Anda di halaman 1dari 139

0

MODUL



ANALISIS
MIKROBIOLOGI
Yusi Nurmayasari, S.Si
KELAS XI KIMIA ANALISIS
SMK BINA PUTERA NUSANTARA


1
DAFTAR ISI

DEFINISI DAN SEJARAH MIKROBIOLOGI ........................................................................... 3
ANGGOTA DUNIA MIKROBA ............................................................................................. 7
BAB 1 MEDIA PERTUMBUHAN ..................................................................................... 13
BAB 2 STERILISASI ......................................................................................................... 21
BAB 3 ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME ................................................... 29
BAB 4 MORFOLOGI MIKROORGANISME ...................................................................... 36
BAB 5 PEMINDAHAN DAN PENGAWETAN MIKROORGANISME .................................. 58
BAB 6 PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME ... 68
BAB 7 MENENTUKAN JUMLAH DAN UKURAN MIKROORGANISME ............................ 80
BAB 8 UJI REAKSI ENZIMATIS ....................................................................................... 95
BAB 9 ANALISA MIKROBA DALAM AIR ....................................................................... 108
BAB 10 ANALISA MIKROBA DALAM MAKANAN ........................................................... 115
BAB 11 DAYA KERJA ANTI MIKROBA ............................................................................. 125
BAB 12 MONITORING KESTERILAN ............................................................................... 134















2

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah swt., karena atas ridha dan
hidayahNya penulisan modul Analisis Mikrobiologi untuk SMK Bina Putera
Nusantara ini dapat terselesaikan dengan baik. Tidak lupa kami ucapkan terima kasih
kepada semua pihak yang telah membantu terlaksananya penulisan modul hingga
dapat digunakan sebagai bahan ajar di jurusan Kimia Analisis SMK Bina Putera
Nusantara Tasikmalaya.
Modul ini kami susun dengan harapan dapat membantu siswa untuk
memahami materi dasar mikrobiologi dan menguasai cara-cara untuk melaksanakan
anlisis dalam mikrobiologi. Penyajian materi modul ini disesuaikan dengan silabus
pembelajaran sebagaimana tertuang dalam kurikulum SMK Bina Putera Nusantara.
Semoga modul ini dapat memberi motivasi baru kepada peserta didik untuk
belajar dengan lebih baik. Penulis menyadari bahwa penulisan modul ini masih jauh
dari sempurna. Oleh karena itu kami mengharapkan kritik dan saran yang sifatnya
membangun demi perbaikan modul ini di masa yang akan datang.

Tasikmalaya, Agustus 2010

Penyusun



3





Mikrobiologi adalah sebuah cabang dari ilmu biologi yang
mempelajari organisme yang terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan jelas
menggunakan mata telanjang; kajian ini mencakup bakteri, archaea, protozoa, algae
mikroskopik, dan fungi. Beberapa mikroba (seperti algae dan jamur) cukup besar
untuk dapat dilihat dengan mata telanjang, namun kedua organisme masih
dimasukkan dalam kajian mikrobiologi, hal ini karena teknik yang digunakan untuk
mengkajinya (seperti isolasi, sterilisasi, kultivasi dalam media artifisial) sama seperti
anggota mikroorganisme lainnya. Virus sering juga dimasukkan walaupun
sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap sebagai makhluk hidup.
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari mikroba. Mikrobiologi adalah
salah satu cabang ilmu dari biologi, dan memerlukan ilmu pendukung kimia, fisika,
dan biokimia. Mikrobiologi sering disebut ilmu praktek dari biokimia. Dalam
mikrobiologi dasar diberikan pengertian dasar tentang sejarah penemuan mikroba,
macam-macam mikroba di alam, struktur sel mikroba dan fungsinya, metabolisme
mikroba secara umum, pertumbuhan mikroba dan faktor lingkungan, mikrobiologi
terapan di bidang lingkungan dan pertanian. Mikrobiologi lanjut telah berkembang
menjadi bermacammacam ilmu yaitu virologi, bakteriologi, mikologi, mikrobiologi
pangan, mikrobiologi tanah, mikrobiologi industri, dan sebagainya yang mempelajari
mikroba spesifik secara lebih rinci atau menurut kemanfaatannya.
Whittaker membagi jasad hidup menjadi tiga tingkat perkembangan, yaitu:
(1)Jasad prokariotik yaitu bakteri dan ganggang biru (Divisio Monera), (2) Jasad
eukariotikuniseluler yaitu algae sel tunggal, khamir dan protozoa (Divisio Protista),
dan (3) Jasadeukariotik multiseluler dan multinukleat yaitu Divisio Fungi, Divisio
Plantae, dan DivisioAnimalia. Sedangkan Woese menggolongkan jasad hidup
Definisi &


4
terutama berdasarkansusunan kimia makromolekul yang terdapat di dalam sel.
Pembagiannya yaitu terdiri Arkhaebacteria, Eukaryota (Protozoa, Fungi, Tumbuhan
dan Binatang), dan Eubacteria.

Ciri Umum Mikroba
Mikroba di alam secara umum berperanan sebagai produsen, konsumen,
maupun redusen. Jasad produsen menghasilkan bahan organik dari bahan anorganik
dengan energi sinar matahari. Mikroba yang berperanan sebagai produsen adalah
algae dan bakteri fotosintetik. Jasad konsumen menggunakan bahan organik yang
dihasilkan oleh produsen. Contoh mikroba konsumen adalah protozoa. Jasad
redusen menguraikan bahan organik dan sisa-sisa jasad hidup yang mati menjadi
unsur-unsur kimia (mineralisasi bahan organik), sehingga di alam terjadi siklus
unsur-unsur kimia. Contoh mikroba redusen adalah bakteri dan jamur (fungi).
Sel mikroba yang ukurannya sangat kecil ini merupakan satuan struktur
biologi. Banyak mikroba yang terdiri dari satu sel saja (uniseluler), sehingga semua
tugas kehidupannya dibebankan pada sel itu. Mikroba ada yang mempunyai banyak
sel (multiseluler). Pada jasad multiseluler umumnya sudah terdapat pembagian
tugas diantara sel atau kelompok selnya, walaupun organisasi selnya belum
sempurna.
Setelah ditemukan mikroskop elektron, dapat dilihat struktur halus di dalam
sel hidup, sehingga diketahui menurut perkembangan selnya terdapat dua tipe
jasad, yaitu:
1. Prokariota (jasad prokariotik/ primitif), yaitu jasad yang perkembangan
selnya belum sempurna.
2. Eukariota (jasad eukariotik), yaitu jasad yang perkembangan selnya telah
sempurna.
Selain yang bersifat seluler, ada mikroba yang bersifat nonseluler, yaitu virus.
Virus adalah jasad hidup yang bersifat parasit obligat, berukuran super kecil atau
submikroskopik. Virus hanya dapat dilihat dengan mikroskop elektron. Struktur virus
terutama terdiri dari bahan genetik. Virus bukan berbentuk sel dan tidak dapat
membentuk energi sendiri serta tidak dapat berbiak tanpa menggunakan jasad
hidup lain.

Sejarah Mikrobiologi
1626-1697 Francesco Redi, membantah konsep generasi spontan dengan menunjukkan
bahwa belatung pada daging busuk berasal dari telur lalat yang meletakkan
telur pada daging tersebut, bukan dari daging itu sendiri
1713-1781 John Needham, mendukung teori generasi spontan dengan menunjukkan
bahwa kaldu yang dipanaskan dalam labu dan kemudian ditutup masih
dapat memunculkan mikroorganisme.


5
1729-1799 Lazzaro Spallanzani, menunjukkan bahwa labu yang ditutup dan kemudian
dididihkan tidak ada mikroorganisme yang tumbuh, dan menyatakan bahwa
udara yang masuk ke labu medium membawa benih, dan udara mungkin
diperlukan untuk mendukung pertumbuhan organisme yang sudah ada di
medium.
1822-1895 Louis Pasteur, menjebak organisme yang terbawa udara dalam kapas, dia
juga memanaskan leher labu angsa, mensteril meida, membiarkan labu
terbuka; hasil percobaan menunjukkan tidak ada pertumbuhan organisme
sebab partikel debu yang membawa organisme tidak mencapai medium;
namun debu terjebak dalam leher labu; jika leher labu dipecah, debu akan
mencapai medium dan organisme akan tumbuh; dengan cara ini, Pasteur
telah mematahkan teori generasi spontan
1820-1893 John Tyndall, menunjukkan bahwa debu membawa mikroba dan jika debu
tidak ada, medium tetap steril, bahkan jika medium terkena udara. Tydall
juga memberikan bukti keberadaan bakteri yang resisten panas.
1773-1856 Agostino Bassi , menunjukkan bahwa penyakit ulat sutra disebabkan jamur
1845 M. J. Berkeley, menunjukkan bahwa penyakit kentang (the Great Potato
Blight) Irlandian disebabkan oleh jamur
1822-1895 Louis Pasteur, menunjukkan bahwa penyakit (pine) ulat sutra disebabkan
oleh parasit protozoa
1872-1912 Joseph Lister, menunjukkan suatu sistem pembedahan yang dirancang
untuk mencegah mikroorganisme menginfeksi luka bedah, sehingga pasien
jauh lebih sedikit yang terinfeksi pascaoperasi; Lister memberikan bukti
tidak langsung bahwa mikroorganisme adalah agen penyebab penyakit
manusia
1843-1910 Robert Koch, yang menggunakan kritetia yang dikembangkan oleh
gurunya, Jacob Henle (1809-1895), dapat menjelaskan hubungan
antara Bacillus anthracis and anthrax; kriterianya dikenal sebagai postulat
Koch dan masih digunakan untuk menjelaskan hubungan antara
mikroorganisme tertentu dengan penyakit tertentu.










Robert Koch dan kawan-kawan mengembangkan teknik, reagen, dan
materi lain untuk mengkultur patogen bakteri pada media padat
pertumbuhan, dengan demikian mikrobiologis dapat mengisolasi mikroba
untuk mendapatkan kultur murni (tunggal).




Postulat Koch:
o Mikroorganisme harus ada di setiap kasus penyakit tetapi tidak ada pada
individu sehat.
o Mikroorganisme yang dicurigai (suspected) harus dapat diisolasi dan
ditumbuhkan dalam kultur murni.
o Penyakit yang sama harus timbul jika mikroorganisme hasil isolasi
diinokulasi tersebut pada individu sehat.
o Mikroorganisme yang sama harus ditemukan lagi dari individu yang sakit
tersebut



6
1851-1908 Charles Chamberland, membuat filter (saringan) bakteri untuk menapis
bakteri dan mikroba yang lebih besar dari spesimen; melalui teknik ini juga
memungkinkan ditemukannya virus sebagai agen penyebab penyakit.
1798 Edward Jenner , menggunakan prosedur vaksinasi untuk melindungi
individu dari penyakit cacar (smallpox)
1822-1895 Louis Pasteur, mengembangkan vaksin lain untuk penyakit kolera ayam,
antraks, dan rabies
1854-1917 Emil von Behring dan Shibasaburo Kitasato (1852-1931), menginduksi
pembentuk antitoksin toksin diptera pada kelinci; antitoksin digunakan
secara efektif untuk mengobati manusia dan memberikan bukti imunitas
humoral
1845-1916 Elie Metchnikoff, menunjukkan keberadaan sel fagositik dalam darah, yang
menunjukkan imunitas dimediasi sel
1856-1953 Sergei Winogradsky, yang bekerja dengan bakteri tanah menemukan
bahwa bakteri tanah dapat oksidasi besi, belerang, dan amonia untuk
mendapatkan energi; Winogradsky juga mengkaji fiksasi nitrogen anaerobik
dan dekomposisi selulosa
1851-1931 Martinus Beijerinck, mengisolasi bakteri pengikat nitrogen aerobik, suatu
bakteri bintil akar yang mampu menambat nitrogen, and bakteri pereduksi
sulfat. Beijerinck and Winogradsky memperkenalkan pertama kali
penggunaan kultur yang diperkaya dan media selektif.






















7





- Bakteri
Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas
dibandingkan mahluk hidup yang lain . Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang
hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim.
Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki
ciri-ciri yang membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah
organisme uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan
berukuran renik (mikroskopis).
Ciri-ciri Bakteri:
1. Organisme uniselluler
2. Prokariot (tidak memiliki membran inti sel )
3. Umumnya tidak memiliki klorofil
4. Memiliki ukuran tubuh yang bervariasi antara 0,12 s/d ratusan mikron umumnya
memiliki ukuran rata-rata 1 s/d 5 mikron.
5. Memiliki bentuk tubuh yang beraneka ragam
6. Hidup bebas atau parasit
7. Yang hidup di lingkungan ekstrim seperti pada mata air panas,kawah atau gambut
dinding selnya tidak mengandung peptidoglikan
8. Yang hidupnya kosmopolit diberbagai lingkungan dinding selnya mengandung
peptidoglikan
Bentuk Bakteri
Bentuk dasar bakteri terdiri atas bentuk bulat (kokus), batang (basil),dan spiral
(spirilia) serta terdapat bentuk antara kokus dan basil yang disebut kokobasil.
Berbagai macam bentuk bakteri :
1. Bakteri Kokus :

Anggota


8









a. Monokokus/ mikrokokus, yaitu berupa sel bakteri kokus tunggal
b. Diplokokus, yaitu dua sel bakteri kokus berdempetan
c. Tetrakokus yaitu empat sel bakteri kokus berdempetan berbentuk segi
empat sebagai hasil pembelahan sel ke dua arah.
d. Sarkina/ sarsina yaitu delapan sel bakteri kokus berdempetan
membentuk kubus hasil pembelahan sel ke tiga arah
e. Streptokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan
membentuk rantai sebagai hasil pembelahan sel ke satu atau dua arah
dalam satu garis.
f. Stafilokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan
seperti buah anggur
2. Bakteri Basil :










9
a. Monobasilus, yaitu berupa sel bakteri basil/ batang tunggal
b. Diplobasilus, yaitu berupa dua sel bakteri basil/ batang berdempetan
c. Streptobasilus, yaitu beberapa sel bakteri basil berdempetan membentuk
rantai
3. Bakteri Spirilia atau lengkung:





a. Spiral/ spirillium yaitu bentuk sel bergelombang, spiralnya tebal dan kaku
b. Spiroseta / spirochaeta yaitu bentuk sel seperti sekrup, spiralnya halus dan
lentur
c. Vibrio yaitu bentuk sel seperti tanda baca koma

- Archaea
Archaea atau arkea dikenal juga sebagai arkeabakteria, merupakan
organisme uniseluler yang tidak mempunyai nucleus (inti selnya tidak memiliki
membran inti) sehingga digolongkan sebagai prokariot.
Dulu arkea digolongkan sebagai kelompok bakteri yang tidak biasa dan
dinamakan arkeabakteria, tapi karena ternyata arkea mempunyai system biokimiawi
yang berbeda dengan bakteri, maka arkea diklasifikasikan sebagai domain yang
berbeda.
Arkea dan bakteri mempunyai kesamaan dalam hal ukuran dan bentuk,
walaupun beberapa jenis arkea mempunyai bentuk yang sangat tidak biasa, seperti
bentuk rata dan kotak (seperti Haloquadra walsbyi.). arkea bereproduksi secara
aseksual dan melakukan pembelahan biner, fragmentasi atau pertunasan (budding),
tapi berbeda dengan bakteri dan eukariot lain, arkea tidak membentuk spora


10
Awalnya arkea ditemukan di lingkungan yang ekstrem, seperti di sumber air
panas dan danau air asin, tapi sekarang sudah banyak dijumpai di berbagai habitat
seperti lumpur, laut dan rawa-rawa. Belum ditemukan adanya arkea yang bersifat
pathogen atau parasite, biasanya arkea bersimbiosis secara mutualisme atau
komensalisme dengan organisme lain.
- Protozoa
Istilah protozoa berasal dari bahasa Yunani, yaitu protos artinya pertama dan
zoon artinya hewan. Jadi,Protozoa adalah hewan pertama. Protozoa merupakan
kelompok lain protista eukariotik. Kadang-kadang antara algae dan protozoa kurang
jelas perbedaannya. Kebanyakan Protozoa hanya dapat dilihat di bawah mikroskop.
Beberapa organisme mempunyai sifat antara algae dan protozoa.
Protozoa dibedakan dari prokariot karena ukurannya yang lebih besar, dan
selnya eukariotik. Protozoa dibedakan dari algae karena tidak berklorofil, dibedakan
dari jamur karena dapat bergerak aktif dan tidak berdinding sel, serta dibedakan
dari jamur lendir karena tidak dapat membentuk badan buah.
Kelas Utama Protozoa:
Kelompok
Utama (Nama
Utama)
Cara Gerak
Cara
Berkembang
Biak
Ciri-ciri Lain
Mastighophora
(Flagelata)
Flagela (satu atau
lebih)
Pembelahan biner
membujur, pada
beberapa
kelompok ada
reproduksi seksual
Nutrisinya
fototropik,
heterotropik atau
keduanya
Sarcodina
(Amoeba)
Pseudopodia
Pembelahan biner,
tak ada reproduksi
seksual
Kebanyakan
spesies hidup
bebas,
heterotropik
Ciliata (siliata) Silia (banyak)
Pembelahan biner
melintang,
reproduksi seksual
dengan konjugasi
Kebanyakan
spesies hidup
bebas,
heterotropik


11
Sporozoa
(sporozoa)
Gerak dengan
meluncur atau
tidak bergerak
Pembelahan
bahurangkap,
mungkin ada mikro
gamet berflagela
pada reproduksi
seksual
Semua spesies
parasit

- Algae Mikroskopik
Algae adalah organisme eukariotik fotosintetik aerobic. Ukuran algae sangat
beragam, dari beberapa micrometer hingga beberapa meter. Organisme ini
mengandung klorofil serta pigmen-pigmen lain untuk melangsungkan
fotosintesis. Kebanyakan algae berukuran mikroskopis atau disebut sebagai
algae mikroskopis. Dan ilmu yang mempelajarinya disebut fikologi.
Algae biasanya terdapat sebagai sel tunggal yang berbentuk bola, batang,
gada atau kumparan. Ada yang dapat bergerak (dengan flagella) dan ada yang
tidak, bereproduksi secara asekaual dan seksual. Untuk yang berukuran makro,
ada yang multiseluler.
Di dunia mikrobia, algae termasuk eukariotik, umumnya bersifat fotosintetik
dengan pigmen fotosintetik hijau (klorofil), coklat (fikosantin), biru kehijauan
(fikobilin), dan merah (fikoeritrin). Morfologi algae ada yang berbentuk
uniseluler, ada pula yang multiseluler tetapi belum ada pembagian tugas pada
sel-sel komponennya. Algae dibedakan dari tumbuhan hanya karena hal
tersebut.

- Khamir
Pada umumnya, sel khamir lebih besar daripada kebanyakan bakteri, tapi
khamir yang paling kecil tidak sebesar bakteri paling besar. Ukurannya berkisar
antara 1-5 mikron (lebar) dan 5-30 mikron (panjang). Biasanya berbentuk bulat
telur tapi beberapa ada yang memanjang atau berbentuk bola. Khamir tidak
dilengkapi flagella atau alat gerak lainnya.
Pada dasarnya, tubuhnya hanya terdiri dari dua bagian, yaitu
miselium dan spora (sel resisten, istirahat atau dorman). Miselium merupakan
kumpulan beberapa filament yan g dinamakan hifa. Setiap hifa lebarnya 5-10
mikron (sel bakteri biasanya berdiameter 1 mikron). Ada tiga macam morfologi
hifa, yaitu aseptat, septat uninukleat dan septat multinukleat.


12
Khamir atau disebut yeast, merupakan jamur bersel satu yang
mikroskopik,tidak berflagela. Beberapa genera membentuk filamen
(pseudomiselium). Carahidupnya sebagai saprofit dan parasit. Hidup di dalam
tanah atau debu di udara, tanah,daun-daun, nektar bunga, permukaan buah-
buahan, di tubuh serangga, dan cairan yangmengandung gula seperti sirup, madu
dan lain-lain.Khamir berbentuk bulat (speroid), elips, batang atau silindris, seperti
buahjeruk, sosis, dan lain-lain. Bentuknya yang tetap dapat digunakan untuk
identifikasi.Khamir dapat dimasukkan ke dalam klas Ascomycetes,
Basidiomycetes danDeuteromycetes.

Gambar sel Khamir:













13


Pengertian dan Fungsi
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-
molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga
memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1. Bahan dasar
- air (H
2
O) sebagai pelarut
- agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit
didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45
o
C.
- gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer
asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih
banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
- Silicagel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga
sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan
media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel
yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan
unsur pelikan/trace element.
- Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik
atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan
sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam
organik.
- Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen
lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti
urea.
- Vitamin-vitamin.
Bab 1


14
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan
tujuan tertentu, misalnya phenolred (indikator asam basa) ditambahkan untuk
indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme.
Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba non-
target/kontaminan.
4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
- Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan
terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai
pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse
untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan
larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan
pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan
kekuatan agar, terutama pada pH yang asam
- Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti
otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.
Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara
memperolehnya.
- Meatextract. Meatextract mengandung basa organik terbuat dari otak,
limpa, plasenta dan daging sapi.
- Yeastextract. Yeastextract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat
alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B
complex).
- Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan
asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya
digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.
Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Macam-Macam Media Pertumbuhan
1. Medium berdasarkan sifat fisik
- Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah
dingin media menjadi padat.
- Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%
sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi
solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke
seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika
tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB


15
(NitrogenfreeBromthymolBlue) semisolid akan membentuk cincin hijau
kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini
dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk
mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media NitrateBroth,
kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi
bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
- Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB
(NutrientBroth), LB (LactoseBroth).
2. Medium berdasarkan komposisi
- Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
- Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui
secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar,
dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak
dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
- Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak
dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan
dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic
Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
- Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan
mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
- Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu
sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan
merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria
Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten
antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth
yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang
toleran terhadap garam.
- Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk
pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,
serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba
tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya
membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi


16
membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar,
Serum Agar, dll.
- Media untuk peremajaan kultur
- Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur
- Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme
suatu mikroba. Contohnya adalah Kosers Citratemedium, yang digunakan
untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber
karbon.
- Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu
mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya
perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine
Agar.
- Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya
berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya
TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria
berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di
sekeliling koloni.
Ciri-ciri beberapa bahan kompleks yang digunakan sebagai bahan pembuat media:
Bahan Mentah Ciri Nilai Nutrisi
Ekstrak daging sapi (beef
extract)
Suatau ekstrak cair
jaringan daging sapi yang
empuk, dikonsentrasikan
menjadi pasta
Mengandung karbohidrat,
senyawa nitrogen organic,
vitamin yang larut dalam
air dan berbagai garam
Pepton
Produk yang dihasilkan
dari bahan-bahan yang
mengandung protein
seperti daging, kasein, dan
gelatin
Sumber utama nitrogen
organic, dapat pula
mengandung vitamin dan
kadang-kadang
karbohidrat, bergantung
pada jenis bahan awal.
Agar
Suatu karbohidrat
kompleks yang diperoleh
dari algae marin tertentu
(agar laut), diolah untuk
membuang substansi yang
tidak dikehendaki
Digunakan sebagai bahan
pemadat media, bukan
sumber nutrient bagi
bakteri
Ekstrak khamir (yeast
extract)
Suatu ekstrak cair sel
khamir, tersedia juga
Suatu sumber yang sangat
kaya dengan vitamin B,


17
dalam bentuk bubuk
(komersial)
mengandung nitrogen
organic dan senyawa-
senyawa karbon

Pembuatan Nutrient Agar
1.Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk
volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
Beefextract 3 g
Peptone 5 g
Agar 15 g
Akuades s.d 1000 ml
2. Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian
untuk melarutkan Beefextract dan peptone dan sebagian lagi
untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar
lebih banyak
3. Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan
diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai
overheat, karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah).




4.Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef
extract, cukup dengan pengadukan.







18
5. Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai
homogen. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator. Jika
pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH.
6. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan
autoklaf.
7. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media tegak
atau miring pada point ke 5, media langsung dituang ke tabung kemudian
disterilisasi.

