I.Introducere L-acid ascorbic (vitamina C), reprezint un antioxidant de exceptie ce contribuie activ la frnarea proceselor degenerative din organism. Facnd parte din grupa vitaminelor hidrosolubile (solubile in apa),acidul ascorbic se elimina n cantitati mari din organism. L-enantiomerul acidului ascorbic se mai numete i vitamina C (numele de "ascorbic"vine de la proprietatea sa de a preveni i vindeca scorbutul). Vitamina C, cu denumirea IUPAC (R)-3,4-dihidroxi-5((S)-1,2-dihidroxietil)furan-2 ona, este de fapt -lactona acidului 2,3-dienol-L-gulonic i conine in molecula 6 atomi de carbon, dou grupri alcoolice i dou grupri enolice. Vitamina C se poate prezenta sub forma de izomeri optici(R,S), datorita faptului c are n structur un atom de carbon asimetric. Forma activa biologic a acidului ascorbic face parte din seria L. Enantiomerul D este lipsit de semnificaie fiziologic. Activitatea vitaminic a acidului ascorbic este determinat de prezena gruprii en-dolice specifice, forma biologic activ fiind cea n care gruprile en-dolice sunt libere pentru a trece reversibil n grupe cetonice. II.Formule chimice de structura ale celor doi compusi sunt : Acid L-ascorbic ( Acidum Ascorbicum) Acid dehidroascorbic: este forma reversibil oxidata a acidului ascorbic i este biologic activ . Se prepar prin aciunea benzochinonei asupra acidului ascorbic. III.Structura chimic
4
IV.Proprieti fizice Acidul ascorbic este un compus nesaturat, cu caracter acid datorit prezenei celor doi hidroxili enolici capabili de a se disocia cu formarea de ioni de hidrogen. Vitamina C este o pulbere alb,cristalin,fr miros, este uor solubil n ap, solubil n alcool i metanol, practic insolubil n benzen,cloroform,eter, eter de petrol i uleiuri grase. Stabil n aer,n stare uscat. n preparatele impure i n multi produi naturali, vitamina se oxideaza cnd este expusa la aer i lumin. Punctul de topire: 188-192C. V.Surse naturale Acidul ascorbic se gsete n stare natural n toate plantele i animalele, preponderent n fructele proaspete (n special citrice) i n multe legume. 1.Plante Cantitatea de vitamina C din alimente provenite din plante depinde de: varietatea exact a plantei condiiile solului climatul n care s-a dezvoltat perioada de timp dintre recoltare i consumare condiiile de pstrare metoda de preparare. Gtitul n general, se presupune, distruge vitamina C.
5
Urmtorul tabel arat abundena relativ a vitaminei C n plante crude. Cantitatea este exprimat n mgla 100 grame de fruct sau legum:
Concentraia de acid ascorbic variaz n funcie de temperatur i de perioada de stocare. Prin urmare, apar modificri ale cantitii de vitamina C la anumite legume i fructe n timpul congelrii la diferite condiii( depozitare 2 luni la diferite temperaturi). S-a observat faptul c temperatura de depozitare constituie un factor major al scderii lente a cantitii de acid ascorbic. De asemenea, fieberea la temperatur ridicat ct i prjirea reduc drastic cantitatea de vitamina C. 2. Animale Majoritatea speciilor de animale i plante ii sintetizeaz singure vitamina C. Prin urmare, nu este o vitamin pentru ele. Sinteza este obinut printr-o secven de pai,bazai pe enzime, care convertesc glucoza n acid ascorbic. Acest lucru are loc fie n rinichi,la reptile i psri, sau n ficat, la mamifere. Ultima enzim din proces, l-gulonolacton oxideaz, nu poate fi fabricat de organismele umane deoarece gena care aparine enzimei nu funcionez. Toate organismele vii au nevoie de Vitamina C pe care fie o produc, fie o obin din alimentaie, n caz contrar putnd surveni chiar moartea din cauza scorbutului. 6
Abia n anii 1920 s-a realizat c i unele buci de carne sunt, de asemenea, o surs de vitamina C. Muchiul i grsimea, care reprezint baza alimentaiei occidentale moderne, sunt surse slabe. Ca i n cazul fructelor i legumelor, gtitul micoreaz cantitatea de vitamina C coninut.
