Anda di halaman 1dari 12

1

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID SERTA UJI


TOKSISITAS EKSTRAK METANOL
DARI ALGA COKLAT (Sargassum cristaefolium)



Disusun oleh :
Erine febrian (1101027)
Dosen pembimbing : Drs. Emizal, Msi, Apt




SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU
PROGRAM STUDY S-1
PEKANBARU
2012

2

BAB I
PENDAHULUAN

1. Latar Belakang
Kelautan meliputi hampir 70% dari permukaan bumi merepresentasikan sumber terbaik
bagi kekayaan bahan alam planet ini. Berbagai literature mengemukakan bahwa banyak hasil
bahan alam kelautan yang mempunyai bioaktivitas antitumor Indonesia memiliki potensi alga
sangat tinggi dengan panjang pantai sekitar 81.000 Km (Bengen, 2001). Tercatat sedikitnya ada
555 jenis alga di perairan Indonesia. Sebanyak 555 jenis dalam 4 suku alga yang dikenal, yakni
alga biru (Cyanophyceae), alga hijau (Chlorophyceae) alga coklat (Phaeophyceae) dan alga
merah (Rhodophyceae). Sargassum cristaefolium merupakan salah satu golongan alga coklat
(Phaeophyceae). Makroalga jenis ini belum banyak dimanfaatkan dan dibudidayakan oleh
masyarakat Indonesia. Sargassum merupakan alga multiseluler yang diduga memiliki senyawa-
senyawa hasil metabolisme sekunder berupa alkaloid atau flavonoid. Senyawa senyawa tersebut
kemungkinan merupakan senyawa bioaktif yang dapat digunakan dalam dunia pengobatan,
misalnya sebagai antikanker (Khurniasari, 2004).
Sargassum merupakan alga coklat (Phaeophyceae) multiseluler yang diduga memiliki
senyawasenyawa metabolisme sekunder berupa alkaloid atau flavonoid. Senyawa-senyawa
tersebut kemungkinan merupakan senyawa bioaktif yang dapat digunakan dalam dunia
pengobatan, misalnya sebagai antikanker. Telah dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa
golongan flavonoid serta uji toksisitas ekstrak methanol Sargassum cristaefolium. Ekstraksi
dilakukan dengan cara maserasi bertingkat, menghasilkan ekstrak kloroform, ekstrak aseton dan
3

ekstrak metanol. Ketiga ekstrak yang diperoleh diuji aktifitasnya dengan hewan uji larva udang
Artemia salina L dengan metode BSLT.

Rumusan Masalah
Apakah kandungan senyawa bioaktif flavonoid yang terkandung dalam ekstrak alga
coklat S. cristaefolium. Apakah ekstrak senyawa yang terdapat pada S. cristaefolium mempunyai
daya toksisitas sehingga memiliki potensi untuk dikembangkan dalam dunia pengobatan seperti
antikaknker atau antitumor.

Tujuan Penelitian
Isolasi dan Identifikasi senyawa flavonoid yang terdapat dalam S. cristaefolium.
Mengetahui daya toksiksitas ekstrak senyawa pada S. cristaefolium sebagai uji pre-
skrening awal untuk senyawa yang memiliki potensi dalam dunia pengobatan
Manfaat Penelitian
Dapat memberikan informasi tentang metode isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid
dari S. cristaefolium.
Memberikan informasi tentang daya toksisitas ekatrak senyawa dari S. cristaefolium
sehingga dapat menjadi dasar pertimbangan untuk mengetahui potensi bioaktif senyawa
sebagai salah satu alternatif bagi pengobatan berbasis bahan alam.
Memberikan informasi kandungan senyawa dari S. cristaefolium sehingga dapat
dimanfaatkan secara optimal dan dapat memberikan nilai tambah dan nilai ekonomis
serta peluang baru bagi pengembangan lahan usaha budidaya laut khususnya alga coklat
4

yang bermanfaat dalam peningkatan pendapatan dan kesejahteraan masyarakat pesisir
pada umumnya





















