Anda di halaman 1dari 26

ELEKTROFORESIS GEL

I. TUJUAN


1. Mempelajari teknik elektroforesis gel untuk mengetahui ukuran fragmen
DNA tanaman, darah dan plasmid.
2. Mengetahui dan memahami prinsip kerja elektroforesis gel.

II. TEORI


Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan
suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan
ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam
percobaan biokimia dan biologi molekuler (Bowen 2000: 1). Elektroforesis gel adalah
teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul
tersebut untuk melewati medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik (Anonim ?: 1).
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi
menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya
(Bowen 2000: 1). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju
kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings 1994: 215).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran,
konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar
memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk
menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks &
Andersen 1999: 280). Aplikasi elektroforesis dapat digunakan dalam uji paternitas dan
identifikasi pelaku kejahatan (DNA fingerprinting). Elektroforesis juga berperan
dalamhuman genome project (Anonim ?: 3).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya
melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu
campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA
dengan panjang yang sama (Campbell dkk. 2002: 396--397). Ada tiga jenis gel yang dapat
digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan
menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis
yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.
(Davis dkk. 1994: 151).
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan
yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk
dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan
pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan
pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan
dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan
tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang
rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat
migrasi DNA.
(Wolfe 1993: 127; Bowen 2000: 3-4).
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui
ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil
ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai
penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA
tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya
jelas. Salah satu contohmarker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki
delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb. Penggunaan
DNA marker tersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA
dengan ukuran 110--20.000 pb. (Birren & Lai 1993: 82; Martin 1996: 77).
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom
Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel
(Birren & Lai 1993: 79--81).
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat
disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog
dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger
printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit
tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui
aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum
dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular,
mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau
mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik,
menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan
dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon
dalam rekombinan plasmid DNA (Russell 1994: 299--310 & 500--501; Fairbanks &
Andersen 1999: 278).




III. ALAT, BAHAN DAN CARA KERJA


A. ALAT


Alat yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah aparatus
elektroforesis yang terdiri dari tray, comb, chamberdan sumber listrik; sarung tangan
karet; mikropipet dan tips; alat dokumentasi gel (gel doc) merek BIORAD tipe XR.

B. BAHAN


Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah bubuk agarosa 1
gr; running buffer; loading buffer; parafilm; sampel DNA (produk PCR); Etidium bromida
(EtBr); DNA marker (lambda DNA/Hind III).

C. CARA KERJA


1. Gel agarose dibuat (telah dilakukan oleh asisten) dengan campuran 2 gr agarose + 200 ml 1x
TBE, dididihkan dan ditambahkan etidium bromida 2 L dicampur dengan baik, kemudian
dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan combnya dan dibiarkan sampai
mengeras.
2. Gel dimasukkan kedalam electrophoresis chamber dan ditambahkan larutan running
buffer serta etidium bromida.
3. Sampel DNA hasil PCR dicampurkan dengan loading bufferkemudian dimasukkan ke
dalam well pada gel dengan menggunakan mikropipet.
4. Marka DNA dimasukkan.
5. Penutup electrophoresis chamber dipasang dan power supplydinyalakan.
6. Setelah pewarna bergerak sampai bagian ujung gel, gel dikeluarkan dan dilihat dengan sinar
UV.

