL didapatkan kadar yang harus diambil sebesar 100
mikroliter. Dengan kadar sebsar 200 mg/mL didapatkan jumlah volume sebesar 200
mikroliter. Serta yang terakhir dengan kadar sebsar 400mg/mL didapatkan volume 400 mikro
liter yang harus diambil.
Pembuatan kurva baku bertujuan untuk menghitung persamaan regresi linier
hubungan kadar sulfametoksazol pada sampel darah tikus dengan nilai absorbansinya.
Pembuatan kurva baku membutuhkan 6 sampel darah yang dimasukkan ke dalam tabung
reaksi. Lima dari sampel darah tersebut ditambahkan sulfametoksazol sebanyak 250 l
dengan kadar yang berbeda untuk setiap tabung reaksi. Satu sampel darah yang tersisa
ditambahkan 250 l aquadest sebagai blanko dalam perhitungan absorbansi. Penggunaan
blanko bertujuan untuk mengoreksi absorbansi senyawa yang terbentuk. Tabung berisi
sampel darah dan sulfametoksazol digojog ringan agar homogen. Kemudian ke dalam 5
tabung reaksi berisi darah dan sulfametoksazol serta 1 tabung reaksi berisi blanko
ditambahkan TCA (Trikloroasetat) 5 % sebanyak 2,0 ml. Tujuan penambahan TCA adalah
untuk mendenaturasi protein plasma tanpa memecah protein menjadi asam amino dan
penyusunnya sehingga pada proses sentrifugasi protein bisa mengendap dan memisah dari
plasma darah. TCA juga digunakan untuk memberikan suasana asam yang dibutuhkan untuk
proses reaksi kimia diazotasi sehingga dapat diketahui kadar sulfametoksazol sebenarnya.
Kondisi asam yang diberikan TCA juga mampu menghentikan enzim pemetabolisme obat
dalam darah. Untuk memaksimalkan kerja TCA, TCA perlu dihomogenkan terlebih dahulu
dengan vortex. Setelah dilakukan vortex maka keenam tabung disentrifugasi selama 5 menit
dengan kecepatan 2500 rpm. Sentrifugasi bertujuan memisahkan bagian padat (protein dan
sel-sel darah) dengan bagian cair yang merupakan plasma darah. Plasma tampak sebagai
supernatan bening di lapisan atas. Plasma darah mengandung sejumlah sulfametoksazol yang
tidak ikut mengendap bersama protein.
Setelah sentrifugasi, plasma darah diambil sebanyak 1,50 ml, jangan sampai endapan
ikut terambil karena bisa memengaruhi hasil absorbansi pada spektrofotometer UV-Vis.
Plasma darah berisi obat bebas, sedangkan obat yang berikatan dengan protein plasma tidak
aktif secara farmakologis dan tidak memiliki efek terapetik. Plasma lalu dimasukkan dalan
tabung reaksi ditambah 0,1 ml larutan NaNO
2
0,1 % dan didiamkan selama 3 menit. Ion NO
2

dari NaNO
2
dan H
+
dari TCA akan membentuk asam hipotetik HNO
2
yang akan bereaksi
dengan amina aromatis yang dimiliki sulfametoksazol sehingga membentuk garam
diazonium dan menyebabkan perpanjangan ikatan rangkap terkonjugasi (kromofor) sehingga
dapat diketahui absorbansinya. Selanjutnya, ditambahkan 0,2 ml larutan ammonium sulfamat
0,5 % ke masing-masing tabung reaksi lalu didiamkan selama 2 menit. Ammonium sulfamat
akan menghilangkan kelebihan HNO
2
, karena HNO
2
berlebih akan merusak senyawa yang
terbentuk. Hilangnya HNO
2
ditandai dengan tidak adanya gelembung N
2
yang dapat
mengganggu analisis. Reaksinya adalah sebagai berikut.
HNO
2
+ HSO
3
NH
2
H
2
SO
4
+ H
2
O + N
2