5

Prosedur Penelitian
Ekstraksi Metabolit Sekunder S. cristaefolium
Alga coklat S. cristaefolium yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari perairan
Sumenep sekitar 10-20 %.
Sampel dalam bentuk serbuk halus kering digunakan untuk diekstraksi. Ekstraksi
senyawa bioaktif dari S. cristaefolium menggunakan metode maserasi bertingkat.
Sebanyak 500 gram sampel diekstraksi menggunakan pelarut dengan kepolaran berbeda.
Pelarut non polar kloroform sebanyak 1 liter (1000 ml) selama 24 jam pertama kemudian
disaring. Maserasi dengan pelarut kloroform ini sebanyak 3 kali.
Setelah itu ampas dikeringkan hingga terbebas dari pelarut kloroform dan dimaserasi
kembali selama 24 jam menggunakan pelarut semi polar aseton sebanyak 1 liter (1000
ml) kemudian disaring. Maserasi dengan pelarut aseton ini sebanyak 2 kali.
Setelah itu ampas kembali dikeringkan sampai terbebas dari pelarutnya.
Selanjutnya dimaserasi kembali dengan pelarut polar yaitu metanol sebanyak 1 liter
(1000 ml) selama 24 jam kemudian disaring. Maserasi dengan pelarut metanol ini
sebanyak 2 kali.
Ketiga ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotary vacuum evaporator pada suhu
600C sampai diperoleh ekstrak pekat kloroform, aseton, dan metanol. Asumsi
perbandingan pelarut kloroform, aseton, dan methanol dengan sampel secara berturut-
turut sebanyak 6:1, 4:1 dan 4:1.

Ketiga ekstrak pekat yang diperoleh selanjutnya diuji toksisitasnya dengan mengunakan larva
udang Artemia salina L.
6


Uji Toksisitas Ekstrak Metode BSLT
Prosedur kerja :
1) Media penetasan berupa air laut buatan dengan melarutkan garam dapur sebanyak 38
gram dalam 1000 ml air tawar sehingga salinitas air berkisar 32- 35 ppm. Salinitas ini
sesuai dengan salinitas habitat hidup alami dari A. salina L.
2) Media penetasan ini ditempatkan dengan pencahayaan yang cukup. Wadah penetasan A.
salina L menggunakan botol plastik transparan ukuran volume 1500 ml yang
dimodifikasi dengan perlengkapan aerasi kuat Sebanyak 1 gram kista
3) A. salina L dimasukan dalam media 1500 ml air laut buatan dengan pemberian aerasi
yang cukup. Suhu penetasan adalah 25-300C dan pH 6-7. Telur akan menetas setelah
18-24 jam dan larvanya disebut nauplii. Nauplii siap untuk uji BSLT setelah larva ini
berumur 48 jam (Subyakto, 2003).
4) Konsentrasi masing-masing sampel dibuat 5 konsentrasi berbeda yaitu 6,25 g/mL, 12,5
g/mL, 25 g/mL, 50 g/mL, dan 100 g/mL dan masingmasing dengan kontrol (0
g/mL).
5) Ekstrak pekat kloroform, aseton dan metanol ditimbang sebanyak 50 mg dan dilarutkan
dengan menggunakan 5 ml pelarutnya masing-masing. Selanjutnya, larutan dipipet
masing-masing sebanyak 500 L, 250 L, 125 L, 62,5 L, dan 31,25 L, kemudian
dimasukkan ke dalam botol vial, pelarutnya diuapkan selama 24 jam.
6) Masing-masing vial dimasukkan 2 mL air laut, 10 l dimetil sulfoksida (DMSO) sebagai
emulsigator, 10 ekor larva udang, dan setetes larutan ragi roti, kemudian ditambahkan air
7

laut sampai volumenya menjadi 5 mL, sehingga konsentrasi masing-masing menjadi 100,
50, 25, 12,5 dan 6,25 ppm.
7) Pada control dimasukkan 2 mL air laut dalam botol vial, 10 L dimetil sulfoksida, 10
ekor larva A. salina L dan setetes larutan ragi roti, kemudian ditambahkan air laut sampai
volumenya menjadi 5 mL. Pengamatan Uji Toksisitas ini untuk mengetahui nilai Lethal
Concentration 50 (LC50) dengan menghitung jumlah larva A. salina yang mati setelah
perlakuan dengan pemberian ekstrak senyawa dengan konsentrasi berbeda dari S.
cristaefolium setelah 24 jam dari perlakuan.