Pembuatan Nutrient Broth
Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai
pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana, tinggal melarutkan peptone
dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi
dan siap disterilisasi. Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas, peptone dan
beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk

Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
1. Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk
volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
Potato/kentang 3 g
Peptone 5 g
Agar 15 g
Akuades s.d 1000 ml
(sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)
2. Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak,
kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya
menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beakerglass baru.
3. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah
larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi.
4. Setelah semua larut, ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan
dihomogenkan. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.


19
5. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap
untuk disterilisasi.





2. 3. 4.




















20



Pengertian
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari
semua bentuk kehidupan.
Macam-macam sterilisasi
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik
dan kimiawi.
1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori
sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada
saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas,
misal nya larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
Pemanasan
a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung,
contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.
b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180
0
C. Sterilisasi panas
kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung
reaksi dll.
c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung
air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.
d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf
Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya
untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety
Cabinet dengan disinari lampu UV
3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara
lain alkohol.



Bab 2


21
Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)
Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah
rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi
dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum)
yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak
akan tersaring dengan metode ini.
Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :
Non-disposable filtration apparatus
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 20-1000 ml

Disposable filter cup unit
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml

Disposable filtration unit dengan botol penyimpan
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml

Syringe filters
- Ditekan seperti jarum suntik
- Volume 1-20 ml

Spin filters
- Ditekan dengan gaya setrifugasi
- Volume kurang dari 1 ml





22

Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus
Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld, Chamberland Zeitz),
membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung.
Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi corong
dengan larutan yang akan disterilkan.
Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa.
setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer,
maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril
dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.
Tyndalisasi
Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air dan
tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini.
Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan
bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan
terhidrolisis.
Cara kerja :
Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan
sumbat atau aluminium foil.
Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar
menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).
Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 100
0
C
kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan
mematikan mikroba).
Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.
Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang
waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang
belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.
Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization)
Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti
cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan
udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun)
didalam alat gelas.


23
Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil
Atur pengatur suhu oven menjadi 180
0
C dan alat disterilkan selama 2-3 jam.
Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet atau Laminar Air Flow
Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja
mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran
udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi
melalui filter.
BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Laminar flowhood atau
Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang
bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk menghambat udara
luar masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah kontaminasi dari luar dan
pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar disaring melewati
penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain.
Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.

TEKNIK KERJA ASEPTIS (TANPA KONTAMINASI)
Tehnik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga
sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi
terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan.
Dasar digunakannya tehnik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang
mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam
cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak
diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan.


24
Mikroorganisme dapat juga jatuh dari tangan operator, sarung tangan atau jas
laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan tehnik aseptik
meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya
tehnik aspetis tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan. Namun
semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang
ditimbulkan.

Tehnik aseptis digunakan pada saat :
- Teknik aseptis seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dan
dengan segala media pertumbuhannya.
- Teknik aseptis sebaiknya digunakan ketika kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak
berubah sifat akibat aktivitas mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun
buffer dengan konsentrasi garam tinggi atau mengandung deterjen.
- Teknik aseptis disarankan pada saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang
berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan diri
sendiri dari bahaya senyawa ini lebih penting.
Beberapa contoh :
- Mentransfer biakan dari media satu ke media lainnya. Bakteri kontaminan yang tumbuh
tentu saja dapat mengganggu kemurnian biakan dan mungkin saja membuat rancu hasil
yang didapatkan.
- Memfilter media atau serum dan menghitung jumlah bakteri dengan cara filtrasi.
Kontaminasi yang ikut tersaring dapat tumbuh pada media baru yang membuat tidak
terpakainya media pertumbuhan tersebut atau mempengaruhi jumlah total bakteri.
- Membuka dan merehidrasi bakteri terliofolisasi. Teknik aseptis dapat menjaga sel yang
terrehidrasi dari bakteri kontaminan dan menjaga tidak keluarnya sel ke meja kerja.
- Melakukan reaksi restriksi atau PCR. Walaupun enzim restriksi pada umumnya disimpan
dalam gliserol 50% (bakteriostatik) tapi enzim yang diencerkan akan lebih rentan rusak
akibat aktivitas mikroorganisme atau dihambat oleh ion atau unsur tertentu. Kontaminasi
DNA asing yang masuk ke dalam tube PCR mungkin dapat teramplifikasi sehingga hasil yang
didapat membingungkan.
- Melabeli sel dengan (32P) fosfat. Pada kasus ini kerja aseptis ditujukan untuk melindungi
operator dari bahan kimia berbahaya. Jika menggunakan teknik aseptis maka Anda tidak
akan membiarkan tutup bahan radioaktif terbuka atau secara tidak sengaja menggunakan
pipet bekas bahan radioaktif.

Aturan umum tehnik aseptis:
- Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya
tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan jauh
dari lalu-lintas orang. Penggunaan kabinet biosafety dapat menjaga dan mengatur aliran
udara tetapi ini bukan merupakan suatu jaminan mutlak dari resiko terkontaminasi.
- Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan.
Kultur tua atau pipet bekas seharusnya tidak berada di meja kerja. Kotoran seringkali sulit
dibersihkan pada sudut-sudut ruang.
- Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di


25
sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk membersihkannya.
Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah selesai bekerja, sebaiknya
meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi.
- Semua peralatan (pipet, cawan dll.) yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua
peralatan yang telah disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah
disterilisai tapi masih ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan.
Bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan (pipet, syringe dll.)diperiksa
terlebih dahulu apakah terdapat kebocoran atau tersobek.
- Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan
tangan. Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler,
pipet dll.) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri,
erlenmeyer dll.) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan ruang
lapang untuk bekerja.
- Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang
menempel.
- Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat
untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan
meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua yang
diperlukan beserta cadangannya.
- Pakai sarung tangan lateks dan ganti secara berkala. Sarung tangan membantu melindungi
dari tumpahan biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan
dirasa tidak bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya.
- Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun
bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di tangan.

Saran-saran tehnik aseptis:
- Minimalisasi gerak : pergerakan tangan dapat menciptakan aliran udara . semakin cepat
pergerakannya semakin cepat aliran udara yang ditimbulkan. Pergerakan lengan sebaiknya
dilakukan seperlu mungin dan bergerak secara lembut.
- Minimalisasi jarak: jarak antar peralatan diatur seefektif dan seefisien mungkn. Antar
peralatan jangan diletakkan terlalu jauh.
- Minimalisasi keterpaparan : semakin sering menggerakkan sesuatu (mis: cawan berisi
media) melewati udara maka semakin besar partikel udara untuk masuk. Semakin lama
tutup erlenmeyer terbuka juga semakin besar terkontaminasi.

Catatan penting dalam kerja aspetis :
- Tutup erlenmeyer, botol atau cawan sebaiknya dibuka kira-kira 450. tujuannya untuk
meminimalisasi udara masuk namun masih dapat mentransfer sesuatu.
- Jika diharuskan untuk membuka penuh dan tutup diletakkan di meja kerja, maka tutup
dapat diletakkan tertelungkup atau terlentang (muka menghadap ke atas). Jika tertelungkup
pastikan permukaannya bersih dan bila terlentang pastikan juga tidak ada gerakan di
atasnya.
- Untuk menghindari bakteri yang menempel pada jarum inokulum terpental/terciprat maka
diameter loops harus berkisar 2-3 mm dan untuk memperkecil getaran panjang kawat tidak


26
lebih dari 6cm.
- Tidak boleh menyedot cairan pada saat pippeting dengan mulut.
- Untuk menghindari penyebaran mikroba dari tetesan pipet yang terjatuh maka dapat
digunakan kain steril yang diberi desinfektan sebagai alas. Kain ini setelah selesai dibuang
sebagai limbah berbahaya.

UJI STERILITAS
Uji sterilitas dilakukan untuk mengetahui apakah bahan atau sediaan yang harus steril
sudah memenuhi syarat atau tidak. Uji sterilitas dilakukan secara mikrobiologi dengan
menggunakan medium pertumbuhan tertentu. Media untuk pengujian diperlukan dalam
uji ini. Beberapa media yang dapat digunakan dalam pengujian ini adalah :
1. Media Tioglikolat Cair
Komposisi :
- L-sistin P 0,5 g
- NaCl P 2,5 g
- Glukosa P 5,5 g
- Agar P Granul 0,75 g
- Ekstrak ragi P 5,0 g
- Digesti pancreas kasein P 15,0 g
- Natrium tioglikolat atau P 0,5 g
- Asam tioglikolat P 0,3 ml
- Larutan natrium resazurin P 1,0 ml
- Air 1000 ml
- pH setelah sterilisasi 7,1 0,2
Campur dan panaskan hingga larut. Atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 0,2
menggunakan NaOH 1 N. jika perlu saring selagi panas menggunakan kertas saring.
Tempatkan media dalam tabung yang sesuai, yang memberikan perbandingan
permukaan dengan kedalaman media sedemikian rupa sehingga tidak lebih dari
setengah bagian atas media yang mengalami perubahan warna sebagai indikasi
masuknya oksigen pada akhir masa inkubasi. Sterilisasi dalam autoklaf. Jika lebih dari
sepertiga bagian atas terjadi perubahan warna merah muda, media dapat diperbaiki
satu kali dengan pemanasan di atas tangas air atau dalam uap yang mengalir bebas
hingga warna merah muda hilang. Media siap digunakan jika tidak lebih dari
sepersepuluh bagian atas media berwarna merah muda.

2. Media Tioglikolat Alternatif
Komposisi :
- L-sistin P 0,5 g
- NaCl P 2,5 g
- Glukosa P 5,5 g
- Ekstrak ragi P 5,0 g
- Digesti pancreas kasein P 15,0 g
- Natrium tioglikolat atau P 0,5 ml
- Asam tioglikolat P 0,3 ml
- Air 1000 ml
- pH setelah sterilisasi 7,1 0,2
- Soybean-Casein Digest Medium


27
- Komposisi :
- Digesti pancreas kasein P 17 ,0 g
- Digesti papaik tepung kedele 3,0 g
- NaCl P 5,0 g
- Kalium fosfat dibasa P 2,5 g
- Glukosa P 2,5 g
- Air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,3 0,2

Tabel Jumlah Untuk Bahan Cair
Isi Wadah (ml)
Volume
minimum
(ml)
Vol. minimum untuk media
Jumlah Wadah
Permedia
Untuk inokulasi
langsung
Untuk membran
< 1
< 10
10 50
50 <100
50 <100
(I.V)

100 500
> 500
Semua
1
5
10
Semua
Semua
Semua
15
15
40
80
-
-
-
100
100
100
100
100
100
100
20
20
20
20
10
10
10

Prosedur pengujian terdiri dari (1) inokulasi langsung ke dalam media uji dan (2) teknik
penyaringan membran. Penyaringan membran berguna untuk cairan dan serbuk yang
dapat larut yang bersifat bakteriostatik atau fungistatik, untuk memisahkan mikroba
kontaminan dari penghambat pertumbuhan. Cara ini juga sangat bergun untuk bahan
seperti minyak, salep/krim yang dapat melarut ke dalam larutan pengencer bukan
bakteriostatik atau bukan fungistatik. Teknik penyaringan membran dapat juga
digunakan untuk uji sterilitas permukaan atau lumen kritis alat-alat kesehatan.
Perincian dari prosedur inokulasi dan penyaringan tabung uji, termasuk modifikasi-
modifikasi untuk keadaan tertentu, terdapat dalam USP. Penafsiran dan metode uji.
Prinsip faktor pelaksanaan dalam uji tersebut adalah bahwa bagian bahan yang akan di
uji di tempatkan dalam lingkungan yang dirancang sedemikian rupa, sehingga tiap
organisme yang ada hidup dan tumbuh. Tetapi diketahui bahwa mikroorganisme tidak
selalu bereproduksi atau bervegatasi (spora) hanya dengan menempatkannya
dilingkungan yang diperkirakan baik. Pelemahan yang diakibatkan oleh radiasi sinar


28
ultraviolet atau pemaparan non lethal terhadap panas, tidak adanya stimulasi yang
seringkali perlu untuk membuat spora bervegetasi, dan kontak sebelumnya dengan
suatu zat bakteriostatik adalah beberapa efek yang biasa mengganggu pertumbuhan
organisme tersebut. Dalam hal seperti itu akan diperoleh hasil negative palsu.
Prosedur sterilisasi merupakan tahap penting dalam mencapai produk steril, namun
semua prosedur dan kondisi-kondisi lain yang dibutuhkan untuk pembuatan produk
tersebut harus dirancang untuk membantu tahap ini. Pembersihan ruangan yang baik,
lingkungan yang terkontrol dengan efektif, suatu muatan dari produk yang dapat
dikontrol dan diidentifikasi, proses produksi yang direncanakan dan dikontrol dengan
baik, serta personel yang ditatar dengan baik dan berdedikasi tinggi untuk produksi
dan pengujian sangat penting untuk produksi suatu produk steril. Hanya bila semua
factor ini melengkapi penemuan-penemuan dari uji sterilisasi, dapatlah disimpulkan
dengan penuh kepercayaan bahwa produk tersebut steril.
















29




Pengertian
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari
campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat
diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari
morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut
merupakan prosedur pengambilan sampel.
1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka
cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang
diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar
perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran..
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika
beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan
bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang
tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air
keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran
dibakar.

Bab 3
Mikroorganisme


30
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan
dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari
substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam
preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel
yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan
atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu,
batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar
sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan
permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu
ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel
pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun
bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke
dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun
diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang
terdapat dalam beakerglass.
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat
ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada
dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam
air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar
berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk
sampel dari tanh tak perlu dimaserasi
2. Teknik Pengenceran Bertingkat



31

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah
mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan
selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Cara Kerja :
a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10
-1
) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan
berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang
digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10
-1
.
Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang
benar dapat dilihat pada gambar disamping)
b. Diambil 1 ml dari tabung 10
-1
dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung
10
-2
secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak
tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran
terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang
digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet
ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika
memindahkan cairan dari sumber yang sama.
3. Teknik Penanaman
a. Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan
suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan
isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran
terakhir.
a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di
permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat
dilakukan adalah sebagai berikut :


32
- Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian
teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.
- Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan
dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu
beberapa detik.
- Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar
supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan
ikut diputar.
- Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat
menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

a.2. Pour Plate (agar tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45
o
C) untuk dituang bersama
suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan
memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan
agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang
tumbuh dipermukaan agar yang kaya O
2
dan ada yang tumbuh di dalam agar yang
tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang
dilakukan adalah sebagai berikut :
- Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media
padat yang masih cair (>45
o
C)
- Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong
- Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk
menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.



33
Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk
pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja,
sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya
sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan
kultur ke dalam medium baru.
b.1 Goresan Sinambung
Cara kerja :
- Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai
setengah permukaan agar.
- Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180
o
C lanjutkan goresan sampai habis.
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal,
melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

b.2 Goresan T
Cara kerja :
- Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
- Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag
- Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-
zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh
goresan yang sempurna
- Lakukan hal yang sama pada daerah 3


34

B.3 Goresan Kuadran (Streakquadrant)
Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi
empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan
pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi
koloni tunggal.

Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :
1. Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10
-1
secara
aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10
-8

2. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate
pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37
o
C selama 1x24 jam
3. Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni
yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali
4. Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru
dengan teknik streak kuadran
5. Inkubasi 1x24 jam.




35
Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :
1. Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80
o
C selama 30
menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan
2. Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung
pengenceran bertingkat
3. Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke
media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian
diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari
4. Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
5. Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.







Biakan Penyuburan:
Digunakan untuk meningkatkan peluang terisolasinya suatu organisme yang
mempunyai beberapa ciri fisiologi atau biokimiawi yang unik. Langkahnya adalah
sebagai berikut:
- Lakukan pemindahan biakan secara berturut-turut (5-6 kali) dalam medium
berisikan nutrient yang dikehendaki
- Tanam pada media agar yang berisi nutrient yang sama lalu isolasi koloninya.







36



Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil
sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantu. Mikroorganisme disebut juga
organisme mikroskopik . Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler)
maupun bersel banyak (multiseluler) . Namun, beberapa protista bersel tunggal
masih terlihat oleh mata telanjang dan ada beberapa spesies multisel tidak
terlihat mata telanjang. Virus juga termasuk ke dalam mikroorganisme meskipun
tidak bersifat seluler .


Perbandingan ukuran sel prokariot dengan sel lain dan biomolekul (skala
logaritma)

Bakteri
A. Mengamati Morfologi Bakteri
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula
penyimpanan
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora.

Struktur dasar sel bakteri:
1. Dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu gabungan protein dan
polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri menjadi bakteri
Bab 4


37
gram positif bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif bila
peptidoglikannya tipis).
2. Membran plasma adalah membran yang menyelubungi sitoplasma tersusun
atas lapisan fosfolipid dan protein.
3. Sitoplasma adalah cairan sel.
4. Ribosom adalah organel yang tersebar dalam sitoplasma, tersusun atas
protein dan RNA.
5. Granula penyimpanan, karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang
dibutuhkan.












Struktur tambahan bakteri :
1. Kapsul atau lapisan lendir adalah lapisan di luar dinding sel pada jenis bakteri
tertentu, bila lapisannya tebal disebut kapsul dan bila lapisannya tipis disebut
lapisan lendir. Kapsul dan lapisan lendir tersusun atas polisakarida dan air.
2. Flagelum atau bulu cambuk adalah struktur berbentuk batang atau spiral
yang menonjol dari dinding sel.
3. Pilus dan fimbria adalah struktur berbentuk seperti rambut halus yang
menonjol dari dinding sel, pilus mirip dengan flagelum tetapi lebih pendek,
kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusun dari protein dan hanya
terdapat pada bakteri gram negatif. Fimbria adalah struktur sejenis pilus
tetapi lebih pendek daripada pilus.
4. Klorosom adalah struktur yang berada tepat dibawah membran plasma dan
mengandung pigmen klorofil dan pigmen lainnya untuk proses fotosintesis.
Klorosom hanya terdapat pada bakteri yang melakukan fotosintesis.


38
5. Vakuola gas terdapat pada bakteri yang hidup di air dan berfotosintesis.
6. Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram
positif dan terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan
bagi kehidupan bakteri. Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi
genetik, dan ribosom. Dinding endospora yang tebal tersusun atas protein
dan menyebabkan endospora tahan terhadap kekeringan, radiasi cahaya,
suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan menguntungkan endospora
akan tumbuh menjadi sel bakteri baru.

B. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri
Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis
bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan
kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk
media untuk dikenali ciri koloninya.
Cara Kerja :
Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran
Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak
lurus
Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stabinoculation
Tumbuhkan biakan pada media NB

A.1. Pertumbuhan pada Cawan Petri
Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
Ukuran; a
a. pinpoint/punctiform (titik) b
b. Small (kecil)
c. Moderate (sedang) c
d. Large (besar) d
Pigmentasi :
mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa
jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media


39
Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.
a. Opaque (tidak dapat ditembus cahaya)
b. Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian)
c. Transparant (bening)

Bentuk :
a. Circular a
b. Irregular
c. Spindle
d. Filamentous b
e. Rhizoid c
d

e

- Elevasi :
a. Flat a
b. Raised
c. Convex b
d. Umbonate
c

d

Permukaan :
a. Halus mengkilap
b. Kasar
c. Berkerut
d. Kering seperti bubuk




40
Margins : 1
1. Entire 2
2. Lobate
3. Undulate
4. Serrate 3
5. Felamentous
6. Curled 4
6


A.2. Pertumbuhan pada Agar Miring
Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus
Ciri koloni berdasarkan bentuk:

A.3 Pertumbuhan pada Agar Tegak
Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam
media agar tegak.
Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :



41
Ciri koloni berdasar kebutuhan O
2 :







A.4 Pertumbuhan pada Media Cair
Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O
2









A. Mengamati Morfologi Bakteri
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel
bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat
mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa,
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai
muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan
zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena
muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna


42
asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite
Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.
Pewarnaan
Pewarnaan sederhana Pewarnaan diferensial Pewarnaan khusus
pewarnaan positif pewarnaan gram pewarnaan endospora
pewarnaan negatif pewarnaan acid fast dll. pewarnaan flagella dll.

B.1. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif)
Merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis zat pewarna (tunggal).
Misalnya metylen blue, Carbol fuchsin, dll.
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang
kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi
jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari
bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
Cara Kerja :
Bersihkan object glass dengan kapas
Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass
Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes
atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok
terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan
jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya
sel merata.
Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di
atas api 2-3 kali)
Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna
(dapat digunakan Methylen blue, Safranin, CrystalViolet) dan tunggu kurang lebih 30
detik.
Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue
Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).




43










B.2 Pewarnaan Negatif
Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan
pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai
lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam.
Prosedur:
1. Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah
satu object glass
2. Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi,
lalu dicampurkan
3. Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri
4. Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas
api.
1 2


44
3 4
5. Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri.
A.3. Pewarnaan Gram
Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua
yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding
sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Berikut merupakan tabel
prosedur pewarnaan Gram:






45










Dengan metode ini, biasanya bakteri Gram (+) berwarna ungu dan Gram (-)
berwarna merah. Perbedaan tersebut karea perbedaan struktur dinding sel bakteri
Gram (+) yang mengandung peptidoglikan dan Gram (-) yang mengandung kadar
lipid yang tinggi sehingga terjadi perbedaan reaksi dalam permiabilitas zat warna
dan penambahan zat pemucat.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb:
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang
mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai


46
berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif
tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam
penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine
secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak
lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel
menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan
menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan
sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang
memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan
Arthrobacter.
PERBEDAAN BAKTERI GRAM POSITIF DAN GRAM NEGATIF:
CIRI
PERBEDAAN RELATIF
GRAM POSITIF GRAM NEGATIF
Sturktur dinding sel
Tebal (15-80 nm), berlapis
tunggal (mono)
Tipis (10-15 nm), berlapis
tiga (multi)
Komposisi dinding sel
Kandungan lipid rendah (1-4
%), peptidoglikan ada
sebagai lapisan tunggal, ada
asam tekoat
Kandungan lipid tinggi (11-
22%), peptidoglikan ada di
dalam lapisan kaku
sebelah dalam, tidak ada
aam tekoat
Kerentanan terhadap
penisilin
Lebih rentan Krang rentan
Pertumbuhan
dihambat oleh warna-
warna dasar (seperti
Kristal ungu)
Pertumbuhan dihambat
dengan nyata
Pertumbuhan tidak begitu
dihambat
Persyaratan nutrisi
Relative rumit pada banyak
spesies
Relative sederhana
Resistensi terhadap
gangguan fisik
Lebih resisten Kurang resisten
Asam tekoat = polimer gliserol dan ribitol fosfat menempel pada peptodoglikan atau
membran sitoplasma. Fungsi asam teikoat (muatan negatif) adalah :
untuk transport ion positif dari dan keluar sel
penyimpanan fosfor

B.4. Pewarnaan Endospora
Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah
bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan


47
bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan
mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi
dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan
endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa
pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika
dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi
(kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik
pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan
metode Schaeffer-Fulton.



48





49
Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya


B.5. Pewarnaan Khusus (Pewarnaan Bakteri Tahan Asam)/ BTA
Bakteri-bakteri tahan asam memiliki lapisan lipid/lemak yang tebal dalam
dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel bakteri tersebut relatif tidak
permeable terhadap zat warna yang umum sehingga sel-sel tersebut tidak terwarnai
oleh metode pewarnaan biasa. Pada pewarnaan ini, mikroorganisme dapat
menahan zat warna yang tidak terpucatkan oleh asam alcohol sehingga dikatakan
tahan asam dan tampak merah, sedangkan yang tidak tahan asam (terpucatkan)
akan berwarna biru. Metode yang paling sering digunakan adalah Zeihl-Nelssen dan
Kinyoun Gabbet/ Tan Thiam Hok.
C. Mengamati motilitas
C.1 Pengamatan Langsung
Cara Kerja :


50
Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.coli ke object glass (sebaiknya
dari biakan cair). Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu
ditambah akuades satu tetes, ratakan.
Tutup dengan cover glass
Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak. Bakteri akan
tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Hati-hati jangan salah
membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena
aliran air.