Setelah 2 menit, ditambahkan N(1-naftil)etilendiamin (NED) 0,1 % ke dalam
campuran sebanyak 0,2 ml. Penambahan NED bertujuan untuk menimbulkan reaksi kopling
yang menyempurnakan reaksi diazotasi sebelumnya. Campuran ini diletakkan di tempat
gelap selama 5 menit untuk menyempurnakan reaksi. Setelah 5 menit, absorbansi masing-
masing campuran dibaca menggunakan spektrofotometer. Panjang gelombang yang
digunakan adalah 545 nm dan digunakan blanko darah dengan kadar 0 %. Panjang
gelombang 545 nm dipilih karena memiliki sensitivitas tinggi, dimana dengan perubahan
sedikit kadar dapat menyebabkan perubahan absorbansi yang besar.
Kemudian didapatkan nilai absorbansi dari kadar 25 g/ml menunjukkan absorbansi
sebesar 0,180; kadar 50 g/ml menunjukkan absorbansi sebesar 0,325; kadar 100 g/ml
menunjukkan absorbansi sebesar 0,199; kadar 200 g/ml menunjukkan absorbansi sebesar
0,412; dan kadar 400 g/ml menunjukkan absorbansi sebesar 0,929. Nilai absorbansi pada
kadar 100 g/ml lebih kecil dari kadar 50 g/ml. Hal ini tidak sesuai teori, seharusnya
semakin besar kadar semakin besar pula absorbansi karena semakin banyak partikel dalam
campuran sehingga cahaya yang dapat diserap partikel semakin banyak. Kesalahan ini
kemungkinan disebabkan kurang sempurnanya pengenceran atau terjadi reaksi yang kurang
sempurna. Nilai absorbansi yang menyimpang dari teori yaitu 0,199 dapat diabaikan dalam
pembuatan regresi linier.
Nilai absorbansi yang didapat kemudian dibuat persamaan kurva baku menggunakan
regresi linier. Berdasarkan data yang didapat, diperoleh persamaan kurva baku sebagai
berikut:
y = 1,830.10
-3
x + 0,153


Berdasarkan pengukuran dan hasil perhitungan pada data kadar Sulfametoksazol di
dalam darah tikus, kita bisa menghitung nilai kesalahan sistemik, kesalahan acak, dan
perolehan kembali. Nilai-nilai ini berguna dalam menentukan keakuratan dan presisi data.
Nilai perolehan kembali (recovery) merupakan parameter atau tolak ukur efisiensi analisis
yang menggambarkan akurasi (ketelitian) metode yang digunakan. Ketelitian ditunjukan oleh
kemampuan metode untuk memberikan hasil sedekat mungkin dengan nilai yang
sesungguhnya. Ketelitian suatu metode dapat diketahui dari harga perolehan kembali atau
recovery yang dinyatakan sebagai % error. Perolehan kembali merupakan tolak ukur efisiensi
analisis, sedangkan kesalahan sistemik merupakan tolak ukur inakurasi penetapan kadar.
Kesalahan ini dapat berupa kesalahan konstan atau proporsional.






Persyaratan yang dituntut bagi suatu metode tersebut dapat memberikan nilai
perolehan kembali yang tinggi (75-90% atau lebih), kesalahan acak dan sistematik kurang
dari 10% (Pasha dkk., 1986).
Kadar terukur
Perolehan kembali = x 100%
Kadar diketahui
y = 0.0018x + 0.1527
R = 0.9366
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 100 200 300 400 500
A
b
s
o
r
b
a
n
s
i

Kadar (g/ml)
Kurva Baku Sulfametoksazol dalam
Darah Tikus
Nilai perolehan kembali untuk sampel dengan kadar 75, 150, dan 300 g/mL pada
sampel darah tikus, sebagai berikut:
1. Nilai recovery rata-rata darah tikus dengan kadar 75 g/mL sebesar 185,063%
2. Nilai recovery rata-rata darah tikus dengan kadar 150 g/mL sebesar 245,537%
3. Nilai recovery rata-rata darah tikus dengan kadar 300 g/mL sebesar 123,130%

Dari ketiga nilai tersebut, tidak ada nilai yang memenuhi syarat sebuah data dapat
dinyatakan akurat. Untuk memenuhi tingkat akurasi yang baik, range nilai recovery yang
ditentukan adalah 75-90%. Untuk nilai recovery yang lebih besar dari 100% dapat
disebabkan:
Ada senyawa endogen atau metabolit yang ikut terukur, seperti, molekul-molekul
pengganggu atau protein dalam darah yang dapat meningkatkan nilai absorbansi.
Ketidaktelitian praktikan dalam menggunakan alat praktikum seperti mikropipet
yang mempengaruhi pemberian volume analit ataupun larutan pereaksi, alat votex
yang mempengaruhi homogenitas antara pereaksi dan analis, dan juga
spektrofotometer yang mempengaruhi nilai serapan analit.
Perbedaan dalam penentuan operating time sehingga pembacaan absorbansi pada
pembuatan kurva baku dan pembacaan pada percobaan tidak sama selang
waktunya.