IV. HASIL PENGAMATAN
A. SAMPEL DNA TANAMAN



Agarose 0,8%, 100 volt, 1l/ml EtBr


Keterangan :
A. DNA Marker B. Well
C. DNA tanaman D. Gel

B. SAMPEL DNA DARAH



Agarose 1%, 100 volt, 1l/ml EtBr


Keterangan:
A. DNA Marker
B. DNA darah
C. Well
D. Gel






C. SAMPEL DNA PLASMID





Gal Agarose 1%, 100 volt, 0,1l/ml EtBr


Keterangan:
A. DNA Marker
B. DNA plasmid
C. Well
D. Gel










V. PEMBAHASAN


Praktikum elektroforesis gel menggunakan gel agarosa. Gel agarosa diperoleh dari
rumput laut dan biasanya digunakan dalam konsentrasi 0,5--2%. Alasan memakai agarosa
dibandingkan poliakrilamida adalah agarosa mudah untuk disiapkan karena proses
pembuatannya mudah. Gel agarosa dibuat dengan cara mencampurkan bubuk agarosa
dengan larutan buffer, kemudian dipanaskan dan tunggu sampai mengeras. Gel agarosa
juga bersifat non-toxic (Bowen 2000: 1).
Selain itu praktikum elektroforesis gel juga menggunakan alat-alat yang mempunyai
fungsi dan peranan masing-masing. Alat-alat tersebut adalah mikropipet, apparatus
elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, dan sarung tangan lateks. Mikropipet
berfungsi untuk memindahkan sampel dan larutan lainnya dari tubeke dalam well-
well pada aparatus elektroforesis. Apparatus elektroforesis terdiri atas comb (sisir) yang
membentuk well (sumur) pada gel agarosa, tray yang merupakan wadah cetakan gel,
danchamber yang merupakan medium tempat berlangsungnya proses
elektroforesis. Power Supply (DC) sebagai sumber energi untuk aparatus
elektroforesis. Sumber Sinar UV berfungsi untuk membantu mengamati hasil band yang
tampak sehingga terlihat lebih jelas. Sarung tangan lateks berfungsi untuk melindungi
tangan agar tidak bersentuhan langsung dengan etidium bromida yang bersifat
karsinogenik atau penyebab kanker (Birren & Lai 1993: 79--81).
Praktikum elektroforesis gel dimulai dengan pembuatan gel agarosa. Praktikan tidak
melakukan pembuatan gel agarosa karena dilakukan oleh asisten praktikum. Secara umum,
proses pembuatan gel agarosa dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa
dengan larutan buffer, dipanaskan di dalam microwave, tambahkan etidium bromida,
dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai
mengeras. Bubuk agarosa yang digunakan sebanyak 1 gr dan larutan running buffer TBE
(Tris- Borate- EDTA) sebanyak 100 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari
fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Bowen 2000: 3). Penambahan
etidium bromida dilakukan dengan tujuan mewarnai asam nukleat. Etidium bromida
adalah mutagen dan harus ditangani dengan hati-hati. Penanganannya harus dilakukan
dengan sarung tangan karet (Bowen 2000: 4). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke
dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running
buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan
gel saat dilakukan pemanasan (Gardner et al. 1991: ?). Running elektroforesis dilakukan
pada tegangan 80 Volt selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh
tegangan elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan
dengan fragmen DNA yang kecil (Bowen 2000: 4).
Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA hasil amplifikasi lewat proses PCR
dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan
membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki
pewarna bromofenol biru (Bowen 2000: 3). DNA amplifikasi yang dipindahkan hanya DNA
khamir dan plasmid. Hal tersebut berkaitan dengan terbatasnya jumlah well yang
ada. Pemindahan sampel DNA hasil amplifikasi dilakukan oleh dua orang praktikan secara
bergantian. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus
dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak meluber ke
bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4)
sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin 1996: 9).
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan
diberikan arus listrik. Gel dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami
perubahan warna dan dilihat dengan sinar UV. Hasil dokumentasi dilakukan dengan gel
doc. Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil
elektroforesis. Gel doc yang digunakan bermerek BIORAD tipe XR. Komponen gel
doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi bagian
dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer
berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk. 1994: 157--
158)
DNA marker yang digunakan saat praktikum adalahlambdaDNA/Hind III. DNA
marker tersebut mencakup delapan fragmen DNA (125 bp-23130bp) dan digunakan dengan
alasan dapat melihat pasangan basa yang lebih banyak dibandingkan DNA marker yang
lain (Davis dkk. 1994: 157--158).
Hasil pengamatan elektroforesis pada sampel darah praktikan tidak memperlihatkan
adanya band-band meskipun telah dirunning berulang kali, namun pada sampel darah
yang diambil dari asisten memperlihatkan band-band. Sampel 1 sampai sampel 4
merupakan sampel darah asisten, sedangkan sampel 5 sampai sampel 8 merupakan sampel
darah praktikan. Hasil elektroforesis DNA tanaman dengan gel agarosa 1% tidak
menunjukkan adanyaband, baik paralel 1 maupun paralel 2 sehingga asisten
melakukanloading ulang dengan gel agarosa 0,8% dan dijadikan dalam satu gel dengan
ukuran comb yang lebih kecil. Hasil perlakuan tersebut memperlihatkan band berada di
atas marker namun tampak kurang jelas. Hasil elektroforesis DNA plasmid
terlihat band hanya pada sampel DNA plasmid kelompok 3 dan 4, sedangkan pada sampel
DNA plasmid kelompok lainnya tidak menunjukkan adanyaband-band
Hasil elektoforesis gel yang band-bandnya tidak terlihat dan kurang jelasnya band-
band yang terbentuk menyebabkan hasil tersebut tidak dapat digunakan untuk mengukur
ukuran fragmen DNA. Hal tersebut kemungkinan dikarenakan banyak faktor, antara lain
proses pengisolasian yang tidak benar, proses PCR yang kurang bekerja, keterbatasan
fasilitas yang tersedia, dan telah terkontaminasinya sampel DNA. Kekurang telitian
praktikan dalam proses pengerjaannya pun menjadi faktor ketidakberhasilan praktikum.