C.2 Pengamatan tidak langsung
Cara Kerja :
Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan
cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm.
Inkubasi pada suhu 37
0
C selama 1x 24 jam
Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan
media, hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah
tusukan saja
Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan

ARKEA
Diameter arkea berkisar antara 0,1 mikrometer (m) hingga 15 m dan terdapat
dalam berbagai bentuk seperti bulat, berbentuk seperti tongkat, spiral, seperti
lempengan, filament seperti jarum atau persegi. Struktur selnya mirip bakteri gram
positif, tapi komponen selnya berbeda serta mempunyai flagella.



51
Salah satu jenis arkea yang hidup di sumber air panas sebuah gunung berapi.

PROTOZOA
Ukuran tubuh protozoa biasanya berkisar antara 10-50 m, tetapi dapat tumbuh sampai 1
mm, dan mudah dilihat di bawah mikroskop. Protozoa ada yang bergerak dengan flagela da
nada yang menggunakan silia. Lebih dari 30.000 jenis telah ditemukan. Protozoa terdapat di
seluruh lingkungan berair dan tanah, tubuh protozoa amat sederhana, yaitu terdiri dari satu
sel tunggal (unisel). Namun demikian, Protozoa merupakan sistem yang serba bisa. Semua
tugas tubuh dapat dilakukan oleh satu sel saja tanpa mengalami tumpang tindih. Bentuk
tubuh macam-macam, ada yang seperti bola, bulat memanjang, atau seperti sandal bahkan
ada yang bentuknya tidak menentu.
Protozoa adalah mikroorganisme menyerupai hewan yang merupakan salah satu filum dari
Kingdom Protista. Seluruh kegiatan hidupnya dilakukan oleh sel itu sendiri dengan
menggunakan organel-organel antara lain membran plasma, sitoplasma, dan mitokondria.
Ciri-ciri umum :
Organisme uniseluler (bersel tunggal)
Eukariotik (memiliki membran nukleus)
Hidup soliter (sendiri) atau berkoloni (kelompok)
Umumnya tidak dapat membuat makanan sendiri (heterotrof)
Hidup bebas, saprofit atau parasit
Dapat membentuk sista untuk bertahan hidup
Alat gerak berupa pseudopodia, silia, atau flagela

Semua protozoa mempunyai vakuola kontraktil. Vakuola dapat berperan sebagai pompa
untuk mengeluarkan kelebihan air dari sel, atau untuk mengatur tekanan osmosis. Jumlah
dan letak vakuola kontraktil berbeda pada setiap spesies. Protozoa dapat berada dalam
bentuk vegetatif (trophozoite), atau bentuk istirahat yang disebut kista. Protozoa pada
keadaan yang tidak menguntungkan dapat membentuk kista untuk mempertahankan
hidupnya. Saat kista berada pada keadaan yang menguntungkan, maka akan berkecambah
menjadi sel vegetatifnya. Protozoa tidak mempunyai dinding sel, dan tidak
mengandung selulosa atau khitin seperti pada jamur dan algae.


52


Yeast / Khamir
A. Mengamati morfologi koloni yeast
Sel khamir dapat tumbuh setelah ditanamkan pada media agar selama 1
sampai 3 hari. Selama waktu tersebut, khamir akan menghasilkan koloni berwarna
pucat keruh dan umumnya mempunyai diameter anatar 0.5 sampai 3.0 mm.
Sebagaian kecil species dapat menghasilkan pigmen, tetapi kebanyakan hanya
menghasilkan warna krem. Dibawah mikroskop dan secara morfologi koloni ,
kebanyakan species khamir sulit dibedakan karena perbedaannya yang sangat kecil.
Untuk membedakannya seringkali harus dilakukan tes fisiologi. Ragi dengan nilai
ekonomi paling penting yang saat ini dikenal adalah khamir yang digunakan dalam
pembuatan roti (bakers) dan dalam pembuatan bir (brewers), yang merupakan
anggota dari genus Saccharomyces.










Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam mengidentifikasi khamir adalah:
1. Ada tidaknya askospora, kalau ada bagaimana pembentukannya (konyugasi
isogami, heterogami, atau konyugasi askospora), bentuk, warna, ukuran, dan
jumlah spora.
2. Bentuk, warna, dan ukuran sel vegetatifnya.
3. Cara reproduksi aseksual (bertunas, membelah, dsb)


53
4. Ada tidaknya filamen atau pseudomiselium.
5. Pertumbuhan dalam medium dan warna koloninya.
6. Sifat-sifat fisiologi, misalnya sumber karbon (C) dan nitrogen (N), kebutuhan
vitamin, bersifat oksidatif atau fermentatif, atau keduanya, lipolitik, uji
pembentukan asam, penggunaan pati, dan lain-lain.

Berikut ini merupakan cara pengamatan morfologi khamir:
a. Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida
albicans) pada PDA dengan cara streakquadrant.
b. Inkubasi selama 2x24 jam.
c. Setelah didapatkan koloni tunggal, pengamatan ciri-ciri morfologi koloni
hampir sama dengan ciri morfologi bakteri.
B. Mengamati Morfologi Sel Yeast
Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler, tidak membentuk hifa
(beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Bentuk selnya bervariasi dapat
berbentuk bulat, bulat telur, bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 m. Beberapa
spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau
pseudohifa. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil
pembelahan aseksual secara budding, tetapi tidak melepaskan diri dari induk.
Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti
mitkondria, grannula lemak dan glikogen.
B.1 Melihat bentuk sel Yeast
Cara Kerja :
Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam.
Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata
(jangan difiksasi).
Tutup preparat dengan cover glass.
Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10.
B.2 Melihat bentuk spora sel Yeast
Cara kerja :
Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari.
Fiksasi dengan api bunsen.
Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu:


54
Tetesi preparat dengan MalachiteGreen dan biarkan 30-60 detik. Panasi preparat
dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Cuci preparat dengan air
mengalir. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka. Amati di
bawah mikroskop. Perhatikan spora yang berwarna
Kapang / Jamur
Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa
benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium).
Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan
hifa tidak bersekat (aseptat). Penampakan morfologi koloni
pada umumnya seperti benang (filamentous) yang
pertumbuhannya membentuk lingkaran. Morfologi
koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa
jenis bakteri yang koloninya mirip jamur, seperti dari kelompok Actinomycetes atau
Bacillus mycoides. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari
sporanya.
A. Mengamati morfologi koloni kapang
Cara kerja :
Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di
tenganh-tengah cawan petri.
Inkubasi selam beberapa hari.
Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar.
B. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode SlideCulture (Microculture)
Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada
object glass yang ditetesi media pertumbuhan. Pengamatan struktur spora dan
miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di
depan. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus
sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan. Dengan teknik ini,
spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah
tersebut.


55

B.1 Metode Heinrichs, cara kerja :
a. Siapkan object glass, cover glass, tissue basah yang dimasukkan dalam cawan
dan sterilkan dengan autoclave.
b. Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah
kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis).
c. Tutup dengan cover glass.
d. Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass
yang tidak diberi lilin. Berikan sampai setengah luasan cover glass. Tekan
cover galss secara media merata.
e. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.
f. Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop.

B. 2 Metode Riddel, cara kerja :
a. Persiapan sama seperti di atas
b. Setelah semua steril, potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk
kubus dan letakkan di atas object glass.
c. Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar.
d. Tutup potongan agar dengan cover glass.
e. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.
f. Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.


56
B.3 Prosedur yang lebih sederhana, cara kerja :
a. Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass
dan cover glass.
b. Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair.
c. Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat
(teteskan jangan terlalu banyak).
d. Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L.
e. Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut.
f. Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata.
g. Inkubasi selama 2x24 jam.
h. Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan
perbesaran sedang












57
MIKROBA YANG PENTING DALAM INDUSTRI FERMENTASI
1. BAKTERI
a. Acetobacter aceti. Bakteri ini penting dalam produksi asam asetat dengan
mengoksidasi alkohol sehingga menjadi asam asetat. Banyak terdapat
pada ragi tapai, yang menyebabkan tapai yang melewati dua hari
fermentasi akan menjadi berasa asam
b. Acetobacter xylinum.Bakteri ini digunakan dalam pembuatan nata de
coco. A.xylinum mampu mensintesis selulosa dari gula yang dikonsumsi.
Bakteri ini juga terdapat pada produk kombucha yaitu fermentasi dari teh
c. Bacillus sp. Merupakan genus dengan kemampuan yang paling luas. Pada
mulanya hanya digunakan untuk menghasilkan enzim amylase, namun
berkembang untuk bioinsektisida yang diwakili oleh Bacillus thuringiensis
maupun untuk penanganan limbah seperti B. subtilis dan B. megaterium,
juga digunakan untuk memproduksi bahan baku plastik ramah
lingkungan.
d. Bividobacterium sp. Bersifat anaerob dan digunakan sebagai mikrobia
probiotik, yaitu mikroba yang dikonsumsi untuk mengatur keseimbangan
flora usus.
e. Lactobacillus sp. Digunakan dalam produksi asam laktat, fermentasi
pangan seperti yoghurt, sauerkraut dan juga produk probiotik. Asam
laktat dari bakteri ini dapat juga dibuat poli asam laktat sebagai bahan
baku plastic ramah lingkungan.

2. KHAMIR
a. Saccharomyces cerevisiae, digunakan dalam industry wine dan
pengembang adonan roti
b. Saccharomyces roxii, digunakan dalam pembuatan kecap dan
berkontribusi pada pembentukan aroma
3. JAMUR/ KAPANG
a. Aspergillus niger,digunakan dalam pembuatan asam sitrat (pada
pembuatan permen dan minuman kemasan), sering mengkontaminasi
makanan misalnya roti tawar.
b. Rhizopus oryzae, penting dalam pembuatan tempe
c. Neurospora sitophila, merupakan sumber beta karoten pada fermentasi
tradisional seperti produksi oncom.
d. Monascus purpureus, dalam pembuatan angkak (fermentasi pada beras).
Jamur ini menghasilkan pewarna alami yang umumnya digunakan pada
masakan cina.
e. Penicillium sp., mampu menghasilkan antibiotic yang disebut penisilin.


58






Di samping beragam jenisnya, mikroba juga sangat mudah mengalami
perubahan sifat sehingga menjadi strain baru yang berbeda dengan aslinya. Dalam
melaksanakan kegiatan ilmiahnya, para pakar mikrobiologi dan pakar ilmu yang
terkait seperti pakar fitopatologi dan entomologi perlu mempunyai koleksi plasma
nutfah mikroba, baik untuk digunakan sehari-hari, untuk jangka menengah, maupun
jangka panjang.
Oleh karena itu, perlu melakukan koleksi, menyimpan, dan memelihara
mikroba dengan baik. Para ilmuwan tersebut perlu memiliki metode pembuatan dan
penyimpanan koleksi (preservasi) yang sesuai untuk menjaga agar biakan mikroba
tetap hidup, ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah, serta hemat biaya
dan tenaga. Metode yang dipilih sangat tergantung pada sifat mikroba dan tujuan
preservasi. Sifat mikroba tercermin dalam:
(1) ciri-ciri morfologi mikroba yang beragam (virus, bakteri, jamur, nematoda,
algae, khamir, dan protozoa)
(2) ciri-ciri fisiologi dan biokimia mikroba
(3) kemampuan mikroba bertahan hidup baik dalam lingkungan alaminya
maupun lingkungan buatan.
Tujuan koleksi dan preservasi meliputi tujuan jangka pendek dan jangka panjang.:
1. Preservasi jangka pendek dilakukan untuk keperluan rutin penelitian yang
disesuaikan dengan kegiatan program atau proyek tertentu.
2. Preservasi jangka panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan
konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat diperlukan,
dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia.
Bab 5


59

Keberhasilan pembuatan koleksi plasma nutfah mikroba tergantung pada tiga
faktor, yaitu:
(1) penguasaan teknologi
(2) ketersediaan fasilitas preservasi
(3) ketersediaan tenaga terampil, tekun, dan rutin.

Tujuan utama preservasi, yaitu:
(1) mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme hingga
sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya)
(2) memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan
(recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri
yang minimum.
CARA PENYIMPANAN:
1. Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan
secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke
media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak.
Beberapa teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan
isolat jangka pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk
penyimpanan jangka panjang. Di antara teknik tersebut ialah penyimpanan
dalam minyak mineral, parafin cair, tanah steril, air steril, manik-manik
porselin, lempengan gelatin, dan P2O5 dalam keadaan vakum.
2. Metode penyimpanan jangka panjang yang paling efektif dan banyak
dilakukan ialah metode liofilisasi atau kering beku Qiophylization atau freeze
drying) dan kriopreservasi (cryopreservation atau cryogenic preservation).
Kedua teknik tersebut dilaporkan paling berhasil untuk penyimpanan jangka
panjang berbagai mikroba. Kendala utamanya adalah tidak semua
laboratorium mempunyai peralatan tersebut.

Tahapan dalam pembuatan koleksi dan preservasi plasma nutfah mikroba pada
dasamya sama, yaitu meliputi koleksi contoh mikroba, isolasi (pemurnian), dan
karakterisasi isolat, preservasi, pemeliharaan dan pembuatan bank
data.Penyimpanan kultur mempunyai prinsip bahwa mikroba tetap hidup tetapi
secara biologi tidak aktif dan mutasi tidak terjadi selama penyimpanan yang lama.
Untuk menyimpan kultur dapat digunakan cara sebagai berikut:


60
1. Ekstrak tanah agar
Agar lunak (3 g/L) yang mengandung ekstrak tanah (1 kg tanah subur dalam 2
L air dan disterilkan selama 1 jam pada suhu 130
0
C kemudian disaring)
diinokulasi secara tusukan pada bagian tengah. Setelah terjadi pertumbuhan,
ditutup rapat dan disimpan pada suhu 4
0
C.
2. Agar miring dengan paraffin
Kultur ditumbuhkan pada agar miring yang mengandung pepton tetapi tanpa
gula. Setelah pertumbuhan terjadi, permukaannya ditutup paraffin steril
untuk mencegah penguapan dan membatasi penggunaan oksigen. Kultur
juga disimpan pada suhu rendah (4
0
C dalam ruang pendingin)
3. Deep Freezing
Saat kultur didinginkan, beberapa sel mati. Selama penyimpanan dalam
keadaan dingin sebagian sel akan tahan dan lainnya akan mati meskipun laju
kematian berkurang dengan rendahnya suhu pendinginan.
4. Liofilisasi (kering beku)
Sel-sel mikroba disuspensikan pada medium pembawa (suspending medium)
untuk melindungi sel. Hasil liofilisasi ini berupa tepung yang terdiri atas sel
mikroba yang liofilik, sangat mudah mengikat air. Contohnya kultur Yersenia
pestis yang diliofilisasi pada keadaan hampa dalam ampul gelas pada suhu
4
0
C selama 25 tahun, lebih dari 25% sel maih hidup.
5. Kultur tanah
Teknik ini digunakan untuk mikroba pembentuk spora seperti Penicillium,
Aspergillus, Bacillus, dan Streptomyces. Campuran tanah (20%), pasir (78%)
dan kalsium karbonat (2%), beberapa gram dimasukan dalam tabung dan
disterilisasi selama 8-15 jam pada suhu 130
0
C. setelah dingin, sejumlah
suspense spora ditambahkan, kelebihan air diuapkan dalam desikator pada
keadaan hampa dan tabung ditutup. Dengan cara ini, spora dapat bertahan
beberapa tahun tanpa berkecambah.
6. Dehidrasi dengan silica gel anhidrat
Tabung diisi setengahnya dengan silica gel dan disterilisasi kering pada suhu
175
0
C selama 1,5 hingga 2 jam. Suspensi (0,5 mL) yang telah didinginkan
terlebih dahulu diteteskan pada setiap tabung yang berisi silica gel,
didinginkan pada suhu 0
0
C selama 10-15 menit, lalu disimpan selama 1
minggu dalam desikator yang menggunakan silica ge aktif, sebelum dilakukan
uji viabilitas. Masing-masing tabung kemudian di tutup dengan Parafilm dan
disimpan dalam wadah tertutup pada suhu 2
0
- 4
0
C.





61
CARA PENYIMPANAN DAN PENGAWETAN BIAKAN FUNGI (JAMUR)
Tujuan utamamemelihara biakansuatu fungus adalah untuk menjaga galur fungus
tersebut di dalam suatu media tanpa terjadinya perubahan morfologi, fisiologi, atau genetic
Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat dengan mengurangi kecepatan metabolisme
atau bahkan dapat menunda metabolisme mikroorganisme. Pengawetan yang baik bila
digunakan biakan yang sehat dan kondisi pertumbuhan yangoptimum. Mickroorganisme
tumbuh dalam lingkungan dan kondisi yang berbeda-beda. Beberapa diantaranya memiliki
spesifisitas tertentu sebagai syarat pertumbuhannya. Umumnya mikroorganisme tumbuh
baik dalam media yang dibuat mendekati kondisi lingkungan tempat asalnya. Contoh :
tanah, bagian tanaman atau komponen air, dll.


Pertumbuhan Mikroorganisme
- Media pertumbuhan dapat bervariasi. Misalnya Raper & Thom (1949) menggunakan
Czapek's Agar, Steep Agar and Malt Extract Agar untuk pertumbuhan Penicillia dan
Aspergilli
- Pitt (1980) menganjurkan penggunaan Czapek Yeast Autolysate (CYA) dan Malt Extract
Agar (MEA) untuk penicillia
- Standarisasi formula media penting dilakukan
- Media akan mempengaruhi morfologi dan warna koloni, karena kandungan media akan
mempengaruhi pembentukan senyawa tertentu atau menginduksi sifat tertentu dari
mikroorganisme







-

Pengaruh Media terhadap morfologi koloni


Kontaminasi pada kultur fungi
Biakan Fungi sering terkontaminasi oleh Tyroglyphus or Tarsonemus
Di alam banyak terdapat pada tanah, dan hampir semua bahan organik
Terbawa ke laboratorium dari bahan tanaman, produk yang sudah kadaluarsa, pada
sepatu, serangga atau biakan mikroorganisme lain.
Cepat berkembang biak dalam keadaan lembab dan suhu ruang
Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat disimpan

Pencegahan Kontaminasi
Melakukan pekerjaan sesuai prosedur
Menjaga kebersihan dan kesehatan diri


62
Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium
Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur



Metode pencegahan kontaminasi
Hygiene
Bersihkan seluruh permukaan dan hindari biakan dari udara luar dan debu
Cuci peralatan dengan desinfektan yang sesuai.

Fumigation
Digunakan selang waktu tertentu untuk ruang laboratorium atau korikor. Pekerjaan ini
harus dilakukan oleh yang berwenang
Mechanical and chemical barriers
Universal bottles, kapas lemak, tabung bersumbat

Tempat penyimpanan yang aman
Lemari pendingin 4-8C
Lemari penyimpanan deep freeze (< -20C)
Menutup kultur dengan minyak mineral
Simpan dengan silica gel
Freeze-dry
Simpan di ultra-low temperatures case

Pengawetan dan Penyimpanan
Continuous culture
Pada media padat atau cair
Refrigeration
Di bawah lapisan minyak mineral
Di dalam air
Pengeringan
Freeze drying
Cryopreservation

Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan sebagai seed stock, Simpan satu biakan sebagai
cadangan. Setelah pengawetan, viability, purity, dan identitas harus di cek ulang dan
dibandingkan dengan data aslinya atau referensi. Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan
biokimia harus diuji. Semua pengamatan harus dicatat dan disimpan untuk referensi di masa
yang akan datang.


63

Metode Pengawetan mikroorganisme agar miring
Merupakan suatu metode yang paling mudah dan murah, beberapa kerugian dari sub-kultur
pada agar adalah sebagai berikut:
Kemungkinan terjadi variasi genetic akibat pemindahan berulang, hilangnya sifat
patogenitas atau karakteristik fisiologi dan morfologi lainnya
Kemungkinan kontaminasi besar
Memerlukan pengawasan yang ketat supaya biakan tidak tertukar atau terkontaminasi

Sedangkan keuntungan metode sub-kultur pada agar adalah:
Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktu cukup lama di bawah pengawasan ahlinya.
Metodenya cukup murah dan tidak memerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah koleksi yang
sedikit, metode ini cukup menguntungkan
Penumbuhan mudah karena tidak perlu waktu adaptasi yang lama.
Periode pemindahan : 2 4 minggu atau2 4 bulan

Metode Pengawetan mikroorganisme di bawah minyak mineral

Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles lalu dituangkan minyak mineral di
atasnya. Hal ini dapat mencegah dehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme dan
pertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen

Metode pengawetan dengan minyak mineral ini pertama kali digunakan oleh Buell
&Weston (1947). Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10 mm minyak mineral
steril (liquid paraffin or medicinal paraffin dengan specific gravity 0.830-0.890). Minyak
disterilkan dengan autoklaf dua kali pada121C selama 15 menit. Penumbuhan kembali dari
minyak dilakukan dengan cara mengambil sejumlah koloni dengan jarum biakan dan minyak
dibuang sebanyak mungkin. Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengah kadang kala
memberikan hasil yang lebih baik sehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudah
melalui slope

Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral, diantaranya adalah :
Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara
Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval
Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisi yang tidak nyaman dapat mengarah pada
mutasi

Dan keuntungannya adalah :
Peralatan murah dan pengerjaan mudah


64
Beberapa mikroorganisme hanya dapat disimpan di dalam minyak mineral
Namun penyimpanan di bawah minyak mineral disarankan untuk laboratorium yang
memiliki keterbatasan sumbar daya dan fasilitas

Metode penyimpanan dalam air


Cara kerja:
1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dari ujung pertumbuhan koloni jamur
2. Potongan tersebut ditempatkan di dalam air sterildi dalam botol McCartney dan tutup
erat , lalu disimpan pada suhu 20-25C.
3. Peremajaan dilakukan dengan mengambilpotongan agar tersebut, tempatkan terbalik
pada medium pertumbuhan yang sesuai

Jangka waktu penyimpanan dapatmencapai 2-3 tahun , misalnya untuk spesies of
Phytophthora dan Pythium tanpa adanya perubahan fisik. Pertama kali dilakukan oleh
Castellani (1939,1967) yang menyimpan fungi yang pathogen terhadap manusia. Figueiredo
(1967) menyimpan 22 patogen tanaman tanpa kehilangan patogenitasnya. Figueiredo &
Pimentel (1975) melaporkan penyimpanan dalam air bisa mencapai 10 tahun. Boeswinkel
(1976) menyimpan 650 patogenantara lain Oomycota, Ascomycota, Basidiomycotadan
mitotic fungi selama 7 tahun. Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales, Pyrenomycetes,
Hymenomycetes, Gasteromycetes dan Hyphomycetes.

Penyimpanan dan pengawetan dengan teknik pengeringan beku (freeze-drying)
Penghilangan air akan mengurangi laju metabolisme sel
Dapat dilakukan dengan pengeringan udara
Dapat pula dengan penambahan absorbant seperti tanah, silica gel, atau desiccant lain.
Cara Freeze-dry dengan vacuum dari keadaan beku dengan cara sublimasi es

Penyimpanan dalam Silica Gel



65
Sporulating fungi dapat disimpan selama 7-18 tahun, bahkan ada yang sampai 25 tahun

Penyimpanan dalam Silica Gel
Cara kerja:
1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dan sterilkan dengan dry heat
(180C selama 3 jam).
2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal- 20C).
3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yang telah didinginkan.
4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica gel dan goyangkan agar
tercampur homogen.
5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada25C sampai silica gel crystals
mengering dan siap untuk dipisahkan.
6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4C dalam wadah kedap udara dengan
indicator silica gel untuk mengabsorbsi lembab.

Banyak fungi yang tahan lama dengan metode ini, tapi spora yang berdinding tipis
cenderung tidak dapat bertahan. Keberhasilannya tergantung biakan yang sehat, dan hal ini
dapat ditunjukkan dari perbedaan biakan dari setiap isolat. Metode ini dapat digunakan bila
fasilitas freezedrying tidak tersedia, walaupun ada beberapa fungi yang tidak dapat
bertahan lama dengan cara ini.

Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai

Kekurangan cara silica gel :
Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidak sesuai untuk Pythium, Phytophthora dan
beberapa Oomycota, juga beberapa fungi bermiselium yang memiliki spora yang kompleks.
Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukup besar setelah beberapa kali peremajaan.

Keuntungan cara silica gel :
Murah dan sederhana
Menghasilkan biakan yang stabil untuk banyak sporulating fungi termasuk Basidiomycota.
Kontaminasi dari bakteri dapat dihindari karena kondisi yang kering
Peremajaan inokulum dapat dilakukan dengan mengambil beberapa butir dari satu botol,
walaupun disarankan tetap memisahkan biakan stock dari biakan kerja.








66


Penyimpanan dalam tanah

Tanah harus diautoklaf dua kali (121C for 15 min) sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi
spora dalam air steril. Inkubasi pada 20-25C selama 5-10 hari tergantung pada laju
pertumbuhan fungi

Keuntungan :
Biakan dapat bertahan sampai 10 tahun.
Peremajaan berulang dapat dilakukan dari sampel yang sama, walaupun sebaiknya stok
harus ditempatkan terpisah.
Biaya murah dan alat sederhana

Kerugian :
Kemungkinan terjadi variasi genetik
Beberapa fungi tidak dapat tahan didesikasi
Kemungkinan kontaminasi lebih besar

Oomycota
- Paling baik disimpan di bawah nitrogen cair dengan kecepatan pendinginan 10C min-1,
walaupun beberapa galur tidak dapat disimpan dengan cara ini.
- Di bawah minyak mineral dapat disimpan sampai 6 bulan
- Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40 tahun (laporan dari CABI-UK)
- Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu di transfer setiap 2 tahun
-

-


Zygomycota
Nitrogen cair sangat disarankan untuk penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genus lainnya
Dapat pula dengan cara freeze-dried
Tidak semua genus tahan proses dehidrasi, terutama dengan silica gel, misalnya
Coemansia, Martensiomyces, Condiobolus, Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites.
Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis dan Coemansia yang dapat di freeze dried.

Basidiomycota
Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi demikian hanya dapat disimpan dengan
cara transfer regular pada agar dengan atau tanpa minyak, atau disimpan di nitrogen cair.


67
Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi
sukar ditumbuhkan kembali
Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang tumbuh di alam, dapat di freeze-dried

Fungi Deuteromycota
Fungi yang ber konidia relatif mudah disimpan
Freeze-drying adalah teknik yang paling tepat.
Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces dapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai 2
tahun pada agar miring pada -18C.

Ragi
Ragi (single celled vegetative yeasts) dapat disimpan dengan cara freezedrying.
Kebanyakan spesies dapat tahan disimpan dalam silica gel namun sukar ditumbuhkan
kembali
Liquid nitrogen adalah cara yang paling baik.




















68





Aktivitas mikroba dipengaruhi oleh faktor-faktor lingkungannya. Perubahan
lingkungan dapat mengakibatkan perubahan sifat morfologi dan fisiologi mikroba.
Beberapa kelompok mikroba sangat resisten terhadap perubahan faktor lingkungan.
Mikroba tersebut dapat dengan cepat menyesuaikan diri dengan kondisi baru
tersebut. Faktor lingkungan meliputi faktor-faktor abiotik (fisika dan kimia), dan
faktor biotik.
A. FAKTOR ABIOTIK
1. Suhu
a. Suhu pertumbuhan mikroba
Pertumbuhan mikroba memerlukan kisaran suhu tertentu. Kisaran
suhu pertumbuhan dibagi menjadi suhu minimum, suhu optimum, dan
suhu maksimum. Suhu minimum adalah suhu terendah tetapi mikroba
masih dapat hidup. Suhu optimum adalah suhu paling baik untuk
pertumbuhan mikroba. Suhu maksimum adalah suhu tertinggi untuk
kehidupan mikroba.
Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhannya, mikroba dapat
dikelompokkan menjadi mikroba psikrofil (kriofil), mesofil, dan termofil.
Psikrofil adalah kelompok mikroba yang dapat tumbuh pada suhu 0-30
0
C
dengan suhu optimum sekitar 15
0
C. Mesofil adalah kelompok mikroba pada
umumnya, mempunyai suhu minimum 15
0
C suhu optimum 25-37
0
C dan
suhu maksimum 45-55
0
C. Mikroba yang tahan hidup pada suhu tinggi
dikelompokkan dalam mikroba termofil. Mikroba ini mempunyai membran
sel yang mengandung lipida jenuh, sehingga titik didihnya tinggi. Selain itu
Bab 6


69
dapat memproduksi protein termasuk enzim yang tidak terdenaturasi pada
suhu tinggi. Di dalam DNA-nya mengandung guanin dan sitosin dalam
jumlah yang relatif besar, sehingga molekul DNA tetap stabil pada suhu
tinggi. Kelompok ini mempunyai suhu minimum 40
0
C, optimum pada suhu
55-60
0
C dan suhu maksimum untuk pertumbuhannya 75
0
C. Untuk mikroba
yang tidak tumbuh dibawah suhu 30
0
C dan mempunyai suhu pertumbuhan
optimum pada 60
0
C, dikelompokkan kedalam mikroba termofil obligat.
Untuk mikroba termofil yang dapat tumbuh dibawah suhu 30
0
C,
dimasukkan kelompok mikroba termofil fakultatif. Bakteri yang hidup di
dalam tanah dan air, umumnya bersifat mesofil, tetapi ada juga yang dapat
hidup diatas 50
0
C (termotoleran). Contoh bakteri termotoleran adalah
Methylococcus capsulatus. Contoh bakteri termofil adalah Bacillus,
Clostridium, Sulfolobus, dan bakteri pereduksi sulfat/sulfur. Bakteri yang
hidup di laut (fototrof) dan bakteri besi (Gallionella) termasuk bakteri
psikrofil.
b. Suhu tinggi
Apabila mikroba dihadapkan pada suhu tinggi diatas suhu maksimum, akan
memberikan beberapa macam reaksi.
(1) Titik kematian thermal, adalah suhu yang dapat memetikan spesies
mikroba dalam waktu 10 menit pada kondisi tertentu.
(2) Waktu kematian thermal, adalah waktu yang diperlukan untuk
membunuh suatu spesies mikroba pada suatu suhu yang tetap. Faktor-
faktor yang mempengaruhi titik kematian thermal ialah waktu, suhu,
kelembaban, spora, umur mikroba, pH dan komposisi medium. Contoh :
waktu kematian thermal (TDT/ thermal death time) untuk beberapa jenis
bakteri adalah sebagai berikut :
Nama mikrobia
Waktu
(menit)

Suhu (
0
C)

Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Spora Bacilus subtilis
20-30
19
20-50
57
60
100


70
Spora Clostridium botulinum 100-330 100

c. Suhu rendah
Apabila mikroba dihadapkan pada suhu rendah dapat menyebabkan
gangguanmetabolisme. Skibat-akibatnya adalah
(1) Cold shock , adalah penurunan suhu yang tiba-tibamenyebabkan
kematian bakteri, terutama pada bakteri muda atau pada fase logaritmik,
(2)Pembekuan (freezing), adalah rusaknya sel dengan adanya kristal es di
dalam airintraseluler,
(3) Lyofilisasi , adalah proses pendinginan dibawah titik beku dalam
keadaanvakum secara bertingkat. Proses ini dapat digunakan untuk
mengawetkan mikroba karenaair protoplasma langsung diuapkan tanpa
melalui fase cair (sublimasi).
2. Kandungan air (pengeringan)
Setiap mikroba memerlukan kandungan air bebas tertentu untuk
hidupnya,biasanya diukur dengan parameter aw (water activity) atau
kelembaban relatif. Mikrobaumumnya dapat tumbuh pada aw 0,998-0,6.
bakteri umumnya memerlukan aw 0,90-0,999.Mikroba yang osmotoleran
dapat hidup pada aw terendah (0,6) misalnya khamirSaccharomyces rouxii.
Aspergillus glaucus dan jamur benang lain dapat tumbuh pada aw 0,8.Bakteri
umumnya memerlukan aw atau kelembaban tinggi lebih dari 0,98, tetapi
bakterihalofil hanya memerlukan aw 0,75. Mikroba yang tahan kekeringan
adalah yang dapatmembentuk spora, konidia atau dapat membentuk kista.
3. Tekanan osmose
Tekanan osmose sebenarnya sangat erat hubungannya dengan
kandungan air. Apabilamikroba diletakkan pada larutan hipertonis, maka
selnya akan mengalami plasmolisis, yaitu
terkelupasnya membran sitoplasma dari dinding sel akibat mengkerutnya
sitoplasma. Apabiladiletakkan pada larutan hipotonis, maka sel mikroba akan
mengalami plasmoptisa, yaitu pecahnya selkarena cairan masuk ke dalam sel,
sel membengkak dan akhirnya pecah.Berdasarkan tekanan osmose yang
diperlukan dapat dikelompokkan menjadi


71
(1) mikrobaosmofil, adalah mikroba yang dapat tumbuh pada kadar gula tinggi,
(2) mikroba halofil, adalahmikroba yang dapat tumbuh pada kadar garam
halogen yang tinggi,
(3) mikroba halodurik, adalahkelompok mikroba yang dapat tahan (tidak mati)
tetapi tidak dapat tumbuh pada kadar garam tinggi,kadar garamnya dapat
mencapai 30 %.
Contoh mikroba osmofil adalah beberapa jenis khamir. Khamir osmofil
mampu tumbuhpada larutan gula dengan konsentrasi lebih dari 65 % wt/wt
(aw = 0,94). Contoh mikroba halofiladalah bakteri yang termasuk
Archaebacterium, misalnya Halobacterium. Bakteri yang tahan padakadar
garam tinggi, umumnya mempunyai kandungan KCl yang tinggi dalam selnya.
Selain itubakteri ini memerlukan konsentrasi Kalium yang tinggi untuk
stabilitas ribosomnya. Bakteri halofilada yang mempunyai membran purple
bilayer, dinding selnya terdiri dari murein, sehingga tahanterhadap ion
Natrium.
4. Ion-ion dan listrik
a. Kadar ion hidrogen (pH)
Mikroba umumnya menyukai pH netral (pH 7). Beberapa bakteri
dapat hidup pada pHtinggi (medium alkalin). Contohnya adalah bakteri
nitrat, rhizobia, actinomycetes, dan bakteripengguna urea. Hanya beberapa
bakteri yang bersifat toleran terhadap kemasaman, misalnyaLactobacilli,
Acetobacter, dan Sarcina ventriculi. Bakteri yang bersifat asidofil
misalnyaThiobacillus. Jamur umumnya dapat hidup pada kisaran pH
rendah. Apabila mikroba ditanam padamedia dengan pH 5 maka
pertumbuhan didominasi oleh jamur, tetapi apabila pH media 8
makapertumbuhan didominasi oleh bakteri.
Berdasarkan pH-nya mikroba dapat dikelompokkan menjadi 3 yaitu
(a) mikroba asidofil,adalah kelompok mikroba yang dapat hidup pada pH
2,0-5,0,
(b) mikroba mesofil (neutrofil), adalahkelompok mikroba yang dapat hidup
pada pH 5,5-8,0,


72
(c) mikroba alkalifil, adalah kelompokmikroba yang dapat hidup pada pH
8,4-9,5.
Contoh pH minimum, optimum, dan maksimum untukbeberapa jenis
bakteri adalah sebagai berikut :
Nama mikroba

pH

minimum optimum maksimum
Escherichia coli
Proteus vulgaris
Enterobacter aerogenes
Pseudomonas aeruginosa
Clostridium sporogenes
Nitrosomonas spp
Nitrobacter spp
Thiobacillus Thiooxidans
Lactobacillus acidophilus
4,4
4,4
4,4
5,6
5,0-5,8
7,0-7,6
6,6
1,0
4,0-4,6
6,0-7,0
6,0-7,0
6,0-7,0
6,6-7,0
6,0-7,6
8,0-8,8
7,6-8,6
2,0-2,8
5,8-6,6
9,0
8,4
9,0
8,0
8,5-9,0
9,4
10,0
4,0-6,0
6,8

b. Buffer
Untuk menumbuhkan mikroba pada media memerlukan pH yang
konstan, terutama padamikroba yang dapat menghasilkan asam. Misalnya
Enterobacteriaceae dan beberapaPseudomonadaceae. Oleh karenanya ke
dalam medium diberi tambahan buffer untuk menjagaagar pH nya konstan.
Buffer merupakan campuran garam mono dan dibasik, maupun senyawa-
senyawaorganik amfoter. Sebagai contoh adalah buffer fosfat anorganik
dapat mempertahankanpH diatas 7,2. Cara kerja buffe adalah garam dibasik
akan mengadsorbsi ion H
+
dan garammonobasik akan bereaksi dengan ion
OH
-

c. Ion-ion lain
Logam berat seperti Hg, Ag, Cu, Au, dan Pb pada kadar rendah dapat
bersifat meracun(toksis). Logam berat mempunyai daya oligodinamik, yaitu
daya bunuh logam berat pada kadarrendah. Selain logam berat, ada ion-ion
lain yang dapat mempengaruhi kegiatan fisiologimikroba, yaitu ion sulfat,
tartrat, klorida, nitrat, dan benzoat. Ion-ion tersebut dapat
mengurangipertumbuhan mikroba tertentu. Oleh karena itu sering
digunakan untuk mengawetkan suatubahan, misalnya digunakan dalam


73
pengawetan makanan. Ada senyawa lain yang jugamempengaruhi fisiologi
mikroba, misalnya asam benzoat, asam asetat, dan asam sorbat.


d. Listrik
Listrik dapat mengakibatkan terjadinya elektrolisis bahan penyusun
mediumpertumbuhan. Selain itu arus listrik dapat menghasilkan panas yang
dapat mempengaruhipertumbuhan mikroba. Sel mikroba dalam suspensi
akan mengalami elektroforesis apabila dilaluiarus listrik. Arus listrik
tegangan tinggi yang melalui suatu cairan akan menyebabkan
terjadinyashock karena tekanan hidrolik listrik. Kematian mikroba akibat
shock terutama disebabkan olehoksidasi. Adanya radikal ion dari ionisasi
radiasi dan terbentuknya ion logam dari elektroda jugamenyebabkan
kematian mikroba.
e. Radiasi
Radiasi menyebabkan ionisasi molekul-molekul di dalam protoplasma.
Cahaya umumnyadapat merusak mikroba yang tidak mempunyai pigmen
fotosintesis. Cahaya mempunyaipengaruh germisida, terutama cahaya
bergelombang pendek dan bergelombang panjang.Pengaruh germisida dari
sinar bergelombang panjang disebabkan oleh panas yangditimbulkannya,
misalnya sinar inframerah. Sinar x (0,005-1,0 Ao), sinar ultra violet (4000-
2950Ao), dan sinar radiasi lain dapat membunuh mikroba. Apabila tingkat
iradiasi yang diterima selmikroba rendah, maka dapat menyebabkan
terjadinya mutasi pada mikroba.

f. Tegangan muka
Tegangan muka mempengaruhi cairan sehingga permukaan cairan
tersebut menyerupaimembran yang elastis. Seperti telah diketahui
protoplasma mikroba terdapat di dalam sel yangdilindungi dinding sel,
maka apabilaada perubahan tegangan muka dinding sel
akanmempengaruhi pula permukaan protoplasma. Akibat selanjutnya
dapat mempengaruhipertumbuhan mikroba dan bentuk morfologinya. Zat-


74
zat seperti sabun, deterjen, dan zat-zatpembasah (surfaktan) seperti
Tween80 dan Triton A20 dapat mengurangi tegangan mukacairan/larutan.
Umumnya mikroba cocok pada tegangan muka yang relatif tinggi.
g. Tekanan hidrostatik
Tekanan hidrostatik mempengaruhi metabolisme dan pertumbuhan
mikroba. Umumnyatekanan 1-400 atm tidak mempengaruhi atau hanya
sedikit mempengaruhi metabolisme danpertumbuhan mikroba. Tekanan
hidrostatik yang lebih tinggi lagi dapat menghambat ataumenghentikan
pertumbuhan, oleh karena tekanan hidrostatik tinggi dapat menghambat
sintesis RNA, DNA, dan protein, serta mengganggu fungsi transport
membran sel maupun mengurangiaktivitas berbagai macam enzim.Tekanan
diatas 100.000 pound/inchi2 menyebabkan denaturasiprotein. Akan tetapi
ada mikroba yang tahan hidup pada tekanan tinggi (mikroba
barotoleran),dan ada mikroba yang tumbuh optimal pada tekanan tinggi
sampai 16.000 pound/inchi2 (barofil).Mikroba yang hidup di laut dalam
umumnya adalah barofilik atau barotoleran. Sebagai contohadalah bakteri
Spirillum.
h. Getaran
Getaran mekanik dapat merusakkan dinding sel dan membran sel
mikroba. Oleh karenaitu getaran mekanik banyak dipakai untuk
memperoleh ekstrak sel mikroba. Isi sel dapatdiperoleh dengan cara
menggerus sel-sel dengan menggunakan abrasif atau dengan
carapembekuan kemudian dicairkan berulang kali. Getaran suara 100-
10.000 x/ detik juga dapatdigunakan untuk memecah sel.

B. FAKTOR BIOTIK
Di alam jarang sekali ditemukan mikroba yang hidup sebagai biakan murni,
tetapi selaluberada dalam asosiasi dengan jasad-jasad lain. Antar jasad dalam
satu populasi atau antarpopulasi jasad yang satu dengan yang lain saling
berinteraksi.
1. Interaksi dalam satu populasi mikroba
Interaksi antar jasad dalam satu populasi yang sama ada dua macam,
yaitu interaksipositif maupun negatif. Interaksi positif menyebabkan
meningkatnya kecepatan pertumbuhansebagai efek sampingnya.


75
Meningkatnya kepadatan populasi, secara teoritis meningkatkankecepatan
pertumbuhan. Interaksi positif disebut juga kooperasi. Sebagai contoh
adalahpertumbuhan satu sel mikroba menjadi koloni atau pertumbuhan pada
fase lag (fase adaptasi).
Interaksi negatif menyebabkan turunnya kecepatan pertumbuhan
dengan meningkatnyakepadatan populasi. Misalnya populasi mikroba yang
ditumbuhkan dalam substrat terbatas, atauadanya produk metabolik yang
meracun. Interaksi negatif disebut juga kompetisi. Sebagai contohjamur
Fusarium dan Verticillium pada tanah sawah, dapat menghasilkan asam lemak
dan H
2
Syang bersifat meracun.
2. Interaksi antar berbagai macam populasi mikroba
Apabila dua populasi yang berbeda berasosiasi, maka akan timbul
berbagai macaminteraksi. Interaksi tersebut menimbulkan pengaruh positif,
negatif, ataupun tidak ada pengaruhantar populasi mikroba yang satu dengan
yang lain. Nama masing-masing interaksi adalahsebagai berikut:
Nama Interaksi
Pengaruh interaksi
Populasi A Populasi B
Netralisme
Komensalisme
Sinergisme (protokooperasi)
Mutualisme (simbiosis)
Kompetisi
Amensalisme (antagonisme)
Predasi
Parasitisme
0
0
+
+
-
+
+
+
0
+
+
+
-
-
-
-
Keterangan: 0: tidak berpengaruh, +: pengaruh positif, -: pengaruh negatif
a. Netralisme
Netralisme adalah hubungan antara dua populasi yang tidak saling
mempengaruhi. Halini dapat terjadi pada kepadatan populasi yang sangat
rendah atau secara fisik dipisahkan dalammikrohabitat, serta populasi yang
keluar dari habitat alamiahnya. Sebagai contoh interaksi antaramikroba
allocthonous (nonindigenous) dengan mikroba autochthonous (indigenous),
dan antarmikroba nonindigenous di atmosfer yang kepadatan populasinya
sangat rendah. Netralisme jugaterjadi pada keadaan mikroba tidak aktif,
misal dalam keadaan kering beku, atau fase istirahat(spora, kista).


76

b. Komensalisme
Hubungan komensalisme antara dua populasi terjadi apabila satu populasi
diuntungkan
tetapi populasi lain tidak terpengaruh. Contohnya adalah:
- Bakteri Flavobacterium brevis dapat menghasilkan ekskresi sistein. Sistein
dapatdigunakan oleh Legionella pneumophila.
- Desulfovibrio mensuplai asetat dan H2 untuk respirasi anaerobik
Methanobacterium.
c. Sinergisme
Suatu bentuk asosiasi yang menyebabkan terjadinya suatu kemampuan
untuk dapatmelakukan perubahan kimia tertentu di dalam substrat. Apabila
asosiasi melibatkan 2 populasiatau lebih dalam keperluan nutrisi bersama,
maka disebut sintropisme. Sintropisme sangatpenting dalam peruraian
bahan organik tanah, atau proses pembersihan air secara alami.Contoh
sinergisme: Streptococcus faecalis dan Escherichia coli
d. Mutualisme (Simbiosis)
Mutualisme adalah asosiasi antara dua populasi mikroba yang keduanya
salingtergantung dan sama-sama mendapat keuntungan. Mutualisme sering
disebut juga simbiosis.Simbiosis bersifat sangat spesifik (khusus) dan salah
satu populasi anggota simbiosis tidak dapatdigantikan tempatnya oleh
spesies lain yang mirip. Contohnya adalah Bakteri Rhizobium sp. Yanghidup
pada bintil akar tanaman kacang-kacangan. Contoh lain adalah Lichenes
(Lichens), yangmerupakan simbiosis antara algae sianobakteria dengan fungi.
Algae (phycobiont) sebagaiproduser yang dapat menggunakan energi cahaya
untuk menghasilkan senyawa organik. Senyawaorganik dapat digunakan oleh
fungi (mycobiont), dan fungi memberikan bentuk perlindungan(selubung)
dan transport nutrien / mineral serta membentuk faktor tumbuh untuk
algae.
e. Kompetisi
Hubungan negatif antara 2 populasi mikroba yang keduanya mengalami
kerugian.Peristiwa ini ditandai dengan menurunnya sel hidup dan


77
pertumbuhannya. Kompetisi terjadi pada2 populasi mikroba yang
menggunakan nutrien / makanan yang sama, atau dalam keadaan nutrient
terbatas. Contohnya adalah antara protozoa Paramaecium caudatum dengan
Paramaeciumaurelia.
f. Amensalisme (Antagonisme)
Satu bentuk asosiasi antar spesies mikroba yang menyebabkan salah satu
pihak dirugikan,pihak lain diuntungkan atau tidak terpengaruh apapun.
Umumnya merupakan cara untukmelindungi diri terhadap populasi mikroba
lain. Misalnya dengan menghasilkan senyawa asam,toksin, atau antibiotika.
Contohnya adalah bakteri Acetobacter yang mengubah etanol menjadiasam
asetat. Thiobacillus thiooxidans menghasilkan asam sulfat. Asam-asam
tersebut dapatmenghambat pertumbuhan bakteri lain. Bakteri amonifikasi
menghasilkan ammonium yang dapatmenghambat populasi Nitrobacter.
g. Parasitisme
Parasitisme terjadi antara dua populasi, populasi satu diuntungkan (parasit)
dan populasilain dirugikan (host / inang). Umumnya parasitisme terjadi karena
keperluan nutrisi dan bersifatspesifik. Ukuran parasit biasanya lebih kecil dari
inangnya. Terjadinya parasitisme memerlukankontak secara fisik maupun
metabolik serta waktu kontak yang relatif lama. Contohnya adalahbakteri
Bdellovibrio yang memparasit bakteri E. coli. Jamur Trichoderma sp.
memparasit jamurAgaricus sp.
h. Predasi
Hubungan predasi terjadi apabila satu organisme predator memangsa atau
memakan danmencerna organisme lain (prey). Umumnya predator berukuran
lebih besar dibandingkan prey,dan peristiwanya berlangsung cepat. Contohnya
adalah Protozoa (predator) dengan bakteri (prey).Protozoa Didinium nasutum
(predator) dengan Paramaecium caudatum (prey).






