Anda di halaman 1dari 4

ISOLASI GEN

Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa
protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik harus
dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik dan enzimatis. Hal ini disebabkan membran
sel dari membran inti sebagian besar tersusun atas lipida, Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada
tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa
dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008).
Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi
DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA;
metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak
boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.
Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada
dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan.

Isolasi DNA adalah suatu proses untuk memisahkan DNA dari suatu sel makhluk hidup baik dari
inti, mitokondria maupun kloroplas. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk
mempelajari DNA seperti mengetahui urutan basa purin dan pirimidinnya. Prinsip-prinsip dalam
melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang
terpisah, yaitu supernat pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002 :
115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari
campuran (Albert dkk. 1994 : 254)


KLONING GEN
Kloning gen merupakan suatu terobosan baru untuk mendapatkan sebuah gen yang mungkin
sangat dibutuhkan bagi kehidupan manusia. Kloning gen meliputi serangkaian
proses isolasi fragmen DNA spesifik dari genom suatu organisme, penentuan sekuen DNA,
pembentukan molekul DNA rekombinan, dan ekspresi gentarget dalam sel inang.
Penentuan sekuen DNA melalui sekuensing bertujuan untuk memastikan fragmen DNA yang
kita isolasi adalah gen target sesuai dengan kehendak kita. Gen target yang kita peroleh
selanjutnya kita klon dalam sebuah vektor (plasmid, phage atau cosmid) melalui teknologi DNA
rekombinan yang selanjutnya membentuk molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan yang
dihasilkan kemudian ditransformasi ke dalam sel inang (biasanya sel bakteri, misalnya strain E.
coli) untuk diproduksi lebih banyak. Gen-Gen target yang ada di dalam sel inang jika
diekspresikan akan mengahsilkan produk gen yang kita inginkan.
TRANSFER GEN
Metode transfer gen dapat dibedakan menjadi 2, yaitu:
1) Transfer gen secara langsung
Particle bombardment (penembakan partikel / gene gun)
Prinsip dari metode ini adalah penembakan partikel DNA-coated secara langsung ke sel
atau jaringan tanaman. Sesuai peryataan Klein Pada metode ini partikel DNA ditembakkan
secara langsung ke dalam sel atau jaringan tanaman (Klein et al.1988). Partikel DNA tersebut
akan menembus dinding sel dan membrane, kemudian partikel DNA berdifusi dan menyebar ke
dalam sel secara independen. Untuk melakukannya digunakan senjata yang dapat menembakkan
mikro-proyektil berkecepatan tinggi ke dalam sel tanaman. Mikro-proyektil tersebut akan
mengantarkan DNA untuk masuk ke dalam sel tanaman. Penggunaan senjata gen memberikan
hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi kerusakan sel selama
penembakan berlangsung.
Karbid silicon
Suspensi sel tanaman yang akan ditransformasi dicampur dengan serat karbid silikon dan DNA
plasmid dari gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam tube (tabung eppendorf) kemudian
dicampur dan diputar menggunakan vortex. Serat silicon karbida berfungsi sebagai jarum injeksi
mikro (mikro injection) untuk memudahkan perpindahan DNA ke dalam sel tanaman.
Metode Elektroporasi
transfer DNA yang umum digunakan pada tanaman monokotil adalah elektroporasi dari
protoplas. Elektroporasi menggunakan perlakuan listrik bervoltase tinggi menyebabkan
permiabilitas tinggi pada membran sel dengan membentuk pori-pori sehingga DNA mudah
penetrasi kedalam proptoplas. Perlakuan elektroporasi ini seringkali dikombinasikan dengan
perlakuan poly ethylene glycol (PEG) pada protoplas.
2) Transfer gen secara tidak langsung
Teknik pemindahan gen secara tak langsung dilakukan dengan bantuan
bakteri Agrobacterium. Bakteri ini mampu mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui
eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf disc ) atau bagain lain dari jaringan tanaman yang
mempunyai potensi beregenerasi tinggi. Agrobacterium tumefaciens galur alami memiliki
plasmid Ti. Segmen spesifik DNA plasmid Ti disebut T-DNA (transfer DNA ) dapat berpindah
dari bakteri ke inti sel tanaman dan berintegrasi kedalam genom tanaman. Karena A.
tumefaciensmerupakan patogen tanaman maka Agrobacterium sebagai vektor yang digunakan
untuk transformasi tanaman adalah bakteri dari jenis plasmid Ti yang dilucuti virulensinya
(disarmed), sehingga sel tanaman yang ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang mampu
beregenerasi akan membentuk suatu tanaman sehat hasil rekayasa genetik
EKSPRESI GEN
Ekspresi gen merupakan proses bagaimana informasi yang ada di dalam DNA bisa di
copy melalui proses traskripsi dalam organisme eukariot. Hasil proses transkripsi
adalah hn RNA (transkrip primer). Di dalam organisme eukariot ada tahapan proses tertentu
sebelum menghasilkan RNA, yaitu RNA processing. Kemudian diikuti tahap translasi yang
akhirnya menghasilkan polypeptida. Jika dalam proses tersebut ada tahapan yang tidak terjadi,
maka dalam hal ini tidak termasuk dalam kategori bahwa gen tersebut telah terekspresi atau
dengan akta lain tidak terjadi ekspresi gen.
Langkah-langkah utama dalam ekspresi gen adalah sebagai berikut.
1. Sintesis molekul RNA oleh RNA polymerase, yang menggunakan sekuen basa-basa dari satu
utas DNA sebagai cetakan dalam reaksi polimerisasi, seperti pada replikasi DNA. Proses ini
disebut transkripsi.
2. Molekul-molekul protein kemudian disintesis melalui penggunaan sekuen basa dari molekul
RNA untuk mengarahkan penggabungan asam-asam amino menurut urutan tertentu. Proses ini
disebut translasi.
Secara umum, rantai informasi genetik atau DNA merupakan pusat pengendali jalannya
metabolisme di dalam sel, yaitu dengan cara menyandikan protein. Proses tersebut dilaksanakan
melalui penentuan susunan nukleotida molekul RNA, yang selanjutnya susunan nukleotida
tersebut diterjemahkan ke dalam susunan asam amino dari rantai polinukleotida protein. Proses
penyusunan polinukleotida RNA berdasarkan pola DNA disebut transkripsi. Sedangkan proses
penyusunan asam amino menurut pola molekul RNA disebut translasi.