VI. KESIMPULAN


1. Ukuran fragmen DNA dapat diketahui dengan teknik elektroforesis gel.
2. Prinsip kerja elektroforesis adalah pergerakan molekul organik dari kutub
negatif ke kutub positif berdasarkan ukuran fragmen.

III. DAFTAR ACUAN


Anonim. ?. Gel Electrophoresis. ?. www.bergen.org. 27 April 2007,pk.17.10.
Birren, B. & E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide.
Academic Press, Inc., San Diego: xviii + 235 hlm.
Bowen, R. 2000. Principles of gel electrophoresis. 3 Januari 2000: 4
hlm. http://www.vivo.colostate.edu. 27 April 2007, pk. 17.50.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Terj.
dari BIOLOGY oleh Lestari, R, dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.
Colorado State University. 2000. Principle of gel electrophoresis. 3 Januari
2000: 1.http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbook/genetics/biotech/gels/principles.html, 16
Mei 2008, pk. 08.30.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd
ed. Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm.
Faibanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole
Publishing Company, New York: xix + 820 hlm.
Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics. 8th ed. John
Wiley & Sons Inc., New York: xviii + 713 hlm.
GenScript Corp. (?). Marker Lambda HindIII. (?): 1 hlm.
http://www.genscript.com/site2/images/MM1212.jpg, 16 Mei 2008, pk. 08.25.
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics. 4th ed. Prentice
Hall, Englewood Cliffs: xvi + 773 hlm.
Martin, R. 1996. Gel electroforesis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford:
xiii + 173 hlm.
Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College
Publishers, New York: xvi + 528 hlm.
TerritorioScuola. (?).Gel electrophoresis apparatus. (?): 1 hlm.
http://commons/thumb/a/a6/Gel_electrophoresis_apparatus.JPG/288px-
Gel_electrophoresis_apparatus.JPG, 16 Mei 2008, pk. 08.40.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth
Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.