78
Cara Kerja Penentuan Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu
inkubasi 5
0
C, 25
0
C, 37
0
C, dan 50
0
C dan
mikroorganisma yang berbeda (E.coli dan Bacillus
sp.) diberi label . Setelah diinokulasi dengan bekteri
yang berbeda, diinkubasi sesuai suhu yang tertera
setelah ditumbuhkan selama 48 jam, bandingkan
derajat kekeruhannya.

Cara Kerja Penentuan Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan
mikroorganisme
buat 4 buah cawan NutrientAgar yang mengandung NaCl
0,5%, 3%, 5% dan 15%.
Setiap konsentrasi, cawan dibagi menjadi 2 dengan spidol
kemudian labeli dengan bakteri E.coli dan Bacillus sp.
Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. dengan streak kontinyu
Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan
media yang tidak ditambahi NaCl.
Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhannya

Cara Kerja Penentuan Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan
mikroorganisme
Sinar UV panjang gelombang 210-300 nm dapat
membunuh mikroorganisme jika di paparkan.
Komponen seluler yang dapat menyerap sinar UV
adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan
menyebabkan kematian.
Cara Kerja:
Inokulasikan Aspergillus sp., E.coli dan Bacillus sp.
pada 3 cawan NA.


79
Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm selama 1
menit, 5 menit, dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan diusahakan lingkungan
sekitar steril). Jarak antar UV dan cawan sekitar 12 inchi
Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan pada
sinar UV
Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya
Cara Kerja Penentuan Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime
Cara Kerja :
Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3, 7 dan 9) masing-masing 2
tabung untuk tiap nilai pH
Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan
Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E.coli lalu diinkubasi pada suhu 37
0
C
selama 48 jam
Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH















80





Pertumbuhan adalah penambahan secara teratur semua komponen sel suatu
jasad. Pembelahan sel adalah hasil dari pembelahan sel. Pada jasad bersel tunggal
(uniseluler), pembelahan atau perbanyakan sel merupakan pertambahan jumlah
individu. Misalnya pembelahan sel pada bakteri akan menghasilkan pertambahan
jumlah sel bakteri itu sendiri. Pada jasad bersel banyak (multiseluler), pembelahan
sel tidak menghasilkan pertambahan jumlah individunya, tetapi hanya merupakan
pembentukan jaringan atau bertambah besar jasadnya. Dalam membahas
pertumbuhan mikrobia harus dibedakan antara pertumbuhan masing-masing
individu sel dan pertumbuhan kelompok sel atau pertumbuhan populasi.
A. Pertumbuhan Populasi
Pertumbuhan dapat diamati dari meningkatnya jumlah sel atau massa sel
(berat kering sel). Pada umumnya bakteri dapat memperbanyak diri dengan
pembelahan biner, yaitu dari satu sel membelah menjadi 2 sel baru, maka
pertumbuhan dapat diukur dari bertambahnya jumlah sel. Waktu yang diperlukan
untuk membelah diri dari satu sel menjadi dua sel sempurna disebut waktu
generasi. Waktu yang diperlukan oleh sejumlah sel atau massa sel menjadi dua
kali jumlah/massa sel semula disebut doubling time atau waktu penggandaan.
Waktu penggandaan tidak sama antara berbagai mikrobia, dari beberapa menit,
beberapa jam sampai beberapa hari tergantung kecepatan pertumbuhannya.
Kecepatan pertumbuhan merupakan perubahan jumlah atau massa sel per unit
waktu.
B. Penghitungan Waktu Generasi
Dari hasil pembelahan sel secara biner:
1 sel menjadi 2 sel
2 sel menjadi 4 sel 21 menjadi 22 atau 2x2
4 sel menjadi 8 sel 22 menjadi 23 atau 2x2x2
Bab 7


81
Dari hal tersebut dapat dirumuskan menjadi:


N: jumlah sel akhir, N
0
: jumlah sel awal, n: jumlah generasi



t: waktu pertumbuhan eksponensial, n: jumlah generasi

Dalam bentuk logaritma, rumus N = N
0
x 2n menjadi:
log N = log N0 + n log 2
log N log N0 = n log 2





Contoh:
N = 10
8
, N
0
= 5x10
7
, t = 2

Dengan rumus dalam bentuk logaritma:



Jadi waktu generasinya adalah



Waktu generasi juga dapat dihitung dari slope garis dalam plot semilogaritma
kurvapertumbuhan eksponensial, yaitu dengan rumus, slope = 0,301/ waktu
generasi. Darigrafik pertumbuhan tersebut diketahui bahwa slope = 0,15,
sehingga juga diperolehwaktu generasi = 2 jam

C. Pengukuran Pertumbuhan
Pertumbuhan diukur dari perubahan jumlah sel atau berat kering massa
sel.Jumlah sel dapat dihitung dari jumlah sel total yang tidak membedakan
jumlah sel hidupatau mati, dan jumlah sel hidup (viable count). Jumlah total sel
mikrobia dapatditetapkan secara langsung dengan pengamatan mikroskopis,
dalam bentuk sampelkering yang diletakkan di permukaan gelas benda (slide) dan
N = N
0
x 2n



0




82
dalam sampel cairan yangdiamati menggunakan metode counting chamber,
misalnya dengan alat Petroff-HausserBacteria Counter (PHBC) untuk menghitung
bakteri atau dengan alat haemocytometeruntuk menghitung khamir, spora, atau
sel-sel yang ukurannya relatif lebih besar daribakteri.
Jumlah sel hidup dapat ditetapkan dengan metode plate count atau
colony count,dengan cara ditaburkan pada medium agar sehingga satu sel hidup
akan tumbuhmembentuk satu koloni, jadi jumlah koloni dianggap setara dengan
jumlah sel. Cara iniada dua macam, yaitu metode taburan permukaan (spread
plate method) dan metodetaburan (pour plate method).
Cara lain untuk menghitung jumlah sel hidup adalahdengan filter
membran dan MPN (Most Probable Number) yang menggunakan mediumcair.
Sampel mikrobia yang dihitung biasanya dibuat seri pengenceran.Pertumbuhan
sel dapat diukur dari massa sel dan secara tidak langsung denganmengukur
turbiditas cairan medium tumbuh. Massa sel dapat dipisahkan dari
cairanmediumnya menggunakan alat sentrifus (pemusing) sehingga dapat diukur
volumemassa selnya atau diukur berat keringnya (dikeringkan dahulu dengan
pemanasan padasuhu 90-110
0
C semalam). Umumnya berat kering bakteri adalah
10-20 % dari beratbasahnya.
Turbiditas dapat diukur menggunakan alat photometer (penerusan
cahaya),semakin pekat atau semakin banyak populasi mikrobia maka cahaya yang
diteruskansemakin sedikit. Turbiditas juga dapat diukur menggunakan
spektrofotometer (opticaldensity/ OD), yang sebelumnya dibuat kurva standart
berdasarkan pengukuran jumlahsel baik secara total maupun yang hidup saja
atau berdasarkan berat kering sel. Unitphotometer atau OD proporsional dengan
massa sel dan juga jumlah sel, sehingga caraini dapat digunakan untuk
memperkirakan jumlah atau massa sel secara tidak langsung.
D. Menentukan Ukuran Mikroorganisme
Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan
mikrometer. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis
micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif. Mikrometer okuler


83
dipasang pada lensa okuler mikroskop, sedangkan micrometer objektif berbentuk
slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Jarak antar garis skala
pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang
digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. Jarak ini dapat
ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif.
Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui, menjadi tolak ukur
untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. 1 skala micrometer objektif
= 0,01 mm / 10 m.
Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan
okuler pada perbesaran yang diinginkan. Skala ke nol (garis pertama) kedua
mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa
kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Dari hasil tersebut
dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu
berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di
antara garis yang berhimpit tadi.

Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer
objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer
objektif maka beberapa 1 skala okuler.



84
Cara Kerja :

Kalibrasi :
Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler
pada tabung lensa okuler.
Tentukan perbesaran yang digunakan, (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar
perbesaran dari skala mikrometer objektif.
Setelah fokus didapat, kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer
objektif dan okuler.
Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang
berhimpit lagi.
Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.

cara kalibrasi cara mengukur mikroba

Penentuan ukuran mikroba

-Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda.
-Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan
-Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama.
-Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler.
-Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama. Tabung lensa okuler dapat
diputar dan dicari posisi yang pas.
-Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya :


85

Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya :
x skala okuler X hasil kalibrasi
y skala okuler X hasil kalibrasi
misal : 5 X 1,54 = 7,7 m
2 X 1,54 = 3,08 m
Menentukan jumlah mikroorganisme (enumerasi)
A. penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung)
a.1. Plate Count (hitungan cawan)
Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel
mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah
ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah
diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau
dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.
Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena
beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau
berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units
(CFUs) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh
menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui
jumlah bakterinya.
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut
- Satu koloni dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
- Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung.
- Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.



86




Cara menghitung sel relatif / CFUs per ml
CFUs / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran
Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 -6 dengan metode
Spread Plate dan Pour Plate.

Spread plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFUs / 0,1 ml
Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFUs / 0,1 ml
SP = 0,1 ml = 500 000 000 CFUs / ml
= 5x108 CFUs / ml
Pour plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFUs / 1 ml
Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFUs / 0,1 ml
SP = 1 ml = 5x107 CFUs / ml
Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika
koloni yang tumbuh terlalu banyak. Transek
dibuat dengan spidol/marker di bagian
bawah cawan petri. Pola transek dapat
dibuat bervariasi, tergantung kebutuhan.
Penghitungan akan lebih mudah bila
memakai Colony Counter.
SYARAT-SYARAT PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI MENURUT AOAC
(Association Of Official Analytical Chemistry) EDISI 14 Tahun 1984:
a. Hitung jumlah koloni, kalikan jumlah koloni (atau rata-rata jumlah , jika
dilakukan ulangan dalam pengenceran yang sama) dengan kebalikan dari
pengencerannya. Catat pengenceran yang digunakan dan jumlah koloni yang
terhitung atau diduga pada tiap petri. Untuk mencegah kesalahan ketelitian
dan akurasi, catat hanya dua digit pertama saja. Digit kedua dapat ditingkatkan
jika digit ketiga di atas 5. Gunakan nol untuk digit setelah digit kedua. Laporkan
jumlah atau dugaan jumlah sebagai cfu/g atau cfu/mL


87
b. Jika jumlah pada ulangan petri atau pengenceran berurutan dirata-rata, hanya
yang memenuhi syarat yang dirata-rata.
Contoh:
Pengenceran 1:100 jumlah koloni 224 dan 180
Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 28 dan sp (spreader)
Pengenceran 1:100 dirata-rata, hasilnya 202. Pengenceran 1:1000 yang diambil
hanya 28 karena sp tidak memenuhi syarat.
( )
241
2
202 280
4 , 1
202
280
an perbanding rasio/
=
+
=
= =
rata rata

jumlah mikroba = rata-rata x
Fp
1

= 241 x
3
10 . 1
1

= 24.100
Karena digit ketiga kurang dari 5, maka jumlah mikroba adalah 24.000 cfu/g


ATURAN LENGKAP UNTUK PERHITUNGAN JUMLAH KOLONI
1. Jumlah koloni 25-250
Seleksi petri dengan jumlah koloni antara 25 sampai 250, tidak termasuk
sreader. Hitung semua koloni termasuk yang kecil, catat pengenceran yang
digunakan lalu hitung jumlah mikrobanya.
Pengenceran
Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL)
1:100 1:1000
234*
Sp
305
243*
23
31*
42*
kl
23.000
31.000
42.000
24.000
Keterangan:
*= jumlah koloni yang memenuhi syarat
Sp= spreader
Kl= kesalahan laboratoris





88
2. Ulangan
Pakai pengenceran yang jumlah koloninya memenuhi syarat, lalu dirata-rata
kemudian dikali Fp (faktor pengenceran)hingga diperoleh jumlah
mikrobanya
Contoh:
Pengenceran
Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL)
1:100 1:1000
175*
208*
16
17
( )
g cfu jml
rata rata
/ 000 . 19
10 . 1
1
5 , 191
5 , 191
2
208 175
2
= =
=
+
=


Jika hanya satu petri dari pasangan petri yang memenuhi syarat 25-250,
hitung kedua petri, kecuali untuk spreader
Contoh:
Pengenceran
Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL)
1:100 1:1000
275
24
24
35*
( )
g cfu jml
rata rata
/ 000 . 30
10 . 1
1
5 , 29
5 , 29
2
32 24
3
= =
=
+
=


3. Pengenceran berurutan dengan jumlah koloni 25-250
Jika jumlah koloni antara 25-250, maka cari rasio antar pengenceran.
Apabila rasionya kurang dari 2, maka jumlah mikroba diperoeh dari nilai
rata-rata. Jika rasionya lebih besar atau sama dengan 2, maka digunakan
data dari pengenceran terendah
Contoh:
No
Pengenceran
rasio
Jumlah
(cfu/g atau
cfu/mL)
1:100 1:1000
1 243* 34* 1,4 29.000
2 140* 32* 2,3 14.000
3 228* 28* 1,2 25.000
4 138*
162*
42*
30*
2,4 15.000
5
228*
240*
28*
23
1,1 25.000


89
6
224*
180*
28*
sp
1,4 24.000
Contoh perhitungan:
Contoh no 1.
( )
000 . 29
2
243 340
2 4 , 1
243
340
=
+
=
< = =
jumlah
rasio

Contoh no 4.
( )
000 . 15
10 . 1
1
150
2
162 138
2 4 , 2
2
162 138
2
300 420
2
= =
+
=
> =
|
.
|

\
| +
|
.
|

\
| +
=

Fp jumlah
rasio

4. Tidak ada petri dengan jumlah koloni antara 25-250 dan salah satu petri
memiliki jumlah koloni lebih dari 250, maka pilih yang paling mendekati 250
dan tulis sebagai hasil dugaan (dug)cfu/mL
Contoh:
Pengenceran
Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL)
1:100 1:1000
325 20
g cfu jml / 000 . 33
10 . 1
1
325
2
= =

5. Semua petri dengan jumlah koloni kurang dari 25
Catat jumlah koloni yang sebenarnya pada pengenceran paling rendah dan
laporkan sebagai dugaan cfu/mL atau cfu/g
Contoh:
Pengenceran
Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL)
1:100 1:1000
0 0 < 100 (dug) cfu/g
18
16
2
0
< 1700 (dug) cfu/g
6. Tidak ada koloni yang tumbuh (tidak ada senyawa penghambat)
Laporkan jumlah pendugaan dengan kurang dari pada pengenceran paling
rendah
Contoh:
Pengenceran
Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL)
1:100 1:1000
0 0 < 100 (dug) cfu/g
7. Jumlah koloni lebih dari 250
Hitung koloni dalam bagian petri berdasar distribusi yang mewakili.


90
- Jika dalam hitungan ada <10 koloni/ cm
2
, pilih dalam 12 cm
2
dengan cara
6 luasan horizontal berurutan dan 6 luasan sudut kanan berurutan
- Jika dalam hitungan ada <10 koloni/ cm
2
, hitung koloni dalam 4 luasan
yang mewakili (seperti di atas) kalikan dengan rata-rata jumlah koloni
per cm
2
dengan luas petri (pada umumnya sekitar 56 cm
2
).
8. spreader
- tipe pertama / rantai koloni
ciri: koloni tidak dapat dipisahkan secara tepat karena ada disintegrasi
gumpalan bakteri ketika inokulum ditebarkan dalam media tanam.
Jika satu atau lebih rantai jelas berasal dari sumber terpisah, hitung masing-
masing sebagai 1 koloni. Jangan hitung tiap-tiap koloni individu dalam rantai
sebagai koloni terpisah.

- tipe kedua
ciri: perkembangan koloni meluas dalam film air antara agar dan dasar petri,
terjadi karena ada akumulasi kelembaban pada tiap sebaran asli
spreader ini dapat mewakili pertumbuhan koloni individu jika pengenceran
terdistribusi secara merata dalam medium
- tipe ketiga
ciri: terbentuk dalam film air pada permukaan agar, sama seperti tipe kedua,
spreader ini terjadi karena ada akumulasi kelembaban pada tiap sebaran asli
spreader ini juga dapat mewakili pertumbuhan koloni individu jika pengenceran
terdistribusi secara merata dalam medium

a.1.3 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate
Count.
- Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab,
maserasi dan rinse) (jika perlu).
- Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran
pertama, selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya
sampai 10-8) tertentu.
- Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien
Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran
(duplo).
- Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. Jika secara Spread
Plate, dapat digunakan batang L atau glass beads.
- Inkubasi pada suhu 30 C selama 1-2 x 24 jam.
- Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan yang telah
diuraikan di depan.




91


a.2 Most Probable Number (MPN)
Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan
metode MPN. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan).
Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri
pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang
merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu
bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora,
memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu
24 jam inkubasi pada 37 C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung
sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3
tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri.
Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan
pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung
berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media
LBDS (Lactose Broth Double Stregth) yang memiliki komposisi Beef extract
(3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per
liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS
(Lactose Broth Single Stregth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar
laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr.
Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa
menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas
dalam tabung durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah
tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.

Cara kerja :
- Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9
ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung
menjadi 3 seri (seperti di gambar).
- Kocok botol yang berisi air sampel.
- Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri
pertama (3 tabung LBDS), secara aseptis.
- Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri
kedua (3 tabung LBSS), secara aseptis.
- Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri
ketiga (3 tabung LBSS), secara aseptis.
- Inkubasi semua tabung pada suhu 37 C selama 48 jam.


92
- Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung
tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal :
3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk
seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.










Misal :
didapatkan kombinasi jumlah tabung
positif : 321 maka jumlah bakteri coliform
adalah 150 sel/100 ml.


A. Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung)
Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu
dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat
yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer.
Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai
volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar
juga tertentu.
Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar
di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu
kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu
kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini


93
adalah 0,1 mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang
hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.




















Luas kotak sedang :
= p x l
= 0,2 x 0,2 = 0,04 mm2 jadi misalnya diperoleh:
Volume kotak sedang : 20 sel dalam satu kotak sedang
= 0,04 mm2 x 0,1 mm maka jumlah sel keseluruhan :
= 0,004 mm3 = 20 x (1/4) x 106


94
Karena 1 ml = 1cm2 = 5 x 106 sel/ml
Maka :
= 0,004 mm3
= 0,000004 cm3
= 4x10-6 ml
Sel/ml = jumlah sel/4x10-6 ml
Sel/mL= (jumlah sel/4) x 106
sel/mL= jumlah sel x () x 106
sel/mL= jumlah sel x 2,5 x 105

Kotak sedang :

Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105

Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk
kotak kecil :
Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 10
6


Cara kerja (digunakan kotak sedang) :
- Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer
dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue.
- Letakkan cover glass di atas alat hitung.
- Tambahkan 50 l suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara
meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan
menyebar karena daya kapilaritas.
- Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air
dari efek kapilaritas).
- Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada
perbesaran 40x10.
- Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran
atau tidak
- Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan
bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan
pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10.
- Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak
lebih baik).
- Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan
rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah
sel/ml dikalikan faktor pengenceran.



95







Enzim adalah katalisator organik (biokatalisator) yang dihasilkan oleh sel.
Enzimberfungsi seperti katalisator anorganik, yaitu untuk mempercepat reaksi kimia.
Setelahreaksi berlangsung, enzim tidak mengalami perubahan jumlah, sehingga
jumlah enzimsebelum dan setelah reaksi adalah tetap. Enzim mempunyai
selektivitas dan spesifitasyang tinggi terhadap reaktan yang direaksikan dan jenis
reaksi yang dikatalisasi.

Struktur Enzim
Enzim tersusun atas dua bagian yaitu bagian protein (apoenzim) dan bagian
nonprotein gugus prostetik). Gabungan antara aponzim dan koenzim disebut
holoenzim. Pada umumnya enzim tersusun dari protein. Protein penyusun enzim
dapatberupa protein sederhana atau protein yang terikat pada gugusan non-
protein. Banyakenzim yang hanya terdiri protein saja, misal tripsin.
Dialisis enzim dapat memisahkan bagian-bagian protein, yaitu bagian
proteinyang disebut apoenzim dan bagian nonprotein yang berupa koenzim, gugus
prostetisdan kofaktor ion logam. Masing-masing bagian tersebut apabila terpisah
menjadi tidakaktif. Apoenzim apabila bergabung dengan bagian nonprotein disebut
holoenzim yangbersifat aktif sebagai biokatalisator.Koenzim dan gugus prostetik
berfungsi sama. Koenzim adalah bagian yangterikat secara lemah pada apoenzim
(protein). Gugus prostetik adalah bagian yangterikat dengan kuat pada apoenzim.
Koenzim berfungsi menentukan jenis reaksi kimiayang dikatalisis enzim. Ion logam
merupakan komponen yang sangat penting,diperlukan untuk memantapkan struktur
protein dengan adanya interaksi antar muatan.

Cara Kerja Enzim
Enzim meningkatkan kecepatan reaksi dengan cara menurunkan energi
aktivasi.Energi aktivasi adalah energi yang diperlukan untuk mengaktifkan suatu
reaktansehingga dapat bereaksi untuk membentuk senyawa lain. Energi potensial
hasil reaksimenjadi lebih rendah dari pada pereaksi, sehingga kesetimbangan reaksi
menuju kehasil reaksi. Adanya enzim menyebabkan energi aktivasi menjadi lebih
rendah, tetapienzim tidak mempengaruhi letak kesetimbangan reaksi.Saat
berlangsungnya reaksi enzimatik terjadi ikatan sementara antara enzimdengan
substratnya (reaktan). Ikatan sementara ini bersifat labil dan hanya untuk
waktuyang singkat saja. Selanjutnya ikatan enzim-substrat akan pecah menjadi
Bab 8


96
enzim danhasil akhir. Enzim yang terlepas kembali setelah reaksi dapat berfungsi lagi
sebagaibiokatalisator untuk reaksi yang sama.
Reaksi enzim dapat dituliskan sebagai berikut;

E + S ES E + P
enzim substrat kompleks enzim + produk
enzim substrat
PENGGOLONGAN ENZIM
Enzim dapat digolongkan berdasarkan tempat bekerjanya, substrat
yangdikatalisis, daya katalisisnya, dan cara terbentuknya. Umumnya pemberian
nama enzimdidasarkan atas nama substrat yang dikatalisis atau daya katalisisnya
denganpenambahan kata ase. Misal proteinase adalah enzim yang dapat
mengkatalisispemecahan protein.
1. Penggolongan enzim berdasarkan tempat bekerjanya
a. Endoenzim
Endoenzim disebut juga enzim intraseluler, yaitu enzim yang bekerjanya
didalam sel. Umumnya merupakan enzim yang digunakan untuk proses
sintesis di dalamsel dan untuk pembentukan energi (ATP) yang berguna untuk
proses kehidupan sel,misal dalam proses respirasi.
b. Eksoenzim
Eksoenzim disebut juga enzim ekstraseluler, yaitu enzim yang bekerjanya di
luarsel. Umumnya berfungsi untuk mencernakan substrat secara hidrolisis,
untuk dijadikan
molekul yang lebih sederhana dengan BM lebih rendah sehingga dapat masuk
elewati
membran sel. Energi yang dibebaskan pada reaksi pemecahan substrat di luar
sel tidak
digunakan dalam proses kehidupan sel.
2. Penggolongan enzim berdasarkan daya katalisis
a. Oksidoreduktase
Enzim ini mengkatalisis reaksi oksidasi-reduksi, yang merupakan
pemindahanelektron, hidrogen atau oksigen. Sebagai contoh adalah enzim
elektron transferoksidase dan hidrogen peroksidase (katalase). Ada beberapa
macam enzim electron transfer oksidase, yaitu enzim oksidase, oksigenase,
hidroksilase dan dehidrogenase.
b. Transferase
Transferase mengkatalisis pemindahan gugusan molekul dari suatu molekul
kemolekul yang lain. Sebagai contoh adalah beberapa enzim sebagai berikut:
- Transaminase adalah transferase yang memindahkan gugusan amina.
- Transfosforilase adalah transferase yang memindahkan gugusan fosfat.
- Transasilase adalah transferase yang memindahkan gugusan asil.



