Pengantar

Istilah generik 'folat' mewakili semua bentuk folat disintesis sepenuhnya

melalui oksidasi 'asam folat' dan poliglutamat alami yang ada dalam makanan.
vitamin B terlibat dalam fungsi penting dari metabolisme sel seperti replikasi DNA,
perbaikan, metilasi dan sintesis nukleotida. Karena kekurangan folat telah dikaitkan
dengan kejadian cacat tabung saraf pada embrio pengembangan, asupan lebih tinggi
(600 mg / d) adalah dianjurkan untuk wanita sebelum dan selama kehamilan. Juga
asam folat seperti juga penting bagi wanita menyusui sehingga untuk memenuhi
tuntutan menyusui, Defisiensi folat juga telah terlibat dalam berbagai gangguan dari
Alzheimer penyakit jantung koroner, cacat tabung saraf, peningkatan risiko kanker
payudara dan kanker kolorektal. Karena kesehatan manfaat yang terkait dengan
peningkatan asupan folat maka banyak negara sekarang memiliki pengayaan
folat. Akhir-akhir ini, sejumlah studi telah menunjukkan bahwa tidak seperti folat
alami, konsumsi tinggi asam folat, yang bentuk disintesis secara kimia (ditoleransi
tingkat asupan atas, 1000 g/d), dapat menyebabkan efek yang merugikan kesehatan
seperti masking manifestasi hematologis awal vitamin B12kekurangan, leukemia,
arthritis, kanker usus besar dan kehamilan ektopik. Oleh karena itu, secara alami folat
yang dihasilkan tampaknya lebih rasional untuk fortifikasi tujuan dan memerlukan
ketersediaan cepat dan untuk mendeteksi metode analisis dan membedakan folat dan
folat tingkat asam dalam makanan. Umumnya berbagai metode penentuan folat
termasuk: biologi, mikrobiologi, biospesifik (mengikat atau uji immuno),
elektrokimia, metode spektrofotometri atau kromatografi seperti sebagai gel atau
kromatografi cair tekanan-tinggi (HPLC)
Uji mikrobiologi (MA) berfungsi sebagai metode analisis folat dan menjadi
satu-satunya sumber uji folat.Hal ini bergantung pada turbidimetri pertumbuhan
bakteri Lactobacillus rhamnosus yang digunakan sebagai suatu organisme uji.
Setelah hydrolisis folat ini dapat didukung oleh pertumbuhan Lb. rhamnosus
atau diukur dengan metode lain.Keterbatasan Lb. rhamnosus dan organisme uji
lainnyadalam membedakan derivatif folat dalam ekstrak folat memiliki daya dorong
penggunaan teknik kromatografi. teknik Ini melibatkan dua langkah yang berbeda:
pemisahan dan pemurnian ekstrak deconjugated diikuti oleh deteksi dan kuantifikasi
monoglutamates dielusi
Bahan dan metode
Pengumpulan dan pra-perlakuan sampel susu
Satu liter sampel susu mentah segar dikumpulkan dari sapi, kerbau, domba dan
kambing sampel susu dari satu set minimal 5 hewan berbeda dari masing-masing jenis
dikumpulkan dari Susu Nasional.Contoh: koleksi susu diulang 6 kali pada hari yang
berbeda selama satu musim untuk replikasi dari hasil. Botol berisi sampel segera
diamankan di dalam peti es untuk menjaga suhu pada 4 0,5 C selama
transportasi.Sampel ini dibawa ke laboratorium dan botol sampel segera
didinginkan. sampel susu itu dikumpulkan dibiarkan mendingin sampai suhu 4 C.
Preparasi sampel
Persiapan sampel dilakukan sesuai metode dijelaskan oleh Keagy ( 1985 ),
Dengan tambahan trienzim.Tri-enzim dilakukan dengan menggunakan -amilase,
protease dan conjugase plasma manusia. Urutan dan waktu inkubasi
untuk perawatan enzim yang berbeda adalah sampai 4 jam untuk -amilase, 6 jam
untuk protease dan 12-16 jam untuk conjugase pada 37 C. Sebuah enzim dibuat
dengan air suling diikuti dengan perlakuan enzim. Sampel ini ekstrak digunakan untuk
estimasi folat oleh semua tiga metode yaitu. MA, HPLC, ELISA.
Estimasi dengan uji mikrobiologi
Isi folat diperkirakan oleh MA dengan penggunaan Lb. rhamnosus sebagai
organisme uji.
Estimasi dengan HPLC
Sistem HPLC dilengkapi dengan pompa,injector pengguna dengan,detektor UV,
kolom, dan sistem pengendali yang terhubung ke PC desktop software yang
digunakan.
Folat, terdeteksi oleh fluorescence pada detektor UV sedangkan asam folat
terutama terdeteksi oleh detektor UV.
Sistem HPLC dikondisikan dengan fase gerak sampai suntikan rangkap tiga larutan
standar menunjukkan identitas waktu retensi ((RT) dan luas puncak.dilakukan di
wilayah ultraviolet, pada 290 nm pada aliran 1 ml / menit, menggunakan 10%
asetonitril ditambah 90% penyangga fase cair pada awalnya, berubah menjadi 24%
fase berair acetonitrile ditambah 76% penyangga setelah 12 menit.
Asam folat lebih lanjut diperkirakan dalam susu skim dengan dan tanpa ditambahkan
(5 g/l) asam folat dan pemulihan ditambahkan asam folat dihitung dari perbedaan
nilai estimasi antara susu skim dengan dan tanpa tambahan asam folat.
Analisis statistik
Setiap penentuan dilakukan dalam rangkap tiga. Hasil dinyatakan sebagai
mean +SD. Perhitungan rata-rata konsentrasi, standard error (SE), Standar deviasi dan
koefisien variasi dilakukan oleh Software computer.