Coninutul de vitamina C al unor produse de origine animal
7
Funcia biologica a acidului ascorbic
VI.Aciune fiziologic Acidul ascorbic efectueaz numeroase funcii fiziologice n corpul uman,acesta avnd o importan capital pentru organism. Organismul uman este capabil sa depoziteze n rezerve o parte din cantitatea ingerata, n organe cum sunt : suprarenalele, cristalinul, corpul vitros, umoarea apoasa, leucocite . Vitamina C, acidul ascorbic, este un acid organic cu proprieti antioxidante, implicat ntr-o serie de procese care se desfoar n celulele vii. n organismul uman vitamina C deine un rol complex i important; protejeaz compuii biologici activi de degradri oxidative, ntrete sistemul imunitar, stimuleaz procesele de biosintez a colagenului, hormonilor steroidici i a unor neurotransmitori. Doza de 10 mg/zi previne avitaminoza C, ns raia zilnic recomandat pentru un adult este de 60 mg. Lipsa vitaminei C din organism conduce la scorbut, denumit i boala marinarilor, caracterizat prin 8
gingivite (gingii cavernoase i inflamate), paradontoze, pierderea dinilor, vase de snge fragile, neelastice, inflamarea articulaiilor i anemie. Vitamina C este o substan usor oxidabil, degradarea sa fiind accelerat de cldur, lumin i de prezena cationilor metalelor grele. Pierderile de acid ascorbic ce au loc n decursul procedeelor tehnologice ce sunt parte a procesrii sucurilor de fructe, pot depi 50%. Din acest motiv, adeseori, fabricanii adaug vitamina C pentru a mbunti valoarea nutritiv i de a prelungi timpul de via al produselor.
Principalele ei proprieti sunt urmtoarele: intervine in fenomenele de oxido-reducere, fiind cel mai puternic antioxidant; este antiinfecioas, tonifiant, antitoxica; particip la asimilarea de ctre organism a fierului ; previne i vindec scorbutul; mrete rezistena vaselor sanguine; contribuie la formarea globulelor roii,a dinilor si oaselor; are rol de reglare a nivelului glicemiei i al colesterolului, de distrugere a toxinelor acumulate in organism; intervine n buna funcionare a esuturilor, precum i a diferitelor organe; particip la transformrile chimice ale proteinelor, lipidelor i glucidelor, la formarea substanelor intercelulare ; 9
diminueaz perioadele de convalescen; este eficient n reducerea ritmului de opacifiere a cristalinului (ndeosebi la persoanele vrstnice); ntrzie apariia cataractei i-i reduce gravitatea cu cca 50%; mpiedic depunerea grsimilor la nivelul ficatului asigur funcionarea normal a celulei hepatice; intervine n metabolismul carotenilor ; protejeaz acidul folic ; are aciune antialergica ; ca laxativ natural; scade incidena apariiei de cheaguri in vasele sanguine; mreste gradul de absorbie a fierului organic; reduce efectele unui numr mare de alergeni; asigur coeziunea celulelor proteice, mrind astfel durata vietii.
VII.Metode de obinere La nivel industrial, sunt aplicate dou procedee, i anume: biosinteza cuplat cu transformarea chimic (procedeul Reichstein) i fermentaia, n dou stadii. Procedeul Reichstein este utilizat de firmele BASF, Takeda, La Roche i const n transformarea sorbitolului, obinut din glucoz, n sorboz, cu ajutorul unor bacterii (Acetobacter suboxidans, Bacterium xylinum, Erwinia sp., Corynebacterium sp.), urmat de sinteza chimic a acidului diaceton- gluconic i, n final, a acidului 2-ceto-gluconic. Acesta este transformat n vitamina C, n mediu acid. Obinerea vitaminei C prin fermentaie: prin acest procedeu, glucoza este transformat direct n acid 2,5-diceto-gluconic, cu ajutorul unor tulpini mutante de Erwinia sp. Din acidul 2,5-diceto- gluconic este biosintetizat, apoi acidul 2-ceto-gluconic, sub aciunea tulpinilor de Corynebacterium sp. n 1989, n SUA, a fost elaborat procedeul de obinere a acidului 2-ceto-gluconic prin fermentaie ntr- un singur stadiu, utilizndu-se culturi mutante de Erwinia herbicola pe substrat de glucoz, dar cu o productivitate inferioar procedeelor prezentate anterior. Acidul 2-ceto-gluconic, obinut prin fermentaia ntr-una sau dou stadii, este transformat chimic, n final, n vitamina C, similar 10
procedeului Reichstein. ns, indiferent de procedeul utilizat, separarea i purificarea vitaminei C necesit o succesiune de etape laborioase, cu consumuri importante de energie i materiale. Deoarece n etapa de transformare chimic, inclus n procedeul Reichstein, sau n a doua etap de fermentaie, conform procedeului de fermentaie n dou stadii, se folosete lichidul de fermentaie rezultat n etapa anterioar, soluia final va conine numeroi compui secundari, totui, acidul 2-ceto- gluconic aflndu-se n proporia cea mai mare. n plus, chiar n condiiile n care randamentele fiecrei etape sunt de circa 90 %, conversiautil a glucozei nu depete 60%, ca randament total (datorit numeroaselor etape implicate). n urmtoarea schem este prezentat sinteza industrial a acidului ascorbic de la glucoz prin procesul Reichstein:
11