97
c. Hidrolase
Enzim ini mengkatalisis reaksi-reaksi hidrolisis, dengan contoh enzim adalah:
- Karboksilesterase adalah hidrolase yang menghidrolisis gugusan ester
karboksil.
- Lipase adalah hidrolase yang menghidrolisis lemak (ester lipida).
- Peptidase adalah hidrolase yang menghidrolisis protein dan polipeptida.
d. Liase
Enzim ini berfungsi untuk mengkatalisis pengambilan atau penambahan
gugusan
dari suatu molekul tanpa melalui proses hidrolisis, sebagai contoh adalah:
- L malat hidroliase (fumarase) yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi
pengambilan air
dari malat sehingga dihasilkan fumarat.
- Dekarboksiliase (dekarboksilase) yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi
pengambilan
gugus karboksil.
e. Isomerase
Isomerase meliputi enzim-enzim yang mengkatalisis reaksi isomerisasi, yaitu:
- Rasemase, merubah l-alanin D-alanin
- Epimerase, merubah D-ribulosa-5-fosfat D-xylulosa-5-fosfat
- Cis-trans isomerase, merubah transmetinal cisrentolal
- Intramolekul ketol isomerase, merubah D-gliseraldehid-3-fosfat dihidroksi
aseton
fosfat
- Intramolekul transferase atau mutase, merubah metilmalonil-CoA suksinil-
CoA
f. Ligase
Enzim ini mengkatalisis reaksi penggabungan 2 molekul dengan
dibebaskannyamolekul pirofosfat dari nukleosida trifosfat
g. Enzim lain dengan tatanama berbeda
Ada beberapa enzim yang penamaannya tidak menurut cara di atas, misalnya
enzim pepsin, triosin, dan sebagainya serta enzim yang termasuk enzim
permease.
Permease adalah enzim yang berperan dalam menentukan sifat selektif
permiabel dari
membran sel.
3. Penggolongan enzim berdasar cara terbentuknya
a. Enzim konstitutif
Di dalam sel terdapat enzim yang merupakan bagian dari susunan sel
normal,sehingga enzim tersebut selalu ada umumnya dalam jumlah tetap
pada sel hidup.Walaupun demikian ada enzim yang jumlahnya dipengaruhi
kadar substratnya, misalnyaenzim amilase. Sedangkan enzim-enzim yang
berperan dalam proses respirasijumlahnya tidak dipengaruhi oleh kadar
substratnya.




98
b. Enzim adaptif
Perubahan lingkungan mikroba dapat menginduksi terbentuknya enzim
tertentu.Induksi menyebabkan kecepatan sintesis suatu enzim dapat
dirangsang sampaibeberapa ribu kali. Enzim adaptif adalah enzim yang
pembentukannya dirangsang oleh
adanya substrat. Sebagai contoh adalah enzim beta galaktosidase yang
dihasilkan oleh
bakteri E.coli yang ditumbuhkan di dalam medium yang mengandung laktosa.
Mula-mulaE. coli tidak dapat menggunakan laktosa sehingga awalnya tidak
nampak adanya
pertumbuhan (fase lag/fase adaptasi panjang) setelah beberapa waktu
barumenampakkan pertumbuhan. Selama fase lag tersebut E. coli membentuk
enzim beta
galaktosidase yang digunakan untuk merombak laktosa.

FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI REAKSI ENZIMATIK
Protein adalah bagian utama enzim yang dihasilkan sel, maka semua hal yang
dapat mempengaruhi protein dan sel akan berpengaruh terhadap reaksi enzimatik.
1. Substrat (reaktan)
Kecepatan reaksi enzimatik umumnya dipengaruhi kadar substrat.
Penambahankadar substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang
tetap, akanmempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai maksimum.
Penambahan substratselanjutnya tidak akan menambah kecepatan
reaksi.Kecepatan reaksi enzimatik juga dipengaruhi kadar enzim, jumlah enzim
yangterikat substrat (ES) dan konstanta Michaelis (Km). Km menggambarkan
mesetimbangandisosiasi kompleks ES menjadi enzim dan substrat. Nilai Km kecil
berarti enzimmempunyai afinitas tinggi terhadap substrat maka kompleks ES
sangat mantap,sehingga kesetimbangan reaksi kearah kompleks ES. Apabila nilai
Km besar berartienzim mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga
kesetimbangan reaksikearah E + S.
2. Suhu
Seperti reaksi kimia pada umumnya, maka reaksi enzimatik dipengaruhi
olehsuhu. Kenaikan suhu sampai optimum akan diikuti pula oleh kenaikan
kecepatan reaksienzimatik. Kepekaan enzim terhadap suhu pada keadaan suhu
melebihi optimumdisebabkan terjadinya perubahan fisikokimia protein
penyusun enzim. Umumnya enzimmengalami kerusakan (denaturasi) pada suhu
diatas 50oC. Walaupun demikian adabeberapa enzim yang tahan terhadap suhu
tinggi, misalnya taka-diastase dan tripsin.
3. Kemasaman (pH)
pH dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Daya katalisis enzim menjadi
rendahpada pH rendah maupun tinggi, karena terjadinya denaturasi protein
enzim. Enzimmempunyai gugus aktif yang bermuatan positif (+) dan negatif (-).
Aktivitas enzim akanoptimum kalau terdapat keseimbangan antara kedua
muatannya. Pada keadaan masammuatannya cenderung positif, dan pada
keadaan basis muatannya cenderung negative sehinggaaktivitas enzimnya


99
menjadi berkurang atau bahkan menjadi tidak aktif. pHoptimum untuk masing-
masing enzim tidak selalu sama. Sebagai contoh amilase jamurmempunyai pH
optimum 5,0, arginase mempunyai pH optimum 10.
4. Penghambat enzim (inhibitor)
Inhibitor enzim adalah zat atau senyawa yang dapat menghambat enzim dengan
beberapa cara penghambatan sebagai berikut:
a. Penghambat bersaing (kompetitif)
Penghambatan disebabkan oleh senyawa tertentu yang mempunyai
strukturmirip dengan substrat saat reaksi enzimatik akan terjadi. Misalnya
asam malonat dapatmenghambat enzim dehidrogenase suksinat pada
pembentukan asam fumarat darisuksinat. Struktur asam suksinat mirip
dengan asam malonat. Dalam reaksi ini asammalonat bersaing dengan asam
suksinat (substrat) untuk dapat bergabung denganbagian aktif protein enzim
dehidrogenase. Penghambatan oleh inhibitor dapat dikurangidengan
menambah jumlah substrat sampai berlebihan. Daya
penghambatannyadipengaruhi oleh kadar penghambat, kadar substrat dan
aktivitas relatif antarapenghambat dan substrat.
b. Penghambat tidak bersaing (non-kompetitif)
Zat-zat kimia tertentu mempunyai afinitas yang tinggi terhadap ion
logampenyusun enzim. Senyawa-senyawa seperti sianida, sulfida, natrium
azida, dan karbonmonooksida adalah senyawa penghambat untuk enzim
yang mengandung Fe, yaitudengan terjadinya reaksi antara senyawa-
senyawa tersebut dengan ion Fe yangmenyebabkan enzim menjadi tidak
aktif. Merkuri (Hg) dan perak (Ag) merupakanpenghambat enzim yang
mengandung gugusan sulfhidril (-SH).
Pada penghambatan nonkompetitif tidak terjadi persaingan antara
zatpenghambat dengan substrat. Misalnya enzim sitokrom oksidase
dihambat oleh CO(karbon monooksida) dengan mengikat Fe yang
merupakan gugusan aktif enzimtersebut. Penghambatan nonkompetitif tidak
dapat dikurangi dengan penambahanjumlah substrat, oleh karena daya
penghambatannya dipengaruhi oleh kadarpenghambat dan afinitas
penghambat terhadap enzim.
c. Penghambat umpan balik (feed back inhibitor)
Penghambatan umpan balik disebabkan oleh hasil akhir suatu
rangkaian reaksienzimatik yang menghambat aktifitas enzim pada reaksi
pertama. Hasil akhir reaksi jugamempengaruhi pembentukan enzim.
d. Penghambat represor
Represor adalah hasil akhir suatu rangkaian reaksi enzimatik yang
dapatmempengaruhi atau mengatur pembentukan enzim-enzim pada reaksi
sebelumnya.
e. Penghambat alosterik
Penghambat alosterik adalah penghambat yang dapat mempengaruhi
enzimalosterik. Enzim alosterik adalah enzim yang mempunyai dua bagian


100
aktif, yaitu bagianaktif yang menangkap substrat dan bagian yang
menangkap penghambat. Apabila adasenyawa yang dapat memasuki bagian
yang menangkap penghambat maka enzimmenjadi tidak aktif, senyawa
penghambat tersebut merupakan penghambat alosterik.Struktur senyawa
penghambat alosterik tidak mirip dengan struktur substrat.
Pengikatanpenghambat alosterik pada enzim menyebabkan enzim tidak
aktif, sehingga substrattidak dapat dikatalisis dan tidak menghasilkan produk.
Apabila enzim menangkapsubstrat maka penghambat tidak dapat terikat
pada enzim, sehingga enzim dapat aktifmereaksikan substrat menjadi
produk.
5. Aktivator (penggiat) atau kofaktor
Aktivator atau kofaktor adalah suatu zat yang dapat mengaktifkan enzim
yangsemula belum aktif. Enzim yang belum aktif disebut pre-enzim atau
zymogen (simogen).Kofaktor dapat berbentuk ion-ion dari unsur H, Fe, Cu,
Mg, Mo, Zn, Co, atau berupakoenzim, vitamin, dan enzim lain.
7. Penginduksi (induktor)
Induktor adalah suatu substrat yang dapat merangsang pembentukan
enzim.Sebagai contoh adalah laktosa dapat menginduksi pembentukan
enzim beta galaktosidase.
Aktivitas enzimatis mikroorganisme :
a. Uji aktivitas eksoenzim :
Uji amilolitik
Uji lipolitik
Uji proteolitik
b. Uji aktivitas endoenzim :
Uji oksidase
Uji katalase
Uji Triple Sugar Iron Agar
Uji Amilolitik
Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas
polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik.
Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan
memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan
selanjutnya menjadi maltosa. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa
terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada


101
uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk
warna biru hitam yang terlihat pada media.
Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi
pati digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan
bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada
media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada
amilum yang berbentuk spiral.









Cara Kerja :
Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E.coli dan
Bacillus sp. secara streak.
Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37
o
C
Setelah selesai inkubasi, tetesi cawan dengan lugolsiodine secukupnya
sehingga seluruh permukaan media terkena.
Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan
hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam.








102
Uji Lipolitik
Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah
mikroorganisma. Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan
enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol
dan asam lemak.
Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase
diantaranya adalah dengan menggunakan media TrybutirinAgar,
RodhamineAgar dan SpiritBlueAgar. Pada prinsipnya metode-metode di atas
menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak
yang terbentuk akibat hidrolisis lemak.
Cara Kerja :
Inokulasikan Bacillus sp. dan E. coli pada mediaTributyrin Agar dengan
indikator neutral red
Inkubasi pada suhu 37
o
C selama 48 jam.
Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni,
sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna
merah.

Uji proteolitik
Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan
dalam bentuk kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan
menghasilkan monomernya berupa asam amino. Proses ini dinamakan
peptonisasi atau proteolisis



103

Cara Kerja :
Inokulasikan Bacillus sp. Dan E. coli pada Skim Milk Agar (SMA)
Inkubasi pada suhu 37
o
C selama 48 jam.
Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling
koloni.
Uji Oksidase

Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron
selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan
reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh
bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini
menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian
karbohidrat untuk menghsilkan energi. Kemampuan bakteri memproduksi
sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah
pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian
dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif.
Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-phenylene diamine
dihydrocloride. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini
sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru
kehitaman. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah
ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya
perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif.


104
Cara Kerja :
Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis
dan diinokulasikan pada Objectglass.
Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada
kertas.
Tetesi dengan reagen, lalu lihat perubahan yang terjadi
Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif, sedangkan bila
tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika
warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi.


Uji Katalase
Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme
menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida
yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan
kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme
aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur
respirasi aerobik.

Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk
penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat


105
katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan
reagen H
2
O
2
pada suspensi bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti
bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan
gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif.
Cara Kerja :
Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan
diinokulasikan pada Objectglass.
Dengan menggunakan pipet tetes, 3% H
2
O
2

diteteskan pada Objectglass secukupnya.
Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan
tidak ada gelembung untuk hasil negatif (hati-hati
membedakan antara gelembung yang muncul dari
sel dengan kumpulan sel yang mengambang akibat
ditambahi reagen).



Uji Triple Sugar Iron Agar
TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis
bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae, yang bersifat gram
negatif dan memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat
dibedakan dengan bakteri gram negatif intestinal lain. Perbedaan ini
didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H
2
S pada tabung
reaksi.
Untuk mengamati fermentasi karbohidrat, media TSIA mengandung
laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%, dan mengandung glukosa
dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,1%. Konsentrasi ini akan
berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang
terbentuk. Indikator pH (Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan
adanya perubahan pH akibat fermentasi karbohidrat. Perubahan warna
menjadi kuning menandakan asam, sedangkan warna menjadi lebih merah
menendakan media menjadi basa. Warna media mula-mula adalah merah-
orange. Selain itu ditambahkan FeSO
4
untuk mendeteksi adanya gas H
2
S.


106
Cara kerja :
Inokulasikan biakan pada media TSIA
dengan cara inokulasi tusuk kemudian
dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak
pada agar miring (lihat gambar).
Inkubasi pada 37
o
C selama 24-48 jam.
Interpretasikan hasil dengan melihat
keterangan dibawah ini.

= slant dan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan
warna&tidak terjadi fermentasi karbohidrat, sedangkan
pepton yang ada digunakan untuk sumber energi dalam
keadaan aerob atau anaerob sehingga meningkatkan pH
karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping
metabolisme protein. Jika kemerahan lebih pekat pada slant
maka terjadi degradasi aerobik peptone, sedangkan warna
merah pekat tampak di semua media maka interpretasinya
adalah degradasi peptone secara aerob maupun anaerob.
= slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa
produksi gas &hanya terjadi fermentasi glukosa, sedangkan fermentasi
laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Sel lebih memilih untuk mendegradasi
glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat
langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). Media mengandung
glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa)
sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara cepat menjadi
basa, karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam
waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk
memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.

= slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas telah terjadi
fermentasi glukosa, laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa
memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk
substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang
ditandai warna kuning setelah 24 jam.



107

= butt berwarna kehitaman&adanya H
2
S yang bereaksi dengan senyawa
besi FeSO
4
pada media menghasilkan FeS yang berwarna kehitam-
hitaman. H
2
S ini merupakan hasil dari metabolisme protein




media pecah atau terangkat&timbul gas sebagai hasil samping fermentasi



















108






Air adalah materi esensial di dalam kehidupan. Tidak satu pun mahluk
hidup di dunia ini yang tidak memerlukan dan tidak mengandung air. Sel
hidup, baik tumbuhan maupun hewan, sebagian besar tersusun oleh air,
seperti di dalam sel tumbuhan terkandung lebih dari 75% atau di dalam sel
hewan terkandung lebih dari 67%. Dari sejumlah 40 juta mil-kubik air yang
berada di permukaan dan di dalam tanah, ternyata tidak lebih dari 0,5% (0,2
juta mil-kubik) yang secara langsung dapat digunakan untuk kepentingan
manusia. Karena 97% dari sumber air tersebut terdiri dari air laut, 2,5%
berbentuk salju abadi yang baru dalam kedaan mencair dapat digunakan.
Pengadaan air bersih untuk kepentingan rumah tangga seperti untuk
air minum, air mandi, dan sebagainya harus memenuhi persyaratan yang
sudah ditentukan peraturan internasional (WHO dan APHA) ataupun
peraturan nasional dan setempat. Dalam hal ini kualitas air bersih di Indonesia
harus memenuhi persyaratan yang tertuang di dalam Peraturan Menteri
Kesehatan RI No.173/Men.Kes/Per/VIII/77 dimana setiap komponen yang
diperkenankan berada di dalamnya harus sesuai. Kualitas air tersebut
menyangkut :
a) Kualitas fisik yang meliputi kekeruhan, temperatur, warna, bau dan rasa.
Kekeruhan air dapat ditimbulkan oleh adanya bahan-bahan organik dan
anorganik yang terkandung di dalam air seperti lumpur dan bahan-bahan yang
berasal dari buangan. Dari segi estetika, kekeruhan di dalam air dihubungkan
dengan kemungkinan pencemaran oleh air buangan.
b) Kualitas kimia yang berhubungan dengan ion-ion senyawa atau pun logam
yang membahayakan, di samping residu dari senyawa lainnya yang bersifat
Bab 9


109
racun, seperti antara lain residu pestisida. Dengan adanya senyawa-senyawa
ini kemungkinan besar bau, rasa dan warna air akan berubah, seperti yang
umum disebabkan oleh adanya perubahan pH air. Pada saat ini kelompok
logam berat seperti Hg, Ag, Pb, Cu, Zn, tidak diharapkan kehadirannya di
dalam air.
c) Kualitas biologis, berhubungan dengan kehadiran mikroba patogen
(penyebab penyakit, terutama penyakit perut), pencemar (terutama bakteri
coli) dan penghasil toksin.
Air tawar bersih yang layak minum, kian langka di perkotaan. Sungai-
sungai yang menjadi sumbernya sudah tercemar berbagai macam limbah,
mulai dari buangan sampah organik, rumah tangga hingga limbah beracun dari
industri. Air tanah sudah tidak aman dijadikan bahan air minum karena telah
terkontaminasi rembesan dari tangki septic maupun air permukaan. Banyak
jenis bakteri atau fungi di dalam badan air berlaku sebagai jasad
dekomposer, artinya jasad tersebut mempunyai kemampuan untuk
mengurai atau merombak senyawa yang berada dalam badan air. Sehingga
kehadirannya dimanfaatkan dalam pengolahan buangan di dalam air secara
biologis. Kehadiran senyawa hasil rombakan bakteri atau fungi dimanfaatkan
oleh jasad pemakai/ konsumen. Tanpa adanya jasad pemakai kemungkinan
besar akumulasi hasil uraian tersebut dapat mengakibatkan keracunan
terhadap jasad lain, khususnya ikan.
Pada umumnya mikroalgae mempunyai klorofil, sehingga dapat
melakukan fotosintesis dengan menghasilkan oksigen. Di dalam air, kegiatan
fotosintesis akan menambah jumlah oksigen, sehingga nilai kelarutan oksigen
akan naik/ ber-tambah, ini yang diperlukan oleh kehidupan di dalam air. Yang
paling dikuatirkan, bila di dalam badan air terdapat mikroba penyebab
penyakit, seperti : Salmonella penyebab penyakit tifus/ paratifus, Shigella
penyebab penyakit disentri basiler, Vibrio penyebab penyakit kolera,
Entamoeba penyebab disentri amuba. Di dalam air juga ditemukan mikroba
penghasil toksin seperti : Clostridium yang hidup anaerobik, yang hidup


110
aerobik misalnya : Pseudomonas, Salmonella, Staphyloccus, serta beberapa
jenis mikroalgae seperti Anabaena dan Microcystis.
Sering juga didapatkan warna air cepat berubah bila disimpan, padahal
air tersebut berasal dari air pompa, misal di daerah permukiman baru yang
tadinya persawahan. Ini disebabkan oleh adanya bakteri besi misal Crenothrix
yang mempunyai kemampuan untuk mengoksidasi senyawa ferro menjadi
ferri. Di permukiman baru yang asalnya persawahan, kalau air pompa
disimpan menjadi berbau (bau busuk). Ini disebabkan oleh adanya bakteri
belerang misal Thiobacillus yang mempunyai kemampuan mereduksi senyawa
sulfat menjadi H
2
S.
Badan dan warna air dapat berubah menjadi berwarna hijau, biru-hijau
atau warna-warna lain yang sesuai dengan warna yang dimiliki oleh
mikroalgae. Bahkan suatu proses yang sering terjadi pada danau atau kolam
yang besar yang seluruh permukaan airnya ditumbuhi oleh algae yang sangat
banyak dinamakan blooming. Biasanya jenis mikroalgae yang berperan di
dalamnya adalah Anabaena flosaquae dan Microcystis aerugynosa. Ada
pernyataan bahwa air jernih belum tentu bersih. Ini dihubungkan dengan
keadaan bahwa air, sejak keluar dari mata air, sumur, ternyata sudah
mengandung mikroba, khususnya bakteri atau mikroalgae. Pada air yang kotor
atau sudah tercemar, misal air sungai, air kolam, air danau dan sumber-
sumber lainnya, disamping akan didapati mikroba seperti pada air jernih, juga
kelompok mikroba lainnya yang tergolong penyebab penyakit, penghasil
toksin, penyebab blooming, penyebab korosi, penyebab deteriorasi, penyebab
pencemaran ini adalah bakteri coli.
Dalam bidang mikrobiologi pangan dikenal istilah bakteri indikator
sanitasi. Dalam hal ini, pengertian pangan adalahpangan seperti yang
tercantum pada Undang-Undang Pangan Nomor 7 tahun 1996 yang mencakup
makanan dan minuman (termasuk air minum). Bakteri indikator sanitasi
adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan menunjukkan bahwa air
atau makanan tersebut pernah tercemar oleh feses manusia. Bakteri-bakteri
indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang lazim terdapat dan hidup


111
pada usus manusia. Jadi, adanya bakteri tersebut pada air atau makanan
menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau
makanan pernah mengalami kontak dengan feses yang berasal dari usus
manusia dan oleh karenanya mungkin mengandung bakteri patogen lain yang
berbahaya.
Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai
indicator adanya polusi kotoran dan kondisi yang tidak baik terhadap air,
makanan, susu dan produk-produk susu. Koliform sebagai suatu kelompok
dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk
spora, aerobik dan anaerobic fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan
menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35
o
C. Adanya
bakteri koliform di dalam makanan/ minuman menunjukkan kemungkinan
adanya mikroba yang bersifat entero patogenik dan atau toksigenik yang
berbahaya bagi kesehatan.
Bakteri koliform dapat dibedakan menjadi 2 grup yaitu :
(1) koliform fekal, misalnya Escherichia coli
(2) koliform non fekal, misalnya Enterobacter aerogenes.
Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan
atau manusia, sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada
hewan atau tanam-tanaman yang telah mati. Jadi, adanya Escherichia coli
dalam air minum menunjukkan bahwa air minum itu pernah terkontaminasi
feses manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karena itu,
standar air minum mensyaratkan Escherichia coli harus nol dalam 100 ml.
Untuk mengetahui jumlah koliform di dalam contoh digunakan metode Most
Probable Number ( MPN ). Pemeriksaan kehadiran bakteri coli dari air
dilakukan berdasarkan penggunaan medium kaldu laktosa yang ditempatkan
di dalam tabung reaksi berisi tabung durham (tabung kecil yang letaknya
terbalik, digunakan untuk menangkap gas yang terjadi akibat fermentasi
laktosa menjadi asam dan gas). Tergantung kepada kepentingan, ada yang
menggunakan sistem 3-3-3 (3 tabung untuk10 ml, 3 tabung untuk 1,0 ml, 3
tabung untuk 0,1 ml) atau 5-5-5. Kehadiran bakteri coli besar pengaruhnya


112
terhadap kehidupan manusia, terbukti dengan kualitas air minum, secara
bakteriologis tingkatannya ditentukan oleh kehadiran bakteri tersebut (tabel
1).