Uji Fitokimia Metabolit Sekunder
a. Pemeriksaan Falvonoid, Fenolik dan Saponin.
Flavonoid
ekstrak air (aqueous extract) ditetesi larutan amoniak encer dan ditetesi asam
sulfat pekat. Terbentuknya warna kuning mengindikasikan adanya flavonoid.
Cara lain dengan menambahkan HCl pekat dan beberapa butir serbuk magnesium
ke dalam ekstrak air. Pewarnaan oranye sampai merah mengindikasikan adanya
flavonoid.
Fenolik
ekstrak dalam tabung reaksi ditetesilarutan FeCl3. Pewarnaan biru atau biru
keunguan menunjukkan positif fenolik.
Saponin,
8

ekstrak dalam tabung reaksi dikocok kuat, pembentukan busa permanen (sekitar
15 menit) dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl pekat menunjukkan
positif adanya saponin.

b. Pemeriksaan Alkaloid (Maldoni, 1991)
Penambahan larutan kloroform-amoniak 0,05 N pada ekstrak kloroform dalam
tabung reaksi kemudian ditambahkan H2SO4 2 N (10-20 tetes).
Pemberian pereaksi Meyer (1-2 tetes) dan pereaksi Dragendorff (1-2- tetes). Uji
positif alkaloid ditandai dengan adanya endapan putih yang relatif banyak (+4),
kabut putih tebal (+3), kabut tipis (+2) dan kabut putih tipis (+1) untuk uji
pereaksi Meyer dan pereaksi Dragendorff menunjukkan adanya endapan jingga
sampai merah coklat.
c. Pemeriksaan Terpenoid/Streoid (Libermann- Burchard : AC2O/H2SO4)
Pemberian anhidrida asam asetat (AC2O) sebanyak 1-2 tetes dalam ekstrak
kloroform dan sebagai pembanding menggunakan H2SO4 pekat (1-2 tetes).
Perubahan warna menjadi merah atau merah keunguan mengindikasikan terpenoid
dan hijau atau hijau kebiruan untuk streoid.
Uji terpenoid (Salkowski Test) dengan pemberian H2SO4 pekat pada ekstrak
kloroform sehingga terbentuk 2 lapisan fasa cair. Terbentuknya warna coklat
kemerahan pada antar muka lapisan menunjukkan adanya terpenoid.

Isolasi Senyawa Bioaktif Flavonoid
KLT Kualitatif
9

1) Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan plat silika gel F254 dengan ukuran 2 X
10 cm.
2) Ekstrak pekat S. cristaefolium ditotolkan pada plat silika jarak 1 cm dari bagian bawah
dengan pipa kapiler. Selanjutnya, dikeringkan dan dielusi dalam larutan eluen yang
dipersiapkan sesuai dengan tujuan senyawa apa yang akan diisolasi.
3) Larutan eluen ditempatkan pada bejana kaca dengan bagian tutup yang lebar. Selama
perendaman bejana ditutup agar media jenuh dengan larutan eluen. Ekstrak akan ditarik
ke atas oleh eluen sampai jarak 1 cm dari bagian atas plat. Plat selanjutnya dikeringkan.
4) Pengamatan warna yang muncul dibawah penyinaran sinar ultra violet dengan panjang
gelombang 256-366 nm. Plat disemprot dengan dengan pelarut dari campuran vanili 0,25
ml dan etanol 25 ml kemudian disemprotkan dengan H2SO4 untuk memperkuat
penampakan warna yang muncul pada plat.
5) Untuk mengetahui nilai RF dengan mengukur jarak antara titik awal dengan pusat bercak
yang dihasilkan senyawa dan dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan (jarak
yang ditempuh oleh pengembang). Eluen yang memberikan hasil terbaik akan digunakan
dalam pemisahan dengan KLT preparatif.
KLT Preparatif
1) Pemisahan dengan KLT preparatif menggunakan plat silika gel F254 dengan ukuran 10 X
20 cm. Ekstrak pekat hasil ekstraksi ditotolkan sepanjang plat pada jarak 1 cm dari garis
bawah dan 1 cm dari garis tepi.
2) Selanjutnya dielusi dengan menggunakan eluen yang memberikan hasil pemisahan
terbaik pada KLT kualitatif.
10

