Anda di halaman 1dari 31

Biosensor Berbasis Sel

dan Protein untuk


Deteksi Bioavailibilitas
Logam Berat pada
Sampel Lingkungan
Maryanna I. Pratiwi
Anis Balqis N
Aruna Pradipta
Dian Cahyana Putra
Ibnu Nur Fikri
1. Pendahuluan
Pendeteksi ion logam dalam sampel dilakukan dengan metode lama
seperti :
1.ICP/AES
2.ICP/MS
3.FIAAS
4.Metode Elektrokimia
5.Polarografi
6.Elektroda voltametrik
Sampel yang diambil dari lingkungan perlu dilakukan:
1.Dilarutkan dalam suhu tinggi
2.Tekanan
3.Kondisi asam
Untuk membebaskan ion logam dalam larutan sebagai prasyarat semua
metode yang telah di sebutkan
Meskipun jumlah total sampel logam yang tedeteksi setelah beberapa
ekstraksi menggunakan metode diatas tidak selalu terkait dengan
toksisitas sampel.Sebab ketersediaan biologis ion logam tidak di
perhitungkan.Oleh karena itu dilakukan pengukuran pendekatan secara
biologis
Perlu Dilakukan pendekatan:
1.Pendekatan pertama dengan menggunakan bakteri tanah yang secara
genetik telah di modifikasi sehingga dapat memberikan sinyal jika terjadi
kontak dengan ion logam dalam sampel sehingga dapat di ukur kadarnya.
2.Pendekatan kedua
Interaksi antara ion logam dan protein pengikat logam spesifik dengan
merekam kapasitansinya
2. Cara Kerja
Experimental
Pembuatan promotor cassettes yang diinduksi logam berat
Immobilisasi dari biosensor tembaga
Pengukuran bioluminescence
Overekspresi dan purifikasi dari protein logam berat
Imobilisasi protein dan pengukuran kapasitansi
2.1 Pembuatan promotor cassettes yang
diinduksi logam berat

Dua klon yang mengandung promotor copSRA dikonstruksi di plasmid
pUC18/SfiI
Cassete SfiI yang mengandung elemen yang responsif terhadap merkuri
dibentuk
Cassete SfiI yang mengandung elemen yang responsif terhadap chromate
dibentuk
2.2 Immobilisasi dari biosensor tembaga
Imobilisasi strain AE1239 pada sodium alginat:
50mL kultur bakteri dipanen menggunakan sentrifugasi pada 6000 rpm
Pellet tersuspensi pada 20mL 0.9% NaCl dan ditambahkan 20mL 4% sodium
alginat
Dimasukkan ke dalam 200mL 0.2 M CaCl2 agar membentuk alginat beads
Imobilisasi keseluruhan biosensor tembaga:
Pellet disuspensi pada 9mL 0.9% NaCl
2.22 gr Agarosa dilarutkan didalam 100mL 0.9 NaCl dengan pemanasan, lalu
didinginkan pada suhu 30 derajat Celsius dan ditambahkan 5mL suspensi
bakteri


2.3 Pengukuran bioluminescence
25 mL kultur bakteri LB disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10.000
rpm dan di resuspensasi pada cryoprotectant dingin
150 mikroliter suspensi sel didispensasi pada tabung vial dan didinginkan pada
air es sebelum dimasukan freezer dengan suhu -40 derajat celsius
Didapat sel viabel setelah rekonstitusi pada medium rekonstitusi (MR)
Larutan metal salt 20mL ditambahkan kedalam suspensi sel bakteri 180mL
dan bioluminescence dihitung dalam waktu lima jam pada 23 derajat celsius
menggunakan Lucy1 Microtitre plate luminometer
2.4 overekspresi dan purifikasi
Protein MerR dicangkok di E. coli dan dioverekspresikan.
Setelah induksi selama 3 hari, dilakukan sonikasi, kemudian MerR dipurifikasi
dengan LC
GST-SmtA ditanam di E. coli dengan vektor dan di-overekspresikan
GST-SmtA dipurifikasi dengan Glutathine Sepharose 4B.


2.5 immobilisasi protein dan pengukuran
kapasitansi
GST dan MerR dicampur buffer fosfat, lalu ditempelkan ke plate emas
dengan EDC mediated coupling
Biosensor disusun dengan 3 elektroda yang dihubungkan dengan
potensiostat yang responsif.
Elektroda : foil platina, kabel platina, dan Ag/AgCl.
Buffer dimasukkan dalam sel dengan pompa peristaltik, sampel
dimasukkan lewat sampel loop.