Uji Kualitatif Koliform
Uji kualitatif koliform secara lengkap terdiri dari 3 tahap yaitu (1) Uji
penduga (presumptive test), (2) Uji penguat (confirmed test) dan Uji pelengkap
(completed test). Uji penduga juga merupakan uji kuantitatif koliform
menggunakan metode MPN.
1. Uji penduga (presumptive test)
Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri
koliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena
fermentasi laktosa oleh bakteri golongan koli. Terbentuknya asam dilihat
dari kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat
dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Tabung dinyatakan positif
jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung
Durham. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat
dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk
asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan
untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair.
Bila inkubasi 1 x 24 jam hasilnya negatif, maka dilanjutkan dengan inkubasi
2 x 24 jam pada suhu 35
0
C. Jika dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas


113
dalam tabung Durham, dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung yang
positif dihitung pada masing-masing seri. MPN penduga dapat dihitung
dengan melihat tabel MPN.
2. Uji penguat (confirmed test)
Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan. Dari tabung yang positif
terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 1x 24 jam, suspensi
ditanamkan pada media Eosin Methylen Biru Agar ( EMBA ) secara aseptik
dengan menggunakan jarum inokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli
tumbuh berwarna merah kehijauan dengan kilat metalik atau koloni
berwarna merah muda dengan lendir untuk kelompok koliform lainnya.
3. Uji pelengkap (completed test)
Pengujian selanjutnya dilanjutkan dengan uji kelengkapan untuk
menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji
ketetapan diinokulasikan ke dalam medium kaldu laktosa dan medium agar
miring Nutrient Agar ( NA ), dengan jarum inokulasi secara aseptik.
Diinkubasi pada suhu 37
0
C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positif terbentuk
asam dan gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung bakteri
Escherichia coli.
Dari media agar miring NA dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri
Escherichia coli menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek.
Untuk membedakan bakteri golongan koli dari bakteri golongan colifekal
(berasal dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana
satu seri diinkubasi pada suhu 37
0
C (untuk golongan koli ) dan satu seri
diinkubasi pada suhu 42
0
C (untuk golongan koli fekal). Bakteri golongan koli
tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 42
0
C, sedangkan golongan koli
fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 42
0
C.
Standar Nasional Indonesia (SNI) mensyaratkan tidak adanya coliform
dalam100 ml air minum. Akan tetapi United States Enviromental Protection
Agency (USEPA) lebih longgar persyaratan uji coliformnya mengingat
coliform belum tentu menunjukkan adanya kontaminasi feses manusia,


114
apalagi adanya patogen. USEPA mensyaratkan presence/absence test untuk
coliform pada air minum, dimana dari 40 sampel air minum yang diambil
paling banyak 5% boleh mengandung coliform.
Apabila sampel yang diambil lebih kecil dari 40, maka hanya satu sampel
yang boleh positif mengandung coliform. Meskipun demikian, USEPA
mensyaratkan pengujian indikator sanitasi lain seperti protozoa Giardia
lamblia dan bakteri Legionella. Pada air bukan untuk minum umumnya
terdapat perbedaan persyaratan coliform dan Escherichia coli. Air untuk
kolam renang (primary contact water) misalnya mensyaratkan kandungan
coliform <2,4 x103, tetapi syarat Escherichia coli tentunya lebih ketat, yaitu
< 1 x 103 dalam 100 ml.
4. Uji identifikasi
Dengan melakukan reaksi IMVIC (Indole, Methyl red, Voges-Proskauer tes,
penggunaan Citrat).
































115








Menurut UU RI No.7 tahun 1996, yang dimaksud pangan adalah segala sesuatu yang
berasal dari sumber hayati dan air, baik yang diolah maupun tidak diolah, yang
diperuntukkan sebagai makananatau minuman bagi konsumsi manusia termasuk bahan
tambahan pangan, bahan baku pangan, dan bahan lain yang digunakan dalam proses
penyiapan, pengolahan dan atau pembuatan makanan atau minuman. Mengingat definisi
pangan mempunyai cakupan yang luas, maka upaya untuk mencegah pangan dari
kemungkinan tercemar baik dari cemaran biologis, kimia, dan benda lain yang yang
dapatmengganggu, merugikan dan membahayakan kesehatan manusia (UU RI tahun 1996),
merupakan suatu keharusan.

PENYAKIT AKIBAT PANGAN
Selain harus bergizi dan menarik, pangan juga harus bebas dari bahan-bahan
berbahaya yang dapat berupa cemaran kimia, mikroba dan bahan lainnya. Mikroba dapat
mencemari pangan melalui air, debu, udara, tanah, alat-alat pengolah (selama proses
produksi atau penyiapan) juga sekresi dari usus manusia atau hewan. Penyakit akibat
pangan (food borne diseases) yang terjadi segera setelah mengkonsumsi pangan, umumnya
disebut dengan keracunan.
Pangan dapat menjadi beracun karena telah terkontaminasi oleh bakteri patogen
yang kemudian dapat tumbuh dan berkembang biak selama penyimpanan, sehingga mampu
memproduksi toksin yang dapat membahayakan manusia. Selain itu, ada juga makanan
yang secara alami sudah bersifat racun seperti beberapa jamur/ tumbuhan dan hewan.
Umumnya bakteri yang terkait dengan keracunan makanan diantaranya adalah Salmonella,
Shigella, Campylobacter, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolityca, Staphylococcus
aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Vibriocholerae.
Vibrio parahaemolyticus, E.coli enteropatogenik dan Enterobacter sakazaki.
Bab 10


116
Keracunan pangan oleh bakteri dapat berupa intoksifikasi atauinfeksi. Intoksifikasi
disebabkan oleh adanya toksin bakteri yang terbentuk didalam makanan pada saat bakteri
bermultiplikasi, sedangkan keracunan pangan berupa infeksi, disebabkan oleh masuknya
bakteri ke dalam tubuh melalui makanan yang terkontaminasi dan tubuh memberikan
reaksi terhadap bakteri tersebut.
Ada dua jenis intoksifikasi makanan yang disebabkan oleh bakteri yaitu botulism,
karena adanya toksin dalam makanan yang dihasilkan oleh Clostridium botulinum dan
intoksifikasi lain yaitu stafilokokkal, yang disebabkan oleh enterotoksin dari Staphylococcus
aureus. Sedangkan keracunan pangan oleh bakteri yang merupakan infeksi, dikelompokkan
menjadi dua. Kelompok pertama berasal dari makanan yang berfungsi sebagai pembawa
bakteri, misalnya disentri demam tifoid, kolera, brusellosis dan lain-lain. Kelompok kedua
berasal dari makanan yang berfungsi sebagai media pertumbuhan bakteri, sehingga bakteri
dapat berkembang biak, diantaranya bakteri Salmonella, Clostridium perfringens, Bacillus
cereus, dan Escherichia coli entero patogenik.
Untuk mengetahui bahwa pangan sudah tercemar, dapat dilihat secara fisik dari
tekstur makanan tersebut. Namun banyak makanan terutama yang sudah melewati suatu
proses pengolahan, tetap mempunya itekstur yang masih baik tetapi mengandung suatu
cemaran seperti bakteri patogen, yang disebabkan oleh penanganan yang tidak memadai.

MIKROBA PENYEBAB KERUSAKAN & KERACUNAN MAKANAN
Jenis mikroba yang terdapat dalam makanan meliputi bakteri, kapang/ jamur dan
ragi serta virus yang dapat menyebabkan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan
seperti penampilan, tekstur, rasa dan bau dari makanan. Pengelompokan mikroba dapat
berdasarkan atas aktifitas mikroba (proteolitik, lipofilik, dsb) ataupun atas pertumbuhannya
(psikrofilik, mesofilik, halofilik, dsb). Banyak faktor yang mempengaruhi jumlah serta jenis
mikroba yang terdapat dalam makanan, diantaranya adalah sifat makanan itu sendiri (pH,
kelembaban, nilai gizi), keadaan lingkungan dari mana makanan tersebut diperoleh, serta
kondisi pengolahan atau pun penyimpanan.
Jumlah mikroba yang terlalu tinggi dapat mengubah karakter organoleptik,
mengakibatkan perubahan nutrisi / nilai gizi atau bahkan merusak makanan tersebut.
Bahkan bila terdapat mikroba patogen, besar kemungkinan akan berbahaya bagi yang
mengkonsumsinya. Dalam pengujian cemaran mikroba digunakan mikroba indikator, karena
selain mudah dideteksi juga dapat memberikan gambaran tentang kondisi higienis dari


117
produk yang diuji. Bersamaan dengan mikroba indikator dilakukan juga pengujian terhadap
bakteri patogen.
Mikroba indikator
Mikroba indikator adalah golongan atau spesies bakteri yang kehadirannya dalam
makanan dalam jumlah di atas batas (limit) tertentu, merupakan pertanda bahwa makanan
telah terpapar dengan kondisi-kondisi yang memungkinkan berkembang biaknya mikroba
patogen. Mikroba indikator digunakan untuk menilai keamanan dan mutu mikrobiologi
makanan.
Jumlah bakteri aerob mesofil, bakteri anaerob mesofil dan bakteri psikrofil dapat
merupakan indikator bagi status/mutu mikrobiologi makanan. Jumlah yang tinggi dari
bakteri-bakteri tersebut seringkali sebagai petunjuk bahan baku yang tercemar, sanitasi
yang tidak memadai, kondisi (waktu dan atau suhu) yang tidak terkontrol selama proses
produksi atau selama penyimpanan ataupun kombinasi dari berbagai kondisi
tersebut.Bakteri aerob mesofil dianggap sebagai mikroba indikator, meskipun sebenarnya
kurang akurat dibandingkan dengan indikator lainnya. Bakteri anaerob mesofil merupakan
indikator dari kondisi yang dapat menyebabkan adanya pertumbuhan mikroba anaerob
penyebab keracunan makanan seperti C. perfringens dan C.botulinum.
Golongan bakteri coliform, Coliform fekal, Escherichia coli dan Enterobacter
sakazakii merupakan bakteri bentuk batang, bersifat aerob dan anaerob fakultatif.
Golongan coliform mempunyai spesies dengan habitat dalam saluran pencernaan dan non
saluran pencernaan seperti tanah dan air. Yang termasuk golongan coliform adalah
Escherichia coli, dan spesies dari Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella dan Serratia. Bakteri
selain dari E.coli dapat hidup dalam tanah atau air lebih lama dari pada E.coli, karena itu
adanya bakteri coliform dalam makanan tidak selalu menunjukkan telah terjadi kontaminasi
yang berasal dari feses. Keberadaannya lebih merupakan indikasi dari kondisi prosessing
atau sanitasi yang tidak memadai dan keberadannya dalam jumlah tinggi dalam makanan
olahan menunjukkan adanya kemungkinan pertumbuhan dari Salmonella, Shigella dan
Staphylococcus.
Escherichia coli dan Coliform fekal, biasanya E.coli, merupakan indikator dari
kontaminan dengan sumber/ bahan fekal. Habitat alami dari E . coli adalah saluran
pencernaan bawah hewan dan manusia. Sedangkan Coliform fekal merupakan metode
pemeriksaan untuk menunjukkan adanya E.coli atau spesies yangs angat dekat dengan
E.coli secara cepat tanpa harus mengisolasi biakan dan melakukan test IMVIC. Sebagian


118
besar terdiri dari E.coli tipe I dantipe II yang merupakan petunjuk penting dari kontaminan
asal dari bahan fekal.
E.coli dan coliform, yang termasuk golongan Enterobacteriaceae adalah Salmonella,
Shigella dan Enterobacter sakazaki selain golongan Enterococci yaitu Streptococcus
faecalis dan S.faecium merupakan flora normal dari saluran pencernaan manusia dan
hewan. Golongan ini tidak banyak digunakan sebagai indikator kontaminasi fekal tetapi
lebih dikaitkan dengan sanitasi produksi yang buruk oleh karena daya tahan yang tinggi dari
mikroba terhadap kekeringan, suhu tinggi dan pendinginan serta pengaruh detergen atau
disinfektan.
Dengan sifat yang tahan terhadap pendinginan maka bakteri ini dapat digunakan
sebagai indikator untuk makanan beku dan makanan yang sudah dipanaskan. Staphylococci
terutama Staphylococcus aureus keberadaannya dalam makanan bisa bersumber dari kulit,
mulut atau rongga hidung pengolah pangan. Bila ditemukan dalam jumlah tinggi merupakan
indikator dari kondisi sanitasi yang tidak memadai.
Mikroba patogen
Meliputi bakteri, jamur/ kapangdan ragi/ yeast, bakteri pathogen termasuk jenis
penyebab toksiinfeksi makanan diantaranya Salmonella, Shigella, Brucella. Umumnya ada
beberapa jenis golongan bakteri terpenting yang dapat menyebabkan kerusakan makanan
dan keracunan yaitu Acetobacter, Achromobacter, Alcaligenes, Bacillus, Bacteroides,
Clostridium, Corynebacterium, Enterococci, Enterobacter, Erwinia, Escherichia,
Flavobacterium, Kurthia, Lactobacillus, Leuconostoc, Micrococcus, Paracolobactrum,
Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina, Serratia, Shigella, Staphylococcus dan
Streptomyces.
METODOLOGI
Dalam rangka pengawasan mutu secara mikrobiologis, dilakukan pengujian
laboratorium untuk mengisolasi dan mengidentifikasi cemaran bakteri patogen yang
mungkin ada dan untuk beberapa jenis mikroba dapat pula dilakukan penghitungan jumlah
koloni yang disebut juga dengan enumerasi.
Sampel
Jumlah sampel yang diuji harus cukup representatif, mewakili lot yang akan
diperiksa. Kadang-kadang pengambilan sampel untuk pengujian bakteri pathogen harus
lebih ketat dimana menurut ICMSF (The International Commission on Microbiological


119
Specification for Foods) dan Harrigan, replikasi uji (n) dilakukan sesuai dengan jumlah yang
representatif, tergantung pada jenis mikroba dan produk.
Sampel makanan yang diterimaharus segera diuji begitu tiba di laboratorium.
Sampel yang didinginkan dan mudah rusak harus dianalisa paling lambat 36 jam sesudah
pengambilan sampel. Sampel beku harus disimpan dalam freezer sampai tiba waktunya
untuk diuji, tetapi bila sampel diterima dalam keadaan dingin, jangan disimpan di dalam
freezer. Beberapa bakteri seperti vibrio banyak yang akan mati pada suhu sangat rendah
(pembekuan). Untuk sampel yang tidak mudah rusak seperti makanan kaleng, dapat
disimpan pada suhu ruang. Namun demikian, sampel tidak boleh disimpan terlalu lama
karena ada mikroba yang dapat mati selama penyimpanan.
Sampel yang akan dikirim ke laboratorium harus diupayakan tidak tercemar dengan
bahan atau mikroba lain terhadap sampel. Selama dalam pengiriman ke laboratorium maka
sifat sampel harus dijamin tidak mengalami perubahan sejak sampel diambil, dikemas dan
dikirim ke laboratorium. Bila sampel berada dalam keadaan beku, harus terlebih dahulu
dilelehkan dan pelelehan sedapat mungkin dilemari pendingin atau pada suhu kurang dari
45
0
C selama paling lama 15 menit. Bila menggunakan suhu tinggi sebaiknya sampel diaduk
secara teratur. Untuk sampel beku yang mudah meleleh seperti es krim, maka dapat diuji
tanpa dilelehkan terlebih dahulu. Untuk sampel padat seperti daging mentah, harus terlebih
dahulu dicincang sebelum dihomogenkan.
Bila hanya ada satu sampel ditujukan untuk berbagai pengujian, maka sampel untuk
uji mikrobiologi dicuplik terlebih dahulu sebelum pengujian lainnya dilakukan. Khusus untuk
pengujian C.botulinum dilarang untuk mencicipi ketika akan membuat pemerian sampel,
maka pada catatan data sampel tidak dicantumkan pemerian dari rasa.
Metode
Pengujian sampel makanan akan selalu mengacu kepada persyaratan makanan yang
sudah ditetapkan. Parameter uji mikrobiologi pada makanan yang dipersyaratkan secara
umum terdiri dari :


120
a. Uji Angka Lempeng Total
b. Uji Angka Kapang khamir
c. Uji Angka Bakteri termofilik
d. Uji Angka Bakteri pembentuk spora
e. Uji Angka bakteri an-aerob
f. Uji Angka Staphylococcus aureus
g. Uji Angka Clostridium perfringens
h. Uji Angka Enterococcus
i. Uji Angka Bacillus cereus
j. Uji Angka Enterobacteriaceae
k. Uji MPN Coliform
l. Uji MPN Fekal Coliform
m. Uji MPN Escherichia coli
n. Uji Angka Escherichia coli
o. Identifikasi Escherichia coli
p. Identifikasi Staphylococcus aureus
q. Identifikasi Salmonella
r. Identifikasi Shigella
s. Identifikasi Bacillus cereus
t. Identifikasi Streptococcus faecalis
u. Identifikasi Vibrio cholerae
v. Identifikasi Vibrio parahaemolyticus
w. Identifikasi Clostridium perfringens
x. Identifikasi Listeria monocytogenes
y. Identifikasi Campylobacter jejuni
Ada beberapa parameter yang tidak termasuk dalam persyaratan di atas, seperti
identifikasi Pseudomonas aeruginosa dalam air minum tetapi sering juga menjadi syarat
tambahan yang diinginkan oleh produsen air minum untuk diuji. Begitu pula pengujian
khusus Clostridium botulinum untuk makanan kaleng. Pengujian mikrobiologi untuk
makanan tidak dilakukan untuk semua parameteruji di atas tetapi akan mengacu pada
persyaratan dari tiap produk tersebut misalnya persyaratan Naget ayam ( SNI 01-6683-
2002)meliputi :
1. Angka Lempeng Total
2. MPN Coliform
3. MPN E.coli
4. Identifikasi Salmonella
5. Angka Staphylococcus aureus
Metode yang digunakan untuk pengujian mikrobiologi sangat ditentukan oleh
persyaratan yang diacu, umumnya pengujian dilakukan secara kualitatif dengan metode
pengkayaan (enrichment) yaitu isolasi dan identifikasi mikroba dan interpretasi hasil (negatif
pergram/ml atau negatif per 25 gram atau per 100 gram/ml). Pengujian secara kuantitatif
(enumerasi) dengan penghitungan jumlah mikroba dan interpretasi hasil berupa koloni per
ml/g atau koloni per 100 ml. Identifikasi mikroba pathogen dapat dilakukan dengan cara
konvensional maupun denganpengujian cepat (rapid test).
Metode kuantitatif (Enumerasi)
Metode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada
suatu sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT) atau total plate count
(TPC) dan Angka Paling Mungkin atau Most Probable Number (MPN). Uji Angka Lempeng
Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media
padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual dan dihitung,


121
interpretasi hasil berupa angka dalam koloni (cfu)per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang
digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar. Angka Paling Mungkin
(MPN) menggunakan media cair dengan tiga replikasi dan hasil akhir berupa kekeruhan atau
perubahan warna dan atau pembentukan gas yang juga dapat diamati secara visual, dan
interpretasi hasil dengan merujuk kepada Tabel MPN. Dikenal 2 cara yaitu metode 3 tabung
dan metode 5 tabung.
Metode kuantitatif dilakukandengan beberapa tahap yaitu :
- Homogenisasi sampel
sebagai tahap pendahuluan dalam pengujian yang berguna untuk membebaskan sel
bakteri yang mungkin terlindung partikel sampel dan untuk memperoleh distribusi bakteri
sebaik mungkin. Homogenisasi dapat dilakukan menggunakan alat seperti stainless steel
blender atau stomaker. Sedang sampel bentuk cair tidak perlumenggunakan alat, cukup
langsung dicampur dengan pengencer dan dikocok sampai homogen.
- Tahap pengenceran
menggunakan larutan pengencer yang berfungsi untuk menggiatkan kembali sel-sel
bakteri yang mungkin kehilangan vitalitasnya karena kondisi di dalam sampel yang kurang
menguntungkan. Pengenceraan suspensi sampel dilakukan untuk mendapatkan koloni yang
tumbuh secara terpisah dan dapat dihitung dengan mudah, hal ini akan sangat membantu
terutama untuk sampel dengan cemaran yang sangat tinggi. Umumnya pengencer yang
digunakan adalah peptone water 0,1%, buffer fosfat atau larutan ringers (4 kali kuat), dan
peptone 0,1% plus NaCL0,85% (ISO 6887:1983)
- Tahap pencampuran dengan media (padat/ cair)
Media padat yang digunaka numumnya adalah Plate Count Agar (PCA) atau Nutrient
Agar (NA) sedangkan untuk inokulasi suspensi homogenat sampel ke dalam media,
tergantung dengan metode yang telah dipilih dan kesesuaian dengan sifat sampel dan
mikroba yang mungkin ada dalam sampel. Pada keadaan tertentu, media perlu ditambah
dengan bahan lain seperti glukosa untuk Enterococcus, atau serum untuk Mycoplasma dan
egg yolk untuk bakteri tertentu misalnya yang tidak tahan panas terutama untuk
pencampuran dengan media dengan suhu kira-kira 45
0
C, dilakukan dengan metode sebar
atau tetes dan suhu inkubasi rendah (misal. bakteri Psychrotroph dan Psychrophiles)
- Tahap inkubasi danpengamatan
Inkubasi dilakukan pada suhu dan lama yang sesuai dan kondisi dibuat sedemikian
rupa disesuaikan dengan sifat mikroba (kondisi aerob atau anaerob) :
0 -10
0
C untuk bakteri Psikrotrof dan Psikrofil


122
20-32
0
C untuk bakteri Saprophtic mesophiles
35-37
0
C (atau 45
0
C) untuk bakteri parasites mesofil
55-63
0
C atau lebih tinggi untuk bakteri Termofilik
30-32
0
C (ISO 4833:1991)
- Interpretasi hasil
Metode Kualitatif (Pengkayaan)
Pada metode kualitatif dilakukan perbanyakan (enrichment/ pengkayaan) terlebih
dahulu dari sel mikroba yang umumnya dalam jumlah yang sangat sedikit dan bahkan
kadang-kadang dalam kondisi lemah. Ada beberapa tahap yang dilakukan yaitu tahap
pengkayaan (enrichment), tahap isolasi pada media selektif, tahap identifikasi dengan reaksi
biokimia, dan dilanjutkan dengan analisa antigenik atau serologi atau immunologi dan bila
diperlukan dapat juga dilakukan identifikasi DNA bakteri dengan metode PCR (Polymerase
Chain Reaction)
Tahap pengkayaan
Umumnya digunakan media cair yang berguna untuk memberi kesempatan supaya
bakteri dapat tumbuh pada media pengkaya, karena bakteri lain juga dapat tumbuh, maka
dapat ditambahkan inhibitor untuk mencegah atau menghambat pertumbuhan bakteri lain
dan dilanjutkan dengan menumbuhkan kembali bakteri dalam media selektif atau
differensial.
Pada keadaan tertentu dimana bakteri sangat lemah perlu dilakukan terlebih dahulu
tahap pra-pengkayaan (pre-enrichment) misalnya pada uji Salmonella ataupun Enterobacter
sakazaki, dimana media ini mengandung cukup gizi yang non selektif. Tahap ini
dimaksudkan untuk menyembuhkan/ menguatkan sel bakteri yang sangat lemah atau
sakit disebabkan oleh proses pengolahan makanan. Umumnya pada tahap pra-pengkayaan
digunakan media Lactose Broth atau Buffered Pepton Water, walaupun kadang-kadang
media ini belum tentu sesuai untuk semua jenis sampel.
Pada makanan kering seperti yeast dan susu bubuk, sampel hanya memerlukan
rekonstitusi dalam air suling yang mengandung Brilliant Green. Sedangkan untuk sampel
yang sangat berlemak seperti hasil olahan jeroan maka ke dalam media pra-pengkaya
ditambahkan Tergitol 7 sehingga memudahkan dispersi lemak pada media.
Tahap isolasi
Setiap koloni atau galur mikroba yang akan diidentifikasi harus benar-benar murni
dan untuk mendapatkan biakan murni digunakan media selektif yang memungkinkan untuk