3) Noda yang diperoleh dikerok dan dilarutkan dengan metanol. Kemudian disentrifuge
untuk mengendapkan silikanya. Supernatan yang diperoleh dipekatkan sehingga
diperoleh isolat berdasarkan harga RF-nya.
Analisa HPLC kualitatif
1) Uji HPLC kualitatif dilakukan untuk mengetahui komposisi kandungan senyawa yang
terkandung dalam ekstrak Sargassum cristaefolium.
2) Untuk memastikan kemurnian dari isolat maka dilakukan analisis dengan menggunakan
metode HPLC analitik dengan komposisi gradien (eluen) metanol-air ada kolom fase
terbalik (reversed phase) C-18 (RP-18) dan detektor Photo Dioda Array untuk merunut
keberadaan senyawa utama.
3) Kemudian dilakukan isolasi senyawa utama dengan HPLC preparatif, Pada penggunaan
HPLC preparatif, dibuat gradient seoptimal dan sesingkat mungkin dengan cara
mengubah atau mengganti konsentrasi eluen. Selanjutnya, setelah didapatkan senyawa
utama, dilakukan penentuan struktur dengan metode spektroskopis.
Identifikasi Senyawa Bioaktif Flavonoid
Spektrofotometri UV-vis
1) Isolat hasil KLT dimasukkan ke dalam kuvet dan diamati spektrumnya pada panjang
gelombang 200- 600 nm.
2) Identifikasi dilanjutkan dengan penambahan pereaksi geser NaOH 2 M. AICl3 5 %,
NaOAc, H3BO3, kemudian diamati pergeseran puncak serapannya. Tahapan prosedur
penggunaan pereaksi geser sebagai berikut :
Isolat yang diduga sebagai senyawa utama diamati pada panjang gelombang 200-
600 nm, direkam dan dicatat hasilnya.
11

Isolat dari tahap 1 ditambahkan 3 tetes NaOH 2 M kemudian dikocok sehingga
homogen dan diamati hasilnya.
Isolat tahap 1 ditambahkan 6 tetes pereaksi AICl3 5 % dalam metanol kemudian
dicampur hingga homogen dan diamati hasilnya.
Isolat tahap 1 ditambahkan serbuk NaOAc kirakira 250 mg, campuran dikocok
sampai homogeny dan diamati spektrumnya, selanjutnya ditambahkan serbuk
H3BO3 kira-kira 150 mg dikocok sampai homogen dan diamati spektrumnya.
Spektrometri Infrared
Isolat hasil KLT preparatif yang menunjukkan adanya senyawa utama berdasarkan identifikasi
dengan spetrofotometri UV-vis diuapkan pelarutnya. Isolat pekat diteteskan pada pelet KBr,
dikeringkan kemudian dibuat spektrumnya.

HASIL
Hasil uji toksisitas ekstrak adalah ekstrak klorofom dengan nilai LC50 sebesar 1,88 ppm,
ekstrak aseton dengan nilai LC50 sebesar 3,97 ppm dan
ekstrak methanol dengan nilai LC50 sebesar 3,02 ppm.
Ketiga ekstrak termasuk dalam kategori bersifat sangat toksik.
Uji golongan fitokimia senyawa ekstrak metanol S. cristaefolium mengandung beberapa
senyawa diantaranya flavonoid, flavon, alkaloid, terpenoid dan steroid. Isolasi ekstrak metanol
dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) kualitatif dan preparatif dengan eluen
toluen:eter:asam asetat (10:10:2) serta analisa HPLC kualitatif. Analisa Identifikasi isolat dengan
spektrofotometri UV-vis menggunakan pereaksi geser dan Spektrofotometri Infrared (FT-IR).
12

Hasil identifikasi menggunakan UV-visual dan IR bahwa isolat yang diperoleh diduga
merupakan senyawa golongan flavonoid yakni 5,6,7,- dihidroflavonol.

KESIMPULAN
Hasil skrining fitokimia (uji golongan) senyawa ekstrak metanol S. cristaefolium
mengandung beberapa senyawa diantaranya flavonoid, flavon, alkaloid, terpenoid dan
steroid. Hasil analisis dengan spektroskopi UV-visual dan spektroskopi infrared (IR)
diduga golongan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak metanol S. cristaefolium
adalah senyawa 5,6,7,-dihidroflavonol yang diperoleh dari isolat noda ke 4 pada KLT
kualitatif dengan nilai Rf 0,77 cm.
Hasil uji toksisitas dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) ekstrak kasar
senyawa dari S. cristaefolium diperoleh nilai LC50 dari masingmasing ekstrak yaitu
ekstrak kloroform sebesar 1, 88 ppm yang merupakan ekstrak paling toksik, diikuti oleh
ekstrak metanol dengan nilai sebesar 3,20 ppm dan ekstrak aseton sebesar 3,97 ppm. Hal
ini menunjukkan bahwa ketiga ekstrak senyawa dari S. cristaefolium mempunyai
prospek dapat dikembangkan sebagai sumber senyawa bioaktif dalam dunia farmasi,
misalnya sebagai antitumor atau antikanker.