2

Introducere

Metode de testare a sensibilitii la antibiotice
Metoda diluiilor
Metoda difuzimetric
Factori ce afecteaz diametrul zonelor de inhibiie

Controlul de calitate




Principalele scopuri ale antibiogramei:
Orientarea tratamentului
Cunoaterea sensibilitii unui microorganism la anumite chimioterapice
Determinarea concentraiei unui chimioterapic n esuturile sau fluidele organismului

Instrument epidemiologic
Supravegherea apariiei de tulpini rezistente a principalilor ageni patogeni (ex. Shigella, Salmonella
typhi)
Supravegherea continu a patternului de rezisten a tulpinilor patogene (ex. Staphylococcus, bacili
Gram negativi)
Ageni antimicrobieni frecvent folosii n tratarea infeciilor sistemice

3
Metoda difuzimetric
Se dispun discuri ce conin o cantitate cunoscut de antibiotic pe un
mediu solid nsmnat cu tulpina bacterian de testat
Metoda diluiilor
Variaz cantitatea de substane antimicrobiene incorporate n medii
solide sau lichide
Ulterior se inoculeaz tulpina bacterian de testat



Se folosesc discuri de hrtie impregnate cu antibiotice
Se testeaz sensibilitatea la mai multe antibiotice prin msurarea
diametrului zonelor de inhibiie
S-a demonstrat c rezultatele metodei difuzimetrice cu discuri se
coreleaz bine cu rezultatele metodei diluiilor





4
Materiale necesare:
Inoculul bacterian reprezint tulpina bacterian de testat, izolat din
produsele patologice i identificat.
Inoculul este o cultur n mediu lichid de 18 ore obinut din 5-10 colonii
izolate, standardizat nefelometric.
Concentraia bacterian a inoculului este de 10
5
UFC/ml (Unitati Formatoare de
Colonii), cu o turbiditate de 0,5 uniti McFarland.
Mediu de cultur solid pentru antibiogram (ex. geloz Mueller Hinton,
geloz simpl etc.) turnat n plci Petri, cu grosimea de 3-4 mm i cu o
compoziie adecvat, n funcie de tulpina de testat i structura
chimioterapicelor.
Microcomprimate standardizate - discuri de hrtie de filtru cu diametrul de 6
mm mbibate cu antibioticele de testat. Pe discuri este imprimat simbolul
antibioticului i cantitatea n micrograme.

Grosime: 4 mm
pH
Cationi * Magnesium
* Calcium
Condiii de stocare
Trebuie uscate
Trebuie adus la temperatura camerei


Condiii de incubare
Aer ambiental, 35
0
C pentru bacterii aerobe i facultativ anaerobe
Perioada de incubare 16-18 h
24 h pentru S.aureus i enterococi
5% CO
2
pentru Haemophilus
Teancurile de plci nu vor conine mai mult de 5 plci




Trebuie stocate i manipulate corect
Trebuie refrigerate, se scot de la frigider cu 1 h nainte de utilizare
Se verific data de expirare
Se aduc la temperatura camerei evitnd condensul
Se plaseaza n 15 minute de la nsmnarea mediului
6
Procedur (Kirby-Bauer modificat: National Committee for Clinical Laboratory
Standards. NCCLS/CLSI)
Se prepar un inocul de 10
5
UFC/ml n ser fiziologic sau bulion soia-tripticaza
(TSB) sau bulion Mueller-Hinton (5 ml)
Se prelev de pe plac 5-10 colonii izolate
Se ajusteaz turbiditatea pentru a fi aceeai cu standardul McFarland No. 0.5.
Se prelev din inocul cu tamponul i se descarc pe suprafaa gelozei Mueller-
Hinton
Se las 5-10 minute geloza pentru uscare
Prepararea inoculului


Limita zonei de inhibiie
7
Procedur (continuare)
Se plaseaza discurile cu antibiotice pe suprafaa gelozei
insamantate cu inocul
Plcile se incubeaz la 37
o
C, timp de 18-24 h
Se msoar diametrul zonelor de inhibiie a creterii
bacteriene n mm



Cretere bacterian
Metoda difuzimetrica
Insamantarea
inoculului
Aplicarea discurilor
cu antibiotice
Dup o incubare de 18-24 ore la
37
0
C, se msoar diametrele
zonelor de inhibiie
Plasare incorect a discurilor
Plasare corect a discurilor
Geloz prea subire
12
Metoda difuzimetric
Msurarea diametrelor zonelor de inhibiie

Se msoar de la marginea unde ncepe creterea, cu 3 excepii:
n cazul sulfamidelor i cotrimoxazolului se ignora uoara cretere la
marginea zonei
Unele tulpini de Proteus spp. Pot invada n zona de inhibitie
Dac se testeaz Streptococcus productor de beta-lactamaze i
apare zone de inhibiie suprapuse se raporteaz ca rezistent



Metoda difuzimetric

Msurarea diametrelor zonelor de inhibiie
Se msoar de la marginea unde ncepe creterea, cu 3 excepii:
n cazul sulfamidelor i cotrimoxazolului se ignora uoara cretere la marginea zonei
Unele tulpini de Proteus spp. Pot invada n zona de inhibitie
Dac se testeaz Streptococcus productor de beta-lactamaze i apare zone de inhibiie
suprapuse se raporteaz ca rezistent

Teste de sinergie
Se plaseaza alaturat discuri
continand antibiotice cu efect
sinergic
Zonele de inhibitie se contopesc
Test pentru producerea
de beta-lactamaze
Se plaseaza alaturat discuri continand
antibiotic simplu si antibiotic cu
inhibitor de beta-lactamaze
In cazul producerii de beta-lactamaze,
diametrul zonei de inhibitie din jurul
discului cu inhibitor este mult mai mare
aspect de dop de sampanie