Acidul ascorbic se obine prin extracie din diferite materii prime vegetale, prin sintez chimic, prin biosintez sau prin procedee combinate de sintez chimic i biosintez. Indiferent de metoda de obinere, separarea i purificarea necesit numeroase etape, care implic consumuri ridicate de materiale i energie. Soluia final din care trebuie extras acidul ascorbic conine numeroase produse secundare, cel mai important dintre acestea fiind acidul 2-cetogluconic. n ciuda faptului c fiecare etap a procesului decurge cu randamente de 90%, conversia global glucozei n acid ascorbic nu depete 60% . Datorit caracterului labil al acidului ascorbic, procedurile de extracie sunt proiectate pentru a o stabiliza. Soluiile de extract ar trebui s menin un mediu acid, s inactiveze oxidaza acidului ascorbic, s limiteze oxigenul i s precipite amidonul i proteinele. Alegerea depinde de soluia de extract i de proba matrice determinnd procedura. Acidul metafosforic inhib oxidaza acidului L- ascorbic, inhib cataliza din metal, i precipit proteinele. Amidonul este problematic n sensul ca interfereaz cu titrarea colorimetric i teste fluorometrice. Adaosul de etanol sau aceton pentru a extrage precipitate metafosforic solubilizeaza amidonul. Acest pas este necesar pentru a analiza prin metode spectroscopice multe legume, inclusiv cartofi, legume, porumb. Acetona este de asemenea util pentru a elimina metabisulfitul i dioxidul de sulf din fructele deshidratate i din sucuri de fructe. 12
Acidul ascorbic se extrage din celule prin ruperea esutului ntr-un mediu potrivit pentru extracie. Varza, la fel ca multe esuturi de plante superioare, poate fi uor omogenizat prin mcinarea ntr-un mojar i cu un pic de nisip curat (pentru a face procesul mai uor).Pentru o msurare exact a coninutului de acid ascorbic, extracia de acid ascorbic trebuie s fie complet, acidul ascorbic poate fi pierdut prin degradare. Multe plante conin oxidaza acid ascorbic, care catalizeaz oxidarea acidului ascorbic la acid dehidroascorbic. Atunci cnd celulele sunt pregatite pentru extracie, componentele din celule, care sunt de obicei separate prin membrane, se amestec mpreun. n aceste cazuri, oxidaza acidului ascorbic poate cataliza oxidarea acid ascorbic iniial prezent n esut.
VIII.Metode de analiz Pentru determinarea acidului ascorbic din diferite tipuri de probe, au fost sugerate multe tehnici analitice,toate bazndu-se pe caracterul reductor al analitului. Cromatografia lichid de nalt performan(HPLC), metode spectrofotometrice, instrumente de electroforez capilar,metode titrimetrice bazate pe titrare cu soluie oxidat(diclorofenol indofenol, iodat de potasiu sau bromat de potasiu) , metode biologice,electrochimice,fluorimetrice sau amperometrice, bazate pe biosenzori, toate utilizate pentru determinarea vitaminei C. Cu toate acestea, majoritatea prezint limitri n utilizare (unele sunt costisitoare, unele necesit o pregtire special sau nu sunt suficient de sensibile i selective). Este dificil s alegi o singur metod pentru a determina coninutul total al vitaminei C din produse alimentare, probe biologice i farmaceutice,deoarece fiecare prob are propriile ei caracteristici i proprieti specifice. Anumite metode sunt disponibile pentru a determina acidul ascoribic, dar foarte puine din acestea sunt folosite pentru determinarea ambelor forme: acid ascorbic i acid dehidroascorbic. Acest lucru se datoreaz faptului c cele formlele vitaminei C ,acidul ascorbic i forma sa oxidat ( acidul dehidroascorbic) posed proprieti chimice, optice i electrochimice diferite. Cea mai cunoscut metod pentru determinarea coninutului total de vitamina C din probele de alimente, este 2,4- dinitrofenil hidrazina (DNPH) (Riemschneider i colab., 1976). Aceasta este o metod simplificat pentru determinarea 13
simultan a acidului ascorbic si a acidului dehiroascorbic; reacia de cuplare a colorantului 2,4- dinitrofenil hidrazina cu vitamina C, urmat apoi de determinarea spectrofotometric. Detecia electrochimic reprezint o metod alternativ atractiv pentru detecia speciilor electroactive, datorita faptului c prezint o serie de avantaje, cum ar fi: usurin n manipulare, miniaturizare, prezint o sensibilitate ridicat si un cost sczut. Detecia electrochimic poate fi cuplat cu cromatografia lichid de nalt performan pentru a asigura o sensibilitate mare a speciilor electroactive. Determinarea vitaminei C din sucurile de fructe prin cromatografia lichid de nalt performan ( HPLC ): n special, metodele cromatografice sunt foarte eficiente n determinarea acidului ascorbic prin analiza cantitativ a materialelor complexe,cum ar fi sucurile de fructe, legume i buturile. Prin aceast metod se pot separa,identifica i cuantifica majoritatea acizilor organici din sucurile naturale de fructe folosind HPLC ,care va identifica compuii, nu doar cu timpii lor de retenie, ci i cu spectrele lor individuale.