Tinjauan pustaka
Untuk mengetahui kemampuan hidup mikroorganisme dalam media yang mengandung logam
berat, maka dilakukan pengjitungan jumlah sel mikroorganisme yang diinokulasi pada media
cair dengan konsentrasi Cr(VI) 0 ppm dan 10 ppm selama 16 jam. Biakan yang tumbuh
diencerkan beberapa kali pengenceran 10-5 dan 10-6. hasil pengneceran ditumbuhkan pada
media LB padat sebanyak 100 l, dan diinkubasi lagi selama 16 jam suhu 37 C. Koloni yang
tebentuk dihitung dengan colony counter dan dihitung jumlah sel mikrooganisme dalam satuan
sel/ml (Hadioetomo, 1993).
Elektroforesis dikatakan sebagai analisis yang ideal untuk memurnikan komponen protein dari
campuran sampel dengan cara penambahan medium yang dapat mengikat protein selama
elektroforesis. Metode terbaik dalam pemurnian protein dengan tehnik elektroforesis adalah
dengan bahan polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Gel poliakrilamid merupakan larutan
dari akrilamid dan bisakrilamid (Hames, 1990; Matsudaira, 1993; Davis,et.al, 1994).
Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari campuran polypeptida
(Hames & Rickwood, 1990). Marker protein yang digunakan memiliki rentang berat molekul 212
kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan
berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas warna yang lebih besar
dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap variaetas disebut protein mayor (Wijaya &
Rahman: 2005). Penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan
memecah struktur tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit
polipeptida secara individual. SDS juga membungkus rantai protein yang tidak terikat dengan
muatan negatif yang sama membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS protein
mempunyai densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan ukuran
protein (Wijaya & Rohman, 2005).
Alasan elektroforesis digunakan dalam penelitian ini karena memiliki peran sangat penting
dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi, khususnya protein. Karena disamping
metode tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer, tetapi juga sangat sensitif terhadap
perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil (Bachrudin, 1999). Protein yang
dialirkan dalam medium yang menagndung medan listrik maka senyawa-senyawa yang
bermuatan akan bergerak dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas yang berlawanan,
maka mobilitas suatu molekul meupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul, dan besar tipe
muatan.
Pembahasan
Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada
suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan
dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang
bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium,
kemudian dialiri arus listrik dari suatukutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul
tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada
bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengangaya Lorentz, yang terkait dengan
sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan
fragmen DNA.
Jenis elektroforesis
Perangkat elektroforesis gel
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam
danpartikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion
kompleks.Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan
adsorpsivitas zat terlarut.
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji
(sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.
Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida
sebagai gel media.
Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam
nukleat memiliki gugus yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+)
atau anion (-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan.
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan
ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Banyak molekul biologi
bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul
biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang
bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang
dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh
karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medanlistrik.
Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika system koloid bermuatan negative, maka partikel itu
akan menuju electrode positif
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan
negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian
dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul
tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut
tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk
molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-
sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
Fe = qE, F= gaya Lorentz, q= muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan
fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan
partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung
kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga
pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.
Jenis Elektroforesis
1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam
dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks.
Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan
adsorpsivitas zat terlarut.
2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji
(sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.
Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida
sebagai gel media.
Medium Pendukung
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah
terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan
agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam
nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di
medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu
campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu.
Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan
penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran
molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.
1. Cellulose asetat
2. Larutan Buffer
Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :
- Komposisi => Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan
mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena
dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.
- Konsentrasi => Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa
meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya.
Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga
meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M.
- Ph => Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah,
sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga
terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang
memiliki sifat asam dan basa
3. Medan elektrik
Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium.
- Voltase => Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara
keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient
potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.
- Aliran listrik => Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya
oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah
muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan
sebanding dengan waktunya.
- Tahanan => Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis
medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak
antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan
konsentrasi ion dalam buffer.
Dalam hasil praktikum yang dilakukan dihasilkan pembahasan seperti ini
Pembuatan Jel Horisontal
Alat dan bahan yang di butuhkan seperti sisir, cetakan, tempat jel, tutup berventilasi, tegangan
25 volt, 50 volt, 100 volt, 135 volt.
Pembuatan horizontal => bahan yang digunakan dari agarosa (dari rumput laut/ agar2 yang
telah dip roses lagi) hal ini dilakukan menggunakan agarose karena padi dan agar agar mudah
retak atau patah. 0,8% sampai dengan 2% agarose ( tergantung berat molekul ) dibawah 0,8%
mudah lunak sehingga perlu di ekstrak. Etilium bromide( ditambahkan pada agarose atau
washing buffer pada akhir pembuatan jel ). Mencetak pada tempat cetakan yang sudah di
siapkan, mendiamkan 15 sampai 30 menit, sampai jel membeku. Mengambil sisir dalam
cetakan. Ambil jel dan meletakkan pada tempatnya ( yang horizontal ). Memasukkan running
buffer ( supaya tidak terbentuk gelembung udara pada sumuran). Apabila ada gelembung
udara, otomatis berpenggaruh pada pemasukan samprl. Memesukan sampel pada sumuran (
pada loading sampel). Ditambahkan pewarna BPB/BTB (ditambahkan pemberat agar turun
kesumuran) hal ini adalah teknik loading buffer. Ditambahkan marker di akhir pembuatan jel.
Menutup dan pasang arus listrik setelah running lepas tutup dan ambil tempat jel. Masukan
washing buffer ( kira kira selama 15 menit). Memasukan UVilluminator.
Pembuatan jel vertikal
Alat dan bahan yang dibutuhkan plate(kaca) kecil 1mm, plate (kaca) besar 3mm ada speacer.
PAGE SDS PAGE, urea.
Metodenya yang digunakan sparating jel bagian bawah. stacking bagian atas (untuk sampel)
Pembuatan vertical => 10% sampai 12,5% atau 5% sampai 15% untuk pembuatan jel vertical,
stacking jel kosentrasinya 4% dimasukan. Merendam jel membutuhkan larutan staning dan
destining. Yang larutan staning membutuhkan 12jam. Metodenya hampir sama dengan
pembuatan jel yang horizontal.
Kesimpulan dan saran
Kesimpulan
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik .
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan
partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks.
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul.
Saran
Dalam praktikum setidaknya penjelasan demi penjelasan harus diperhatikan, karna bagi kita
dalam praktikum ini masih banyak yang belum dimengerti.
Daftar Pustaka
Paper Electrophoresis. Image from http://www.funsci.com
Wijaya. S.K.S & Rohman, L. 2005. Fraksinasi dan Karakterisasi protein Utama Biji
Kedelai.Fakultas MIPA Universitas Jember
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: UI Press
Bachrudin. Z. 1999. Petunjuk Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. PAU
Bioteknologi: UGM Yogyakarta.
Hames, B.D & Rickwood.1990. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington:
Robert E Krieger Publishing Company
Matsudaira, P. 1993. A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing.
2
nd
Ed. California: Academic Press. Inc
Davis, P.H dan V.H Heywood. 1963.Basic Methods in Molecular Biology. 2
nd
Ed. Conecicut:
Appleton & Lange.
Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.
http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html
http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular



TUJUAN
1. Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.
2. Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.
DASAR TEORI

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu
makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan
ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam
percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara
rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai
cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan
prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada
medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh
medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan
massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan
bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif
(anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and
Cummings, 1994).

Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi
dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar
memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan
untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks
& Andersen, 1999).

Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati
suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu
campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA
dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002).

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida
dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis
yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
(Davis dkk. 1994).

Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar
(lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari
200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan
berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung
pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan
arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA
itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam
padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan
bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat
bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa
memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan
pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda.
Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi
fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik
pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).

Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada
fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA
memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA
merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari
kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi
fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5
sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2
kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman,
2010).

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis
(Birren and Lai, 1993).

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom
Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada
gel (Birren and Lai, 1993).

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu
dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis
dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen
homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom,
DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik
atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan
tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme
atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi
di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam,
menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan
aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR,
mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan
jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994;
Fairbanks and Andersen, 1999).

Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi
atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien
karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa.
Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk
(ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit
diinterpretasikan (Tarigan, 2011).

ALAT DAN BAHAN

ALAT
1. Satu set alat elektroforesis
2. Mikropipet dan tip
3. Gel Doc
4. Power Supply
5. Parafilm
BAHAN
1. DNA Marker
2. Produk DNA
3. Ethidium Bromide (EtBr)
4. dd H
2
O
5. Gel Agarose
6. Loading Buffer (Loading dye)
7. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)
8. Akuades
CARA KERJA
Pembuatan Gel Agarose
1. 0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE.
2. Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan.
3. Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu 50C.
4. Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis.
5. Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan hingga
mengeras.
6. Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat diambil dan gel agarose siap untuk
digunakan.
Elektroforesis
1. Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE.
2. 1l loading dye dicampur dengan 3l produk DNA pada parafilm yang telah tersedia
dengan bantuan mikropipet.
3. Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose.
4. Sedangkan untuk 3l DNA marker 1kb dituangkan pada sumur/well yang berada pada
paling tepi atas dan bawah.
5. Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power supply.
6. Power Supply ( 400mA, 90V) dinyalakan selama 30 menit.
Dokumentasi
1. Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan EtBr selama 15 menit.
2. Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama 15 menit.
3. Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc dan kemudian diambil gambarnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL



PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan
mampu untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan
Protein), yaitu metode elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat
mengetahui bagaimana cara mengukur fragmen DNA pada praktikum ini.

Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular
berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan
dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA
yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).

Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui
suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari
kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose
tersebut (Yuwono, 2005).

Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis
horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Berdasarkan jenisnya ada dua macam
elektroforesis yaitu:
1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan
tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung
partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.
2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan,
mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau
poliakrilamid
(Biosciences, 1999).

Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan
menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang
diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk
analisais DNA.

Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses
berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan
dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga
dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu,
dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga memiliki
kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel
ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).

Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%. Praktikan
tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten
praktikum. Secara umum, proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara
mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan
di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan
dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan
sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL
yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan
kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam
ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running
buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan
pemanasan (Gardner dkk, 1991).

Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki
fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama
proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru
(Magdeldin, 2012).

Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA
sebanyak 4l dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3l pada sumur/well yang telah
dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan
bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan
harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak
meluber ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung
gugus PO
4
) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker
berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA
yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi
pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut
merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya
jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki
delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993;
Martin, 1996).

Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan
arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt
dan dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat
dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke
tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat
dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose
nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan
warna. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994).

Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose
hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini
berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel
Doc. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang
lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan
menggunakan Gel Doc.

Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil
elektroforesis. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu
UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret
hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat
bantuan software (Davis dkk, 1994).

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan
yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar
untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi
memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih
rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan
dengan yang berbentuk bulat.

4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas
muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan
yang rendah.

5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul
DNA.

7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA
(Wolfe, 1993).

Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak
menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali, yang terlihat hanyalah
migrasi dari marker DNA pada sisi tepi gel agarose. Hal yang semacam ini
kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya penyimpanan untai DNA setelah di
isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat sedikit kesalahan dalam
penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi proses
elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak
mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan
faktor yang lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai
DNA itu sendiri. Kenapa bisa begitu, dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan
sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari suhu penyimpanan.

Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu
produk DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi
linier.

KESIMPULAN
1. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis
elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.
2. Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan
negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui
matriks membran gel agarose.
3. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat
didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan
tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan
kurva regresi linier.
4. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel
adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori
gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat
muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran
fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan
produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan.

DAPUS

Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences : USA.
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press,
Inc., San Diego.
Boffey, S. A. (1984). Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in Molecular Biology,
vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Totowa, NJ.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga : Jakarta.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2
nd
ed. Appleton &
Lange, Norwola.
Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing
Company, New York.
Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8
th
ed. John Wiley &
Sons Inc., New York.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4
th
ed. Merrill Publishing Co. :
Columbus, Ohio.
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in
agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).
Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek
: Bogor.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher :
Rijeka, Croatia.
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.
Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers, New York.
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked
Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen
Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company,
Belmont.
Diposkan 14th May 2013 oleh Percy Ajis Jackson

Anda mungkin juga menyukai