3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Pengembangan tools genetika
baru
Sejumlah tools genetic baru serta pengetahuan dasar untuk produksi strain
yang responsive terhadap logam telah dikembangkan
Pengetahuan dasar yang penting adalah bahwa mekanisme aktivasi regulator/
promoter sensor berdasarkan aktivasi daerah operator/promoter yang
diinduksi logam
Pada biosensor, sinyal akan diterima Ppotein membran luar sel LamB
LamB merupakan peptida heterolog metal-binding metalothionein pada
permukaan luar membran sel gram negative.
Alcaligenes euthropus dipakai sebagai chassis karena kemampuannya sintas di
lingkungan keras
Feasibilitas pendekatan biosensor logam yang dibahas antara lain promoter
yang responsif terhadap Cu
2+
; Hg
2+
; Cr
6+/3+
; Pb
2+



Biosensor logam Cu menggunakan
operon resisten Cu pMOL30
Dipakai pula gen copSR yang
mengkode dua komponen regulator
system
Berbeda dengan operon resisten Cu
pada E. coli, gen regulator copSR
ditranskripsi pada arah berlawanan
dengan copABCD

Daerah regulator mer (merR dan
moter mer , P
merTPAD
dari transposon
Tn501 dipakai untuk biosensor
merkuri
Daerah promoter copSRA digunakan
sebagai promoter biosensor Cu
Ketika dikloning dalam A. euthrophus
untuk mengekspresikan LamB atau
sistem reporter GFP, konsentrasi 1 M
Cu
2+
atau 0,01 M HgCl
2
dapat mudah
dideteksi

Vektor ekspresi promoterless Vibrio fischeri luxCDABE
seperti pMOL877 digunakan untuk biosensor Cr.
Promoter chrA pada vector ini lebih mudah diinduksi
oleh ion Cr
6+
daripada Cr
3+
Namun Ni, Zn, Co, Al, Cd, Mn, AsO
4
, MoO
4
, WoO
4
, SeO
3

dan SeO
4
tidak menginduksi bioluminesen dan tidak
bersifat toksik hingga 100 M
vektor pMOL877 dan promoter chrA menunjukkan
dapat digunakan sebagai biosensor Hg dan Cr



Operon resisten timbal plasmid
pMOL30 mengandung 2 gen
Ketika dikloning pbrR terlihat sangat
spesifik terinduksi oleh ion timbal
1. pbrRA untuk meregulasi dan
karesistensi timbal
2. pbrR sebagi regulator operon
resisten merkuri

3.2 Imobilisasi sensor bakteri
Selanjutnya dilakukan imobilisasi biosensor yang diinduksi logam pada
matriks padat yang berbeda
Sensor Cu AEI1239 diimobilisasi di gel alginate dan gel agarose dengan penambahan
konsentrasi ion Cu
2+
di medium LB

Kedua matriks imobilisasi memiliki karakteristik sama namun sinyal relatif lebih
tinggi pada agarose karena overgrown kultur bakteri

Secara umum imobilisasi pada gel alginate lebih stabil daripada pada gel agarosa
Kapasitas afinitas sensor terhadap ion
logam spesifik
Self Assembled Monolayer(SAM) pembentukan molekul yang digunakan untuk
mengkonstruksi sensor yang sangat sensitif dan spesifik terhadap ion logam.
Konstruksi over ekspresi broader-spectrum MerR dari transposon Tn501
Bacillus yang dapat merespon adanya ion merkuri serta organomerkuri.
Produksi protein fusi synechococcal GST-SmtA metallothione




Karakteristik terjadinya pengikatan Zink (Zn) pada fusi protein dilihat
berdasarkan atomic adsorption spectroscopy
Fusi protein juga dapat mengikat ion Cd, Cu, dan Hg pada pH sedang.

pembuatan sebuah sensor afinitas didasarkan pada pengukuran
kapasitas,keberadaan lapisan immobilisasi
Penelitian yang dilakukan ini difokuskan pada penentuan optimalisasi
immobilisasi

Ada 3, antara lain :
-EDC-coupling
-PEGDGE-entrapment
-GA-crossin

Sejauh ini, EDC-coupling menunjukan sensitivitas yang paling tinggi.

Grafik 3.3.5


Grafik 3.3.7


4. Kesimpulan
Penelitian ini menghasilkan petunjuk feasibilitas teknologi untuk mendeteksi ion logam
berat berdasarkan whole cell biosensor dan protein based biosensors
Telah dilakukan beberapa identifikasi dan penyusunan daerah promoter yang diinduksi
logam untuk mengaktivasi gen reporter lux atau GFP atau ekspresi epitope membran
luar yang dideteksi dengan imunochemistry
Telah dihasilkan gambaran kemungkinan penerapan teknologi whole cell biosensor
dengan imobilisasi. Adapun spesifitas biosensor yang tinggi terlihat pada ion Pb dan Cr
Demo afinitas sensor berdasarkan protein juga dilakukan untuk memonitor ion logam
berat pada trace level.
Sensor kapasitansi spesifik ion memiliki sensitifitas exceptional, serta sistem yang
kurang baik karena berbagai jenis pengenalan elemen dapat diimobilisasi langsung
seluruhnya pada self assembling monolayer dan melapisi permukaan elektroda
pengukuran logam mulia
Dibandingkan sensor elektrokimia, protein based sensor lebih sensitif
Whole cell sensor hanya mampu bereaksi pada fraksi ion logam yang bioavailable,
sementara protein based sensor lebih aplikatif karena sensitif untuk ion logam.

Pustaka
Corbisiera, Philippe ., Daniel van der Leliea., Brigitte Borremansa., Ann
Provoosta.,Victor de Lorenzob., Nigel L. Brownc., Jonathan R. Lloydc.,
Jonathan L. Hobmanc., Elisabeth Csoregid., Gillis Johanssond., Bo
Mattiasson.1999. Whole cell- and protein-based biosensors for the detection of
bioavailable heavy metals in environmental samples. Analytica Chimica Acta
387: 235-244