123
isolasi koloni mikroba tersangka berdasarkan pada karakter biokimia dari mikroba yang akan
mempengaruhi sifat pertumbuhan bakteri pada suatu media spesifik. Identitas mikroba
dapat dilihat dari pembentukan koloni yang spesifik pada media.
Saat ini, perkembangan metode pengujian cepat (rapid test) dengan menggunakan
media selektif sudah makin berkembang dimana pada media sudah ditambahkan suatu
indikator/ bahan kimia tertentu yang dapat menandai adanya hasil reaksi enzimatis
sehingga terbetuk warna atau fluoresensi sehingga media tersebut lebih spesifik lagi
(misalnya media kromokult dan fluorokult).
Contohnya media fluorogenik untuk deteksi E.coli dan kromogenik untuk deteksi
E.sakazakii yang sangat spesifik. Hal ini berdasarkan pada enzim yang berasal dari bakteri
tersebut misalnya E . coli(-D-galaktosidase) dengan penambahan fluorogenic substrat 4-
methylum bellliferylDglucoronide akan suatu ikatan kompleks yang akan menghasilkan
fluoresensi bila dilihat dibawah cahaya ultraviolet dan E.sakazakii (D-glukosidase)dengan
substrat 5-Bromo-4-choloro-3-indolylD-glucopyranoside) akan menghasilkan koloni
dengan warna hijau torquise. Beberapa media selektif yang digunakan untuk pengujian
mikroba dan koloni spesifik dapat dilihat pada table berikut
MIKROBA MEDIA SELEKTIF PENGAMATAN KOLONI
Escherichia coli
EMB agar

ENDO agar
Koloni warna kehijauan dengan bintik
hitam ditengah koloni dan kilap logam
Koloni warna merah dengan kilap logam
Salmonella sp.
XLD agar


BGA



Koloni translucent dengan bintik hitam
ditengahnya dan dikelilingi zona
transparan berwarna kemerahan
Koloni dari tidak berwarna, merah muda
hingga merah. Dari translucent hingga
keruh (opaque) dengan lingkaran merah
muda hingga merah
Shigella sp Mac Conkey agar
Koloni warnamerah muda terang,
translucent dengan atau tanpa pinggir
koloni bergerigi atau kasar
Campylobacter mCCDA Koloni basah, berwarna abu-abu
Staphylococcus
aureus
BP agar

MSA

Koloni warna hitam mengkilat, dikelilingi
daerah keruh (opaque)
Koloni cembung, warna kuning & warna
media berubah menjadi jernih
Bacillus cereus MYP agar
Koloni merah muda dikelilingi daerah
keruh
Clostridium
perfinges
TSC agar
Koloni berwarna hitam dengan daerah
keruh berukuran 2-4 mm di sekeliling
koloni
Vibrio cholerae TCBS agar
Koloni besar (2-3 mm), halus, kuning,
datar (agak pipih), bagian tengah keruh


124
dan disekelilingnya translucent
Vibrio
parahaemolyticus
TCBS agar + NaCl
3%
Koloni bulat berdiameter 2-3 mm dengan
pusat warna hijau atau biru
Listeria
monocytogenes
ALOA agar

PALCAM agar

Koloni biru hijau, dikelilingi halo
(lingkaran) keruh
Koloni berwarna abu-abu hijau dikelilingi
halo (lingkaran)
Enterococcus
faecalis
Enterococci agar Koloni kecil berwarna hijau kebiruan
Enterobacter
sakazakii
Chromocult
E.sakazaki
Koloni warna hijau atau biru-hijau

Pewarnaan Gram
Selain isolasi dan identifikasi dilakukan juga pewarnaan Gram langsung terhadap koloni, baik
Gram positif maupun Gram negatif.
Tahap konfirmasi
Dilakukan dengan berbagai metode diantaranya :
- Konfirmasi dengan reaksi biokimia menggunakan media tertentu, karena setiap bakteri
mempunyai karakter biokimia spesifik. Prinsip dasarnya adalah enzim yang diproduksi
mikroba akan mengdegradasi misalnya. karbohidrat, lipid, Kasein, dalam hal ini hasil
metabolit dapat dilihat secara visual dengan adanya tambahan suatu indicator. Saat ini uji
biokimia sudah banyak dibuat secara komersil dalam bentuk miniatur berupa kit dan hasil
uji dapat dilihat secara visual dan interpretasi secara manual atau dapat menggunakan
suatu program (komputer) dan alat yang sesuai seperti ELISA reader
- Konfirmasi analisa antigenik menggunakan antisera atau immunologi berdasarkan adanya
reaksi antigen dengan antibodi (misalnya. EnzymeLinked Immunosorbent Assay/ ELISA)
Karena antibody hanya bereaksi dengan antigen yang sesuai, maka sifat ini juga digunakan
untuk pengembangan teknik diagnostik. Hasil pengujian dapat diketahui/ dilihat secara
visual seperti adanya aglutinasi atau presipitasi atau terbentruknya warna yang dapat dilihat
secara visual atau menggunakan alat ELISA READER atau terbentuknya fluoresen yang dapat
dilihat menggunakan bantuan mikroskop fluoressein.
- Tahap selanjutnya merupakan identifikasi lebih sempurna yaitu dengan identifikasi
menggunakan analis dengan DNA probe ataupun metode PCR (Polymerase Chain Reaction).




125




Proses pengendalian jumlah mikroba artinya adalah berbagai metode fisik
dan kimia yang digunakan untuk menghancurkan atau mengurangi jumlah
mikroba pada suatu area tertentu. Mikroba mempunyai sensitivitas yang
berbeda-beda terhadap suatu dsinfektan, misalnya ada protozoa, virus dan
bakteri yang sangat resisten (tahan) terhadap zat-zat kimia tertentu. Berikut
ini adalah nama-nama mikroba yang resisten:
A. Resistensi tinggi, misalnya bakteri-bakteri endospora
B. resistensi sedang, misalnya, Pseudomonas sp., Mycobacterium
tuberculosis, Staphylococcus aureus, kista protozoa.
C. resistensi rendah, misalnya sel-sel vegetative, spora fungi, khamir,
protozoa trofozoit.
Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau
menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikroba dapat bersifat
membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme (microbiostatic). Disinfektan yaitu suatu senyawa kimia yang
dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda mati
seperti meja, lantai dan pisau bedah. Adapun antiseptik adalah senyawa kimia
yang digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan
tubuh, misalnya kulit. Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh
beberapa faktor yaitu:
Konsentrasi atau dosis zat anti mikroba
Cara kerja zat anti mikroba
Sifat alami mikroba di populasinya
Waktu terpapar
Bab 11


126
Jenis dan jumlah mikroba
Keberadaan pelarut, bahan organik atau inhibitor (zat penghambat)
Kondisi lingkungan: temperatur, pH dan jenis tempat hidup

Desinfeksi adalah suatu proses untuk menghancurkan pathogen
vegetative selain endospora, sanitasi artinya segala jenis teknik pembersihan
yang secara mekanik menghilangkan mikroba, sedangkan degermasi artinya
adalah proses untuk menurunkan jumlah mikroba.
Terkadang, istilah sanitasi, desinfeksi dn steriliasi dianggap mempunyai
arti yang sama, padahal sebenarnya masing-masing istilah tersebut
menunjukan tingkat aktivitasnya. Sanitizeradalah suatu zat kimia yang mampu
menurunkan jumlah mikroba hingga ke level aman, yaitu pengurangan
sebanyak 3-5 log (99,9 % hingga 99,999%) dari populasi bakteri penyebab
penyakit atau dari sejumlah sampel tertentu dalam waktu kurang dari 30
detik. Suatu desinfektan harus bisa membunuh bakteri pathogen setidaknya
99,999 % dalam waktu 5-10 menit, dan desinfektan ini harus mampu
membunuh lebih banyak bakteri pathogen dibandingkan dengan sanitizer.
Tapi desinfektan ini tidak direkomendasikan untuk digunakan pada kulit
manusia, tapi digunakan untuk permukaan benda atau untuk air. Bahan kimia
lain bernama sterilant digunakan untuk benar-benar memusnahkan mikroba,
termasuk spora yang biasanya resisten.
Glutaraldehid and formaldehid adalah contoh bahan kimia yang bisa
digunakan untuk mensterilisasi suatu benda atau ruangan. Aldehid tertentu
diketahui mempunyai sifat karsinogenik (bisa menyebabkan kanker) sehingga
penggunaannya dibatasi.
Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau
sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau
membunuh mikroorganisme lainnya. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas
antibiosis yang beragam.Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus
aktifnya, misal antibiotik macrolide, antimikroba peptida. Adapun


127
penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya atau pun
mikroorganisme produsernya.
Cara kerja bahan kimia anti mikroba
Mekanisme kerja antibiotik antara lain :
a. Menghambat dsintesis dinding sel
b. Merusak permeabilitas membran sel.
c. Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)
d. Menghambat sintesis protein (proses translasi).
e. Menghambat replikasi DNA.
Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode
Kirby-Bauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk
bakteri. Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh
diameter zona hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka
semakin terhambat pertumbuhannya, sehingga diperlukan standar acuan
untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu
antibiotik.
Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer :
a. Konsentrasi mikroba uji
b. Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram
c. Jenis antibiotik.
d. pH medium.
Kematian mikroba bisa terjadi akibat hilangnya kemampuan untuk
bereproduksi secara permanen bahkan jika berada di kondisi pertumbuhan
maksimum sekalipun. Bahan-bahan kimia anti mikroba bekerja dengan
berbagai mekanisme biokimia, seperti penghancuran membrane sel, dinding
sel, protein dalam sel, DNA atau RNA sel, penghambatan atau penonaktivan
proses-proses penting yang menunjang kehidupan mikroba tersebut.
Misalnya zat pengoksidasi seperti ozon atau klorin yang biasa digunakan
dalam pengolahan air, mematikan bakteri dengan cara menghancurkan
membrane sel bakteri tersebut. Klorin murni sudah digunakan dalam
pengolahan atau sterilisasi air sejak ratusan tahun lalu. Zat pengoksidasi ini


128
sangat efektif mematikan berbagai jenis bakteri, tapi kurang efektif untuk
menghancurkan spora. Klorin ini adalah jenis desinfektan yang murah,
kerjanya cepat dan efektif, tapi biasanya menghasilkan residu (zat sisa).

Bahan-bahan kimia yang biasa digunakan sebagai zat anti bakteri:
1. Halogen
a. Klorin (Cl
2
), hipoklorit (dalam kaporit/ zat pemutih), kloramin
Mendenaturasi protein dengan cara memutus ikatan disulfide dalam
sel dan bisa digunkan untuk membunuh spora.
b. Iodin (I
2
), iodofor (betadin)
Mendenaturasi protein, dapat membunuh spora, digunakan secara
medis sebagai desinfektan, obat, zat degermasi pada gigi dan sebagai
salep.
2. Fenol
Mengganggu membrane sel dan protein pengendap, berperan sebagai
bakterisidal (anti bakteri), fungisidal (anti jamur), virusidal (anti virus) tapi
tidak sebagai sporisidal. Contoh bahan: lisol dan triclosan (bahan
antibakteri dalam sabun)




3. Klorheksidin
Mendenaturasi molekul surfaktan & protein dengan spektrum anti mikroba
yang luas, bukan sporisidal, digunakan pada kulit seperti dalam scrub dan
pembersih kulit lainnya.







129










4. Alkohol
Etil, isopropyl dalam larutan 50-90%, bekerja dengan melarutkan
membrane lipid dan mengkoagulasi protein dari sel bakteri vegetatif dan
jamur, bukan merupakan sporisidal.
5. Hidrogen peroksida
Terdiri dari larutan lemah (3%) hingga kuat (25%), memproduksi radikal
bebas hidroksil yang sangat reaktif dan dapat merusak protein dan DNA
juga mendekomposisinya (menguraikannya) menjadi gas oksigen yang
bersifat racun bagi mikroba anaerob, larutan yang kuat dapat digunakan
untuk sporisidal.
6. Detergent & sabun
Ammonia kuartener yang digunakan sebagai surfaktan yang mengganggu
permeabilitas membrane pada bakteri dan fungi/ jamur tertentu, bukan
termasuk sporisidal, sabun secara mekanik akan menghilangkan debu dan
minyak yang mengandung mikroba dari permukaan kulit.
Struktur sabun:







130
7. Logam berat
Larutan perak dan raksa (merkuri) dalam konsentrasi kecil membunuh sel
vegetative dengan menonaktifkan protein., bekerja secara oligodinamik,
bukan termasuk sporisidal.
Logam-logam berat seperti Hg, Cu, Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel
meskipun hanya dalam kadar rendah. Logam mengalami ionisasi dan ion-
ion tersebut bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga
menyebabkan denaturasi. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan
konsentrasi yang rendah disebut daya oligodinamik.
8. Aldehid
Glutaraldehid dan formaldehid memusnahkan mikroba dengan merubah
protein dan DNA menjadi gugus alkil (alkilasi), larutan glutaraldehid 2%
(Cidex) digunakan sebagai sterilant untuk peralatan yang sensitif terhadap
panas. Formaldehid/ formalin digunakan sebagai desinfektan, pengawet
dan penggunaanya dibatasi karena beracun.
9. Gas dan aerosol
Etilen oksida, propilen oksida, betapropiolakton dan oksida klor digunakan
sebagai zat peng-alkilasi dan sporisidal yang kuat.
Contoh penggunaan:






131
Prosedur Kerja Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram
1. Inokulasikan E. coli dan Bacillus sp. pada NA cawan sengan streak
kontinyu.
2. Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan disinfektan berikut:
a. alkohol 70% (cawan 1)
b. LysoI 5% (cawan 2)
c. Betadin (cawan 3)
d. hipoklorit 5% (cawan 4)
3. Setelah diangkat, sisa tetes larutan yang berlebihan pada kertas cakram
diulaskan pada dinding wadah karena dikhawatirkan larutan akan meluas
di permukaan agar jika larutan terlalu banyak.
4. Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. Tekan dengan
pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar.
5. Inkubasi selama 48 jam pada 37
0
C.
6. Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya, bandingkan daya kerja
berbagai disinfektan.











Prosedur kerja pengujian daya oligodinamik:
1. Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. pada cawan NA dengan streak kontinyu
2. Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset
3. Inkubasi 370C selama 48 jam


132
4. Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah
yang jernih atau tidak ada pertumbuhan










Prosedur kerja pengujian antibiotic dengan metode Kirby-Bauer:
1. Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam
biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi
tabung agar airnyamenetes
2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan
Mueller-Hinton Agar secara merata
3. Biarkan cawan selama 5 menit
4. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan
antibiotik dengan konsentrasi tertentu.
5. Angkat, biarkan sejenak agar tiris,
selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar.
6. Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di
permukaan agar.
7. Inkubasi pada suhu 37
0
C selama 24-48 jam.
8. Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel
sensitivitas antibiotik.





133

Tabel sensitivitas antibiotik (diameter zona hambat dalam mm)
Nama
Antibiotik
Tahan Medium Peka
Tetrasiklin = 14 15-18 =19
ciprofloksacin =15 16-20 =21
enoxacin =14 15-17 =18
erythromycin =13 14-22 =23
Penicillin
staphylococci

-28


-29
Oxacilin
staphylococci

-10

11-12

-13
tocramycin =12 13-14 =15
ceftriaxone =13 14-20 =21
kanamycin =13 14-17 =18
clindamycin -14 15-20 -21
Fiperacillin
Gram negatif

-17

18-20

-21
Ampicillin
Gram negative
enteric
Staphylococci

=13
-28
14-16

=17
-29

Cara menginterpretasikan/ mengartikan hasil pengujian :
Ukur diameter zona hambat (zona jernih)
Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm
untuk Eryhtromycin.
Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap
antibiotik Eryhtromycin.








134





Masalah kesterilan merupakan bahasan yang sangat penting dalam menjaga
kondisi aseptis yang dicapai dalam suatu aktivitas dalam bidang mikrobiologi. Bakeri
dan fungi adalah kontaminan yang paling sering ditemukan. Spora fungi sangat
ringan dan banyak terdapat di lingkungan sehingga mudah mengkontaminasi
ruangan maupun biakan. Oleh karena itu perlu adanya upaya yang efektif dan
berkesinambungan untuk menjaga kesterilan alat, bahan, maupun ruangan kerja.
Suatu ruangan yang berukuran besar lebih efektif disterilkan dengan sinar
ultra violet. Waktu sterilisasinya bervariasi tergantung pada ukuran ruangan dan
hanya bisa dilakukan jika tidak ada aktivitas yang sedang dilakukan di dalam ruangan
tersebut karena radiasi ultra violet bisa berbahaya bagi mata. Ruangan tersebut bisa
juga disterilisasi dengan cara mencucinya sebanyak 1-2 kali sebulan menggunakan
spirosit antifungi. Ruangan yang kecil juga dapat disterilkan dengan sinar UV atau
menggunakan bakterisida dan atau fungisida. Sedangkan laminar air flow bisa
disterilkan dengan mengelap permukaannya menggunakan etil alcohol 95% 15
menit sebelum memulai bekerja di dalamnya.
Ruangan kultur sebelumnya harus dibersihkan dengan detergen kemudian
dengan hati-hati dilap dengan larutan sodium hipoklorit 2% atau etil alcohol 95%.
Semua lantai dan dinding harus dicuci secara rutin seminggu sekali dengan larutan
yang sejenis. Desinfektan komersial seperti Lysol, Zephiram dan Roccal dilarutkan
sebagaimana petunjuk pemakaiannya kemudian digunakan untuk mendesinfeksi
permukaan meja kerja atau ruangan kultur.
Keberhasilan monitoring kesterilan sangat tergantung pada teknik yang
dipakai oleh petugas dalam kultur aseptis. Kita harus selalu waspada terhadap
Bab 13


135
berbagai sumber yang bisa menyebabkan terjadinya kontaminasi seperti dari debu,
rambut, tangan dan pakaian. Sehingga tangan harus selalu dicuci, lengan baju sedikit
dilipat, rambut diikat, dll. Mencuci tangan dengan etil alcohol 95% adalah salah satu
cara pencegahan kontaminasi yang paling mudah dilakukan. Berbicara atau bersin
selama bekerja juga dapat menyebabkan kontaminasi. Menjaga kesterilan memang
sulit dilakukan karena bakteri dan spora fungi ada di udara, di permukaan tubuh dan
di dalam tubuh kita.
Jika anda melihat cahaya matahari yang masuk melalui jendela, anda dapat
melihat partikel-partikel debu yang melayang-layang di udara. Ternyata, ada
ratusan bakteri yang menempel pada masing-masing partikel debu tersebut. Suatu
unit laminar air flow didesain untuk menyingkirkan partikel debu tersebut dari
udara. Udara dari dalam ruangan disedot melalui bagian atas laminar air flow
kemudian didorong melewati filter HEPA (High Energy Particle Air) dengan
kecepatan 90 kaki/menit melewati wilayah kerja. Udara yang telah disaring dengan
HEPA itu tidak mengandung partikel yang ukurannya lebih besar dari 0,3
mikrometer, sehingga udaranya bisa dikatakan steril. Aliran udara didalamnya juga
mencegah masuknya spora fungi dan bakteri. semua alat yang akan masuk ke dalam
alat ini harus disterilisasi terlebih dahulu atau disemprot dengan etanol atau etil
alcohol.
Berikut ini adalah beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menjaga
kesterilan ruangan:
1. Ruangan harus di-pel secara rutin
2. Semua permukaan harus dicuci dengan 10% Clorox
R
, Lysol
R
, atau larutan
desinfektan yang lain
3. Semua pintu dan jendela harus ditutup
4. Air conditioner (AC) dan kipas harus dimatikan
5. Jika memungkinkan, masing-masing orang mempunyai wilayah kerja sendiri
sehingga bisa lebih terkontrol keterilannya
6. Masing-masing mempunyai botol semprot yang berisi etanol 70% atau
isopropanol (jangan gunakan metanol). Semprot semua alat yang akan masuk
ke wilayah steril


136
7. Rambut harus ditutup dan rambut yang panjang harus diikat. Tangan harus
dicuci, bukan digosok (menggosok tangan bisa menyebabkan kulit menjadi
kering dan bisa menyebabkan terbentuknya serpihan-serpihan kulit yang
mengandung bakteri) kemudian disemprot dengan alcohol atau usapkan gel
isopropyl alcohol. Lebih baik lagi jika memakai sarung tangan dan masker.
8. Jangan berbicara selama mengerjakan prosedur kerja steril. Jangan melewatkan
benda yang tidak steril ke wilayah kerja yang steril. Bergerak dengan hati-hati
dan tidak terburu-buru tapi lakukan dengan cepat dan cermat.
9. Periksa biakan yang dibuat setiap 3-5 hari. Jika terdapat daerah yang berlendir
berarti ada kontaminasi dari bakteri dan jika ada daerah yang keruh berarti ada
kontaminasi fungi. Jangan buka wadah yang sudah terkontaminasi, karena
kontaminannya mungkin mikroba pathogen atau yang dapat menyebabkan
penyakit. Satu-satunya cara aman untuk menanganinya adalah dengan
mengautoklafnya selama 15 menit. Wadah plastic yang terkontaminasi
detempatkan pada kantong khusus untuk mengautoklaf sebelum isinya
dibuang.

Prinsip yang utama ketika akan membuang limbah mikrobiologi adalah
dilakukannya dekontaminasi. Dekontaminasi ini termasuk sterilisasi (pemusnahan
total dari semua mikroorganisme, termasuk spora bakteri) dan desinfeksi
(penghancuran atau penghilangan mikroba jenis tertentu). Merupakan tanggung
jawab semua orang yang bekerja di laboratorium mikrobiologi untuk memastikan
penggunaan secara efektif semua produk untuk mendekontaminasi alat, bahan dan
sampel, lantai dan ruangan serta jika ada tumpahan bahan yang dapat
menyebabkan infeksi.






137

DAFTAR PUSTAKA

Adhi, I Ketut D, S.Kom. 2008. Bakteri: ciri-ciri, struktur, perkembangbiakan, bentuk
dan manfaatnya. http://gurungeblog.wordpress.com. Diakses tanggal 20 juni
2010
Badan POM RI. 2008. Pengujian Mikrobiologi Pangan. Info POM vol. 9 no. 2 Maret
2008.
Centre for Emergency Preparedness and Response. 2004. Laboratory Biosafety
Guidline. 3
rd
edition. Minister of Health. Canada
E. Pradhika. 2008. Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroba. http: //ekmon-
saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009
--------------. 2008. Media Pertumbuhan. http: //ekmon-saurus.blogspot.com. diakses
tanggal 2 Juni 2009
--------------. 2008. Isolasi Mikroorganisme. http: //ekmon-saurus.blogspot.com.
diakses tanggal 2 Juni 2009
--------------. 2008. Sterilisasi. http: //ekmon-saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2
Juni 2009
--------------. 2008. Morfologi Mikroba. http: //ekmon-saurus.blogspot.com. diakses
tanggal 2 Juni 2009
--------------. 2008. Aktivitas Enzimatis Mikroorganisme. http: //ekmon-
saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009
--------------. 2008. Daya Kerja Anti Mikroba dan Oligodinamik. http: //ekmon-
saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009
Pelczar, Michael J, Jr. dan E.C.S. Chan. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press.
Jakarta
Pramono, Hendro. 2007. Catatan Kuliah Mikrobiologi Dasar. www.unsoed.ac.id.
Diakses tanggal 20 juni 2010
Setiawan, W. 2005. Penghitungan Jumlah Mikroba Secara Langsung Menggunakan
Haemocytometer. http://blog.unila.ac.id/wasetiawan. Diakses tanggal 10 juni 2010


138
Standar Nasional Indonesia. 2006. Air Minum dalam Kemasan. SNI 01-3553-2006.
Badan Standarisasi Nasional.
----------------. 2008. Metode Pengujian Cemaran Mikroba dalam Daging, Telur dan
Susu, serta Hasil Olahannya. SNI 2987: 2008
Sumarsih, Sri. 2003. Diktat Kuliah Mikrobiologi Dasar. Fakultas Pertanian UPN
Veteran. Jogjakarta
Widianti, Ni Luh P dan Ni Putu Ristiati. 2004. Analisis Kualitatif Bakteri Koliform pada
Depo Air Minum Isi Ulang di Kota Singaraja Bali. Jurnal Ekologi Kesehatan Vol.
3 no. 1.
Wibowo, Marlia Singgih. 2000. Cara Pengawetan dan Penyimpanan Biakan Fungi.
Insatitut Teknologi Bandung

Anda mungkin juga menyukai