I.

PENDAHULUAN


1.1 LATAR BELAKANG

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis
material untuk mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara
tradisional, kimia analitik dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif.
Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau
senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis kuantitatif
bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu
cuplikan.
Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target
dan metode. Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia
bioanalitik, analisis material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik.
Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi,
spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi, mikroskopi,
dan elektrokimia.
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur
yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini
membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang
lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang
stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa
gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang
dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-
cair (Day dan Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen campuran
sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang
mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang
mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Sekarang ini,
kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.
Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam,salah satu jenisnya adalah
HPLC( High Performance Liquid Chromatography) atau dapat disebut
KCKT(Kromatografi cair kinerja tinggi). HPLC didefinisikan sebagai
kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara
kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase
gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai
tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan
waktu yang relative singkat. HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan;
bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Dalam makalah ini akan
dijelaskan beberapa keterangan tentang penggunaan HPLC ( High Performance
Liquid Chromatography).

1.2 RUMUSAN MASALAH
Berdasarkan latar belakang diatas , maka permasalahan yang akan dibahas
makalah ini adalah :
a. Apa yang di maksud dengan HPLC ?
b. Bagaimana prinsip kerja dari HPLC ?
c. Apa saja komponen utama dari HPLC?
d. Apa saja jenis jenis injector pada HPLC?
e. Apa saja jenis jenis detector pada HPLC?

1.3 TUJUAN
Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah :
a. Untuk mengetahui pengertian dari HPLC.
b. Untuk mengetahui prinsip kerja dari HPLC.
c. Untuk mengetahui komponen komponen utama dalam HPLC.
d. Untuk mengetahui jenis jenis injector pada HPLC.
e. Untuk mengetahui jenis jenis detector pada HPLC.



II. PEMBAHASAN
2.1 Pengertian HPLC ( High Performance Liquid Chromatography).
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut
dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun
1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam
sediaan farmasetik. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang
lebih dikenal dibandingkan dengan kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT)
merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun
kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai titik
didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas.
Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya
yaitu berdasarkan pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2
komponen yang berbeda fasanya (fasa diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari
fasa diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan, resin penukar ion,
atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair
dengan aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan
pada temperatur rendah serta dengan adanya kompetisi 2 fase (gerak dan diam).
Migrasi dari molekul komponen akan sebanding dengan koefisien distribusinya,
maka komponen dengan distribusi tinggi pada fase diam akan bergerak lebih
perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang
distribusinya rendah.
Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram
menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja
sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode
yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-
protein dalam cairan fisiologis;menentukan kadar senyawa aktif obat, produk
hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan
farmasi. Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure
(tekananrendah), dan High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai
satuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas
karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendin
gin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong,
jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak
terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan
pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi
bleeding. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam
kolom konstan sehingga KD tetap.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan
fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini
jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali
cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang
dianalisis.
Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan
panas
Banyak pilihan fasa geraknya
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang
dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan
rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa
diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk
mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia
dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-
detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll
dapat juga digunakan dalam HPLC
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) .
Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang
diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi
untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar
ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC
tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan
dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan
prosedur khusus.


2.2 Prinsip Kerja HPLC
Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah
pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase
mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan
eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel yang mengandung
hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan
tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.
Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa
dalam eluat;
a. Fasa Normal Fasa gerak nonpolar Fasa diam polar
b. Fasa Terbalik Fasa gerak polar Fasa diam nonpolar
Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat
ditingkatkan dengan mengoptimasi parameter-parameter HPLC yaitu
retensi,selektifitas, dan efisiensi. Secara praktis parameter- parameter HPLC
tersebt dapat dioptimalkan dengan mengubah:
1. Komposisi dari fase gerak
2. Laju alir
3. Sifat kimia dari fase gerak
4. Jenis kolom Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan
sekaligus kualitatif.
Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel
dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya.
Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
Keterangan :
A = Peak area = Luas puncak
C = Konsentrasi X = sampel
P = pembanding
Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan
dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar. HPLC yaitu alat yang
berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam (yaitu sebuah
tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan
memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel
yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan
diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang
kolom.
Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik. Waktu
saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu
karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan
kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan
menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-
zat organik seperti metanol. HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti
asam formiat dan asam asetat. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus
di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang
tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa
menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

2.3 Komponen Komponen utama HPLC
1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya
polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama
elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi
bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks
terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

2.Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon,
dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan
sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3
mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan
pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan
tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional,yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugussilanol(Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang
lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi
lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil
(nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang
tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut
pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan
karakteristik detektor seperti berikut :
Detektor Sensitifitas
(g/ml)
Kisaran
linier
Karakteristik
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter
Spektrofotometer
spektrometerphoto-
diode array
5 x 10
-10

5 x 10
-10
> 2 x 10
-10

10
4

10
5

10
5

Sensitivitas bagus,
paling sering digunakan,
selektif terhadap gugus-
gugus dan struktur-
struktur yang tidak jenuh.
Fluoresensi 10
-12
10
4
Sensitifitas sangat
bagus, selektif, Tidak
peka terhadap perubahan
suhu dan kecepatan alir
fase gerak.
Indeks bias 5 x 10
-7


10
4
Hampir bersifat
universal akan tetapi
sensitivitasnya sedang.
Sangat sensitif terhadap
suhu, dan tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri

10
-8

10
-12


10
4

10
5


Peka terhadap
perubahan suhu dan
kecepatan alir fase gerak,
tidak dapat digunakan
pada elusi bergradien.
Hanya mendeteksi solut-
solut ionik. Sensitifitas
sangat bagus, selektif
tetapi timbul masalah
dengan adanya
kontaminasi elektroda.