Materiale i metode Sucul de citrice se centrifugheaz la 3000 de rotaii timp de 10 minute ,iar supernantantul se dilueaz n raport 1:50 pentru determinarea acidului citric i n raport 1:5 pentru ali acizi. Diluiile sunt filtrate printr-o membran nainte de injectare. Se analizeaz 2 eantioane n duplicat. Se prepar o soluie standard mixt ce conine 1000mg/l acid citric, 2000mg/l acid malic, 300mg/l acid oxalic si acid ascorbic, 700mg/l acid tartric i 400mg/l acid lactic. Soluia standard si diluiile corespunzatoare sunt preparate cu ap distilat i sunt pstrate n locuri ntunecoase , la temperatur joas (+4oC).
Analiza HPLC Acizii organici din probe sunt separai prin cromatografie cu faz invers ,i determinai cu ajutorul absorbanei,apoi cuantificai cu graficele de calibrare externe.Pentru detectarea simultan a 6 probe,detectorul este setat la lungimea de und =254
14
Timpii de retenie, gradul de concentraie si limita de detecie pentru acizi organici standard:
Determinrile se fac la 10C folosind o faz mobil format din soluie de fosfat (se dizolv 6,8g dihidrogenofosfat de potasiu n 900ml ap; pH-ul se ajusteaz cu acid fosforic pn la pH=2,8 apoi se completeaz cu ap pn la 1000 ml),ce se filtreaz printr-o membran de poliamid i este introdus la vid. Rata de curgere a fazei mobile este de 0,7ml/min pentru toate separrile cromatografice. Coloana de separare este echilibrat cu faza mobil nainte ca linia de baz s se stabilizeze. La acest nivel se fac pipetri cu volume de 5 l pentru fiecare prob preparat sau soluie standard. Valorile abaterilor standard relative variaz de la 0,154 la 3,18% indicnd c aceast metod este precis ,cu un grad mare de repetabilitate ,n special pentru acidul citric, ascorbic, lactic i oxalic .Recuperarea acizilor organici din sucurile de citrice variaz ntre 95,8 si 102,1% confirmnd precizia de separare si condiiile de analiz. Aceast metod contribuie la dezvoltarea procedurii HPLC, fiind rapid i precis, pentru determinarea cantitativ a acizilor organici din sucurile de fructe, n condiiile de faz invers. Acizii oxalic,tartric,malic,lactic,citric i ascorbic sunt determinai simultan i luate din coloan n timp de 20 de minute. Avnd n vedere uurina i concizia de pregtire a probei,aceast metod poate fi considerat eficient,precis i rapid pentru determinarea acizilor organici.Se mai pot folosi i alte metode de determinare a vitaminei C, ns au anumite dezavantaje,consum mult timp i au reproductibilitate mai mic.