Test pentru producerea
de beta-lactamaze
Ampicillin (A); Chlorampenicol (C);
Streptomycin (S); Sulphonamides (Su);
Tetracycline (T); Trimethoprim (Tm); Nalidixic
acid (Na); Kanamycin (K); Ciprofloxacin (Cp);
Ceftazidime (Cz); Gentamycin (Gm) and
Cefotaxime (Ctx).
17
Metoda difuzimetric
Interpretarea rezultatelor
Prin compararea diametrelor obinute cu cele din tabele standardizate pentru tulpinile
de referin
Rezultatul se raporteaz ca:
Sensibil
Intermediar sensibil
Antibiotice cu toxicitate mic: Moderat sensibil
Antibiotice cu toxicitate mare: zon tampon ntre sensibil i rezistent
Rezistent






Test pentru producerea de
beta-lactamaze
18
19

Densitatea inoculului

Timpul de aplicare a discurilor

Temperatura de incubare

Timpul de incubare

Dimensiunea placii

Grosimea gelozei (4 mm)

Spaierea discurilor (2.5 cm)



Zonele sunt mai mari cnd inoculul este slab i
invers

Daca dup aplicarea discurilor placa este inut mult
la temperatura camerei se formeaza zone mai mici

Zone mai mari la temperaturi > 35
o
C

Ideal 16-18 ore; incubarea mai scurta nu da rezultate
interpretabile
Plcile mai mici permit un numr mai mic de discuri

Mediul subire duce la apariia de zone mari i
invers

Evit suprapunerea zonelor



Factori ce afecteaz diametrul zonelor de inhibiie
20
Se efectueaz diluii de antibiotice n mediu
lichid sau solid
Permite obinerea de rezultate cantitative :
Indic concentraia minim inhibitorie precum i
concentraia minim bactericid a chimioterapicului
testat
Concentraia Minim Inhibitorie (CMI) (Minimal
Inhibitory Concentration = MIC)
Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic care
inhib multiplicarea bacterian
Concentraia Minim Bactericid (CMB)
(Minimal Bactericidal Concentration = MBC)
Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic care permite
supravieuirea a mai puin de 0,1 % din bacteriile din inocul

21
Procedur
Se efectueaz diluii binare de antibiotic n bulion Mueller-Hinton,
Tryptic Soy Broth, Clark, ser fiziologic
Se nsmneaz inoculul bacterian i se incubeaz
Se folosesc martori fr inocul i fr antibiotic
Se observ turbiditatea i se determin concentraia minim
inhibitorie - CMI (ultima eprubet n care cultura bacterian nu a mai
crescut i mediul a rmas limpede)
Se subcultiv eprubetele limpezi pe medii de cultur solide i se
incubeaz
Se apreciaz concentraia minim bactericid - CMB n funcie de
prezena sau absena creterii culturii bacteriene pe mediile solide.
CMB este concentraia de antibiotic din ultima eprubet din care
prin subcultivare nu s-a obinut cretere bacterian.
22
Ziua 1

Se adaug 1 ml inocul cu
bacteria de testat (1*10
6

CFU/ml) n tuburi n
care s-au efectuat n
prealabil diluii de
antibiotic n mediu lichid
Martori:
C1 = Martor fr antibiotic
Viabilitatea trebuie testat
prin subcultivare pe mediu
lichid
C2 = Martor fr inocul
Concentraia inocului = 5*10
5
CFU/ml
Se incubeaz 35
o
C, 18-24 ore
128 64 32 16 8 4 2 C1 C2
64 32 16 8 4 2 1 C1 C2
23
Ziua 2
Se observ turbiditatea
vizual - MIC = 16 mg/l

Se subcultiv eprubetele
limpezi pe plci de geloz
cu ansa de 0,01 ml
64 32 16 8 4 2 1 C1 C2
0.01 ml se nsmneaz, se incubeaz la 35
o
C, 18-24 ore
64 32 16
Ziua 3
Se determin numrul de CFU pe
plci:
La 16 mg/l = 700 CFU/ml > 0.1%
of 5*10
5
CFU/ml (inocul)

In acest caz : MBC = 32 mg/l
Metoda diluiilor n bulion
Concentratia bacteriostatic (CMI)
Concentratia bactericid (CMB)
25
Modul de calcul al concentraiei minime bactericide

100% din concentraia inoculului = 5*10
5
CFU/ml

0.1% = [(5*10
5)
*0.1]/100 CFU/ml = 500 CFU/ml

Prin urmare n eprubeta cu concentraie bactericid de antibiotic
trebuie s existe o concentraie bacterian mai mica 500 CFU /ml
(5 colonii pe o plac nsmnat cu 0,01 ml mediu lichid, 500*0.01
= 5 CFU).
Dezavantaje:
Permite testarea unui singur antibiotic
Este laborioas i de durat



26
Plcile pentru microdiluii conin 96 godeuri de
plastic
Se poate efectua si pe stripuri ce contin 10-12
antibiotice
Se efectueaza simultan teste pentru mai multe
probe

Diluiile se prepar manual sau comercial
Antibioticele sunt liofilizate
Performana este bun dar costul este ridicat

27
Vizualizarea turbiditii
Cititor manual cu surs de lumin sau oglind
Cititoare automate















96 well microtiter plate
ug/ml
64 32 16 8 4 2
29
Procedur
Se efectueaza diluii de antibiotic n medii
gelozate topite care se toarn n plci
64 ug/ml 32 ug/ml 16 ug/ml
30
Procedur
nsmnarea inoculului bacterian (McFarland
No. 0.5)
Se folosete un dispenser Steers-Foltz care repartizeaz
1 microlitru de inocul
Incubare
Numrarea coloniilor
CMI
32 ug/ml