6. Recorder
Recorder berfungsi sebagai sistem pencatat yang mampu menampilakan
kromatogram dengan jelas tepat dan cukup peka. Recorder ini mampu
menampilkan puncak-puncak kromatogram dengan jelas dan tidak terganggu
oleh noise listrik.
Berikut adalah instrument dari alat HPLC :


2.4 Jenis Jenis Injektor pada HPLC
Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom),
diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada
dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system
injector, yaitu:
a. Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,
system tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena
difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang
digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja
sampa 60 70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-
pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan
secara manual). Pada posisi load, sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja
atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.





Alat untuk memasukan sampel ke dalam system HPLC
Pump Pump



Column Column
INJECT
LOAD
SISTEM SAMPEL LOOP INJEKTOR


Injektor memiliki 6 terminal yang berfungsi sebagai saklar. Pada saat posisi
"LOAD" pompa langsung terhubung pada kolom separasi dan sampel terisi
kedalam stainless steel tube (loop) , pada posisi "INJECT" pompa terhubung
langsung denganstainless steel tube (loop) dan mengalir kedalam kolom
separasi. Sistem ini memungkinkan untuk membuang sisa kelebihan sampel
yang akan diinjeksikan sehingga diharapkan volume sampel yang masuk
kedalam kolom lebih teliti.

2.5 Jenis Jenis Detektor pada HPLC
Tinggi Kromatografi cair berperforma (atau kromatografi cair tekanan
tinggi, HPLC) merupakan bentuk kromatografi kolom sering digunakan dalam
biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan
memanjang

HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic bahan
kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s)
melalui kolom, dan detektor yang menunjukkan ingatan waktu
Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung pada interaksi antara keadilan
tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang digunakan.
Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan
dengan tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam,
tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. HPLC
mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak
pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor merupakan suatu bagian integral
dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern.

Klasifikasi Detektor
Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
a. Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh
molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector).
Detektor dapat dibedakan menjadi :
Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah
detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak
murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga
dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang
sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap
perubahan suhu.
Detektor konduktivitas
Detektor tetapan dielektrika
b. Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut
solute property detector).
Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,
Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan
pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar
tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor
yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya
yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan
untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi
dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV
yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang
diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang
digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic
menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.
Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC.
Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari
komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.
Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..
2) Memerlukan pemisahan fase ferak terlebih dahulu
Termasuk didalamnya FID dan ECD.



Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam,
yaitu:
1. Detektor spektrofotometrik
Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan
secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan
panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang
maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan
sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan
dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus
berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang
modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal, sehingga
dibutuhkan suatu kompromi. Dibandingkan dengan ribuan dollar yang
harus dikeluarkan untuk spektrofotometer yang hanya bahkan tergolong
kelas dua saja, maka $2500 atau sekitar itu akan mendapatkan sebuah
detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada 254 atau 280 nm
(harga-harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan
penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber
kontinyu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana
mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri.
Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi,
tetapi detektor-detektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak
kasus. Contohnya, protein yang menyerap semua pada 280 nm akibat
adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir semua senyawa
aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin,
pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada
254 nm.
Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat
terlarut dan panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita
dan panjang jalan yang melewati sel detektor, tetapi sebagai pedoman
kasar, detektor ultraviolet akan dapat melihat kuantitas nanogram, bisa
kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor
indeks bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap
temperatur.
2. Detektor Fluorometrik
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa.
Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang
terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang
lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator,
biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk
mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan
radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada
sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang
gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi
dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan,
seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang
biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-
kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana
komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi
turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah
pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi
dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).
3. Detektor Elektrokimia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik
(konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya
digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi
redoks baik senyawa organic maupun anorganik.
Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana
larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi
potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen smpel
mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah
digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di
dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-
senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik
menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi
potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida.
Elektroda referensi pada umumnya melewati semacam jembatan garam.
4. Desain detector
Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk
hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus
mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang
turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa
mikroliter.
5. Pemilihan detektor
Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang
umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut :
a. cukup sensitive
b. stabilitas dan keterulangan tinggi
c. respon linear terhadap solute
d. waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir
e. relibilitas tinggi dan mudah digunakan
f. tidak merusak cuplikan.
Dari berbagai macam detector yang ada detektor indeks bias merupakan
satu-satunya detektor pada HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv
dan sangat peka tehadap perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan
panjang gelombang yang variabel merupakan pilihan yang paling baik
bagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangat spesifik
dapat digunakan detektor-detektor fluorometer dan elektrokimia.






III. PENUTUP

3.1 KESIMPULAN
1. HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan
memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang
distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir
dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga
menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative
singkat.
2. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah
pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase
mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan
eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel yang
mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang
lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.
3. Komponen-komponen utama dari HPLC yaitu :
a. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
b. Pompa
c. Injektor
d. Kolom dan Fase diam
e. Detektor
f. Rekorder
4. Jenis Jenis Injektor dalam HPLC :
a. Stop flow
b. Septum
c. Loop vaive
5. Jenis jenis detector pada HPLC :
a. Detektor spektrofotometrik
b. Detektor Fluorometrik
c. Detektor Elektrokimia