Determinarea vitaminei C prin metoda spectrofotometric UV Acidul ascorbic mai poate fi analizat prin metoda spectrofotometric UV. Spre deosebire de metoda HPCL ( care are avantajul unei specificiti avansate, dar implic operaii relativ laborioase), 15
spectrofotometria UV, prezint avantajul unei execuii simple,directe i extrem de sensibile. Ca orice metoda, aceasta prezint i dezavantaje cum ar fi interferena ingredienilor. Instrumente-spectrofotometru Shimadzu(model UV-1601)+o pereche de celule de cuar de 1 cm Reacticvi: acid acetic 5% metafosforic 10% soluie de tiouree 10% soluie2,4-dinitrohidrazin acid sulfuric 85% soluie standard vitamina C ( acid ascorbic) Pregtirea probei: 10g prob este omogenizat cu aproximativ 50ml de solutie de acid metafosforic 5% i acid acetic 10%, apoi este transferat ntr-un balon de sticl de 100 ml, se agit uor pn la omogenizare. Se dilueaz pn la semn cu soluie de acid acetic 10% si acid metafosforic 5% Soluia se filtreaz i filtratul obinut se colecteaz pentru determinarea vitaminei C din aceast prob. Estimarea vitaminei C- procedur: Peste filtratul cu proba se adaug ap de brom pentru a oxida acidul ascorbic in acid dehidroascorbic Se adaug cateva picturi de tiouree pentru a elimina excesul de brom, obinndu-se astfel o soluie limpede. Se introduce soluia standard de acid ascorbic i apoi 1 ml de 2,4- DNPH Amestecul obinut este meninut timp de 3 ore la o temperatur de 37 C ntr-o baie de ap. Dup incubare ,amestecul este rcit ntr-o baie de ghea i este tratat cu 5 ml H 2 SO 4 85 % i se agit constant. Se obine o soluie colorat. 16
Reacii: Acidul ascorbic este oxidat la acid dehidroascorbic prin aciunea apei de brom Acidul L-dihidroascorbic reacioneaz cu 2,4-difenilhidrazina i produce o osazon care, tratat cu H 2 SO 4 formeaz o soluie de culoare roie. Curba de calibrare: -este construit prin reprezentarea grafic a concentraiei fa de absorbia corespunztoare
IX.Utilizarea acidului ascorbic Antioxidantii reprezinta un grup de aditivi care se utilizeaza pentru pastrarea calitatii grasimilor, impiedicand procesul de deagrdare a grasimilor pirn autooxidae (rancezire aldehidica). In cazul alimentelor, degradarea grasimilor, pe langa faptul ca face alimentele improprii consumului (modificand gustul si mirosul), reduce si valoarea lor nutritive. Grasimile degradate oxidative au effect daunator asupra organismului prin actiune distructiva aspura vitaminelro A,EC,B2,B6 din alimente (avitaminoze secundare), prin lezarea mucoasei gastrice i intestinale, n care caz se ajunge la scderea coeficientului de utilizare digestiv aalimentelor i prin aciunea peroxizilor i radicalilor din grsimile autooxidate asupramembranelor celulare, asupra unor vitamine din organismul uman .Antioxidanii pot fi clasificai n antioxidani propriu-zii i antioxidani secundari. Substanelecare ntresc aciunea antioxidanilor se numesc sinergetice. Dup originea lor antioxidanii pot finaturali i de sintez. 17
Acidul ascorbic este utilizat ca un antioxidant n industria berii, mrind timpul de depozitare a berii pe raft si prevenind tulburarea ei. E300 este folosit ca i conservant n industria crnii pentru a-i pstra culoarea, ca agent de coacere n panificaie, dar i pentru a inhiba decolorarea fructelor tiate, a pulpei i a sucurilor de fructe. Soluiile pentru developarea fotografiilor conin i ele acid ascorbic. Acidul ascorbic se mai gsete n unt, produse cu ou congelate, lapte praf, lapte condensat, cartofi congelai, mncare pentru sugari n conserv, vinuri. Se mai poate aduga i produselor care i pierd Vitamina C prin prelucrare fulgii de cartofi. Acidul ascorbic i srurile sale de sodiu, de potasiu i de calciu sunt utilizate n mod obinuit ca aditivi alimentari. Aceti compui sunt solubili n ap i astfel nu pot preveni oxidarea grsimilor. Pentru acest scop se folosesc esterii solubili n grsime ai acidului ascorbic cu acizi grai cu lan lung (ascorbyl palmitat sau ascorbyl stearat). Numerele E relevante sunt: E300 acid ascorbic, E301 ascorbat de sodiu, E302 ascorbat de calciu, E303 ascorbat de potasiu, E304 esteri glicerici ai acidului ascorbic: ascorbyl palmitat i ascorbyl stearat. X.Forme farmaceutice Exista o gama foarte mare si variata de produse farmaceutice care contin vitamina C. Acesta se gsete att singur n preparatele farmaceutice, ct i n combinaie cu alte vitamine sau/i minerale. n produsele farmaceutice, acidul ascorbic se gsete sub urmatoarele forme: comprimate, drajeuri, capsule gelatinoase comprimate efervescente sau pulberi efervescente comprimate masticabile: in general, aceste produse sunt destinate copiilor, contin diferite arome si au culori i forme usor acceptate de acestia; solutii injectabile.