Berikut beberapa cara untuk menghindari kesalahan pada parameter nilai perolehan
kembali:
Sentrifugasi yang dilakukan harus mampu mengendapkan protein plasma dan
tidak menyebabkan hemolisis pada sampel darah, yaitu pecahnya sel darah merah
sehingga komponen-komponen intrasel keluar tercampur dengan plasma sehingga
tidak mengganggu proses absorbansi sampel.
Saat pengambilan supernatant hasil sentrifugasi, jangan sampai endapan ikut
terambil.
Pengukuran sampel dan latutan pereaksi harus tepat.
Pemakaian alat yang baik dan benar sesuai prosedur kerja.
Mengkondisikan sampel dan pereaksi tidak terkontaminasi.

Selain akurasi, suatu ketepatan metode analisis dapat ditinjau dari segi presisinya. Dikatakan
presisi atau tepat apabila mampu menunjukan kedekatan hasil pada pengukuran berulang atau
replikasi pada sampel hayati yang sama. Tolak ukur dari ketepatan suatu metode analisis
adalah kesalahan acak atau koefisien variansi (CV). Kesalahan acak identik dengan
variabilitas pengukuran dan dicerminkan oleh tetapan variasi.




Ketentuan dari sebuah metode dikatakan mencapai ketepatan yang tinggi apabila nilai
CV kurang dari 10%. Pada percobaan ini, diperoleh kesalahan acak pada sampel darah tikus
sebagai berikut:
1. Nilai kesalahan acak rata-rata darah tikus dengan kadar 75 g/mL sebesar 24,477%
2. Nilai kesalahan acak rata-rata darah tikus dengan kadar 150 g/mL sebesar 1,097%
3. Nilai kesalahan acak rata-rata darah tikus dengan kadar 300 g/mL sebesar 5,671%

Dari nilai kesalahan rata-rata yang diperoleh, hanya nilai kesalahan rata-rata pada
konsentrasi 150 dan 300 g/mL yang kurang dari 10%, sehingga dapat disimpulkan pada
pengukuran konsentrasi 150 dan 300 g/mL memiliki presisi yang baik. Ini menandakan
dalam upaya tiga kali replikasi pengukuran absorbansi, nilai yang didapatkan tidak serupa
satu sama lain.
Penyebab dari inpresisi dalam pengukuran adalah kesalahan acak yang tidak diketahui
penyebab pastinya, namun selalu ada di dalam setiap percobaan atau penelitian.
Kemungkinan faktor-faktor penyebabnya variasi perlakuan sampel oleh setiap praktikan yang
berbeda, seperti pemakaian mikropipet atau alat vortex. Untuk mengatasinya, alat yang
digunakan harus dikalibrasi terlebih dahulu, dan sebelum digunakan, alat harus dalam kering
dan diusahakan kering.
Parameter lain untuk menilai suatu percobaan adalah nilai kesalahan sistemik yang
mempunyai syarat nilainya kurang dari 10% agar metode yang digunakan mencapai akurasi
yang tinggi. Kesalahan ini bersifat konstan dan mengakibatkan penyimpangan tertentu dari
rata-rata.



Nilai kesalahan sistemik untuk sampel dengan kadar 75, 150, dan 300 g/mL pada
sampel darah tikus, adalah sebagai berikut:
Simpangan baku
Kesalahan acak = x 100%
Harga rata-rata
Kesalahan sistemik = 100% - %PK

1. Nilai kesalahan sistemik darah tikus dengan kadar 75 g/mL sebesar -85,073%
2. Nilai kesalahan sistemik darah tikus dengan kadar 150 g/mL sebesar -145,537%
3. Nilai kesalahan sistemik darah tikus dengan kadar 300 g/mL sebesar -23,130%

Dari data kesalahan sistemik darah tikus di atas, seluruh nilainya adalah kurang dari 10%.
Artinya, secara keseluruhan hasil percobaan memiliki akurasi yang baik. Jika ada nilai
kesalahan sistemik yang lebih dari 10%, dapat diakibatkan oleh beberapa faktor berikut:
Kesalahan praktikan dan proses analisis. Dalam percobaan ini dimungkinkan
kesalahan ada pada ketidaktelitian praktikan dalam pengukuran volume sampel
maupun pereaksi. Hal ini dapat diatasi dengan peningkatan keterampilan
praktikan.
Kesalahan alat dan peraksi, dapat disebabkan oleh pereaksi yang kurang valid atau
telah terkontaminasi atau pemakaian alat yang kurang tepat.
Kesalahan metode, dapat disebabkan pada kesalahan pengambilan sampel dan
reaksi kimia yang belum sempurna.

Dari perhitungan ketiga parameter di atas, didapatkan hasil yang jauh dari persyaratan
parameter yang baik, terutama pada ketepatan metode. Faktor kesalahan tersebut seperti
keterampilan praktikan, proses analisis, alat, dan metode yang digunakan. Secara umum,
dapat disimpulkan metode Bratton-Marshall ini memiliki ketelitian yang rendah untuk
analisis obat daam darah. Salah satunya disebabkan oleh terlalu banyak langkah yang harus
dilakukan, padahal dalam analisis semakin banyak langkah maka semakin besar kesalahan
terjadi.


IX. KESIMPULAN
Metode Bratton-Marshal dapat digunakan untuk menganalisis obat-obat yang
memiliki gugusamina aromatik primer dengan pembentukan
senyawacoupling berwarna dari garam diazonium.
Metode pengukuran harus memenuhi beberapa kriteria, diantaranya efiesiensi
(perolehankembali atau recovery), presisi dan akurasi.
Berdasarkan teori, metode Bratton-Marshal dapat digunakan untuk menetapkan
kadar sulfametoksazol, karena sulfametoksazol memiliki gugus amina aromatis
primer.
Berdasarkan percobaan diperoleh nilai bahwa nilai perolehan kembalinya adalah
180,063 %, 245,2537%, 123,13 %. Hasil perolehan kembali ada diluar kisaran
range yaitu 75 125 %.
Berdasarkan percobaan diperoleh nilai kesalahan acak nilai adalah
24,477%,1,097%, 5, 671%.
Berdasarkan percobaan diperoleh nilai kesalahan sistemik adalah -85,073 %, -
145,537%, -23,13 %.
Berdasarkan hasil percobaan, metode Bratton-Marshal tidak memenuhi syarat
(tidak spesifik dans elektif) karena tidak memenuhi parameter, yaitu tidak efisien,
akurat dan presisi dalam penetapan kadar sulfametoksazol dalam darah tikus.


X. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1979, Farmakope Indonesia edisi III, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta.
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia edisi IV, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta.
Anonim, 1996, The Merck Index, Vol. X, Merck Research Laboratories: Division
of Merck & Co, INC.
Bertram G, Katzug, 2002, Farmakologi Dasar dan Klinik, Edisi 8, Salemba
Medika, Jakarta.
Goodman & Gilman, 1996, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9
th

Edition, The McGraw-Hill Companies, USA.
Imuno Argo, Donatus, Drs., Apt, 1989, Analisis Farmakokinetika, Bagian I,
Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.
Mutschler, Ernest, 1991, Dinamika Obat, Buku Ajar Farmakologi & Toksikologi,
edisi V, Penerbit ITB, Bandung.


Yogyakarta, 13 Mei 2014
1. Sufi Pertiwi FA/09736
2. Rizki Rahmadani FA/09738
3. Anissa Sri Rejeki FA/09741
4. Ratna Wulan K FA/09747
5. Cherra Ayu FA/09749




LAPORAN RESMI PRAKTIKUM
FARMAKOLOGI EKSPERIMENTAL I
ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI

Asisten :
1
2
Disusun oleh :
Golongan IV/ Kelompok III
Kelas C2013
Nama NIM TTD
1. Sufi Pertiwi FA/09736
2. Rizki Rahmadani FA/09738
3. Anissa Sri Rejeki FA/09741
4. Ratna Wulan K FA/09747
5. Cherra Ayu FA/09749


Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi
Bagian Farmakologi dan Farmasi Klinik
Fakultas Farmasi UGM
2014