Hasil
Sebelumnya laboratorium penerapan MA telah dievaluasi untuk estimasi total
asam folat dalam susu dari spesies susu India yang berbeda (sapi, kerbau, domba dan
kambing) dengan metode ekstraksi tri-enzim tambahan menggunakan
Lb. rhamnosus sebagai suatu organisme uji. Dan Hasil penelitian menunjukkan
korelasi yang signifikan dengan diterbitkan data.
Dalam penelitian ini kurva standar untuk asam folat oleh MA ditemukan memiliki R
2nilai 0.99 ( Gambar 1.a) menunjukkan hubungan linear yang sempurna. Nilai rata-
rata asam folat sapi, kerbau, domba, kambing dan susu yakult masing-masing yang
ditemukan 44, 60, 56, 10 dan 50 mg/L. Tingkat pemulihan 98,3% dengan akurasi (RE
= 1,0%) dan pengulangan (CV% = 2,0 -5 6) diamati yang divalidasi efisiensi
dari MA.Kurva standar untuk ELISA ( Gambar 1. b) ditemukan linear, sesuai
rekomendasi pabrikan (R2= 0,992). Kurva standar ( Gambar 1. c)diperoleh HPLC
menunjukkan hubungan linear antara luas puncak dan konsentrasi (R2= 0.99).
Gambar 1a,1b,dan 1c :


HPLC Kromatogram menggambarkan respon dalam volt pada
Y axis dan retensi waktu dalam menit pada sumbu X. Gambar 2 menunjukkan puncak
asam folat standar pada RT 15,8 02 dengan puncak pelarut pada 5,8 0,1





Diskusi
Penentuan folat didalam asam folat dalam susu melalui MA, ELISA dan
HPLC, penelitian ini untuk mendeteksi bentuk dan tingkat folat. Komposisi makanan
berdasarkan MA melaporkan jumlah nilai folat untuk susu di kisarkan 5-7
g/100g. Dalam sestimasi total folat dari susu yang berbeda spesies susu oleh MA,
susu kerbau ditemukan mengandung tingkat tertinggi folat dibandingkan dengan sapi,
domba atau susu kambing.
Meskipun estimasi folat oleh MA dengan tambahan ekstraksi tri-enzim agak
memakan waktu, telah ditemukan menjadi sangat sensitif, serbaguna, direproduksi
dan menyediakan kuantitatif signifikan data pada kandungan total folat dari sampel
dianalisis. Selain membutuhkan peralatan rendah ongkos set up, dan dapat mengukur
mono polyglutamates bahkan pada nanogram tingkat. MA dengan metode tri-enzim
mengarah untuk menyelesaikan hidrolisis polyglumates ke bentuk monomer
sederhana Dan yang kemudian proporsional mendukung pertumbuhan organisme
uji Lb. rhamnosus, yang menunjukkan mirip isomer folat dan dengan demikian
memberikan nilai Total folat produk. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini
mengungkapkan bahwa nilai yang diperoleh dengan uji mikrobiologi dengan metode
tri-enzim tidak hanya untuk asam folat tetapi kandungan total folat sampel. Jadi MA
menyebabkan penentuan direproduksi dari total konten folat susu sampel yang berada
dalam hubungan yang signifikan dengan diterbitkan data. ELISA adalah sebuah
alternatif untuk MA untuk cepat, sensitif dan estimasi kuantitatif asam folat



Gambar. 2. kromatogram cair kinerja tinggi
Larutan asam folat Standard (10 ug / ml): panah menunjukkan puncak
asam folat pada waktu retensi (RT) 15,75 dengan daerah puncak (PA) dar
Nilai rata-rata asam folat pada sapi, kerbau,domba dan susu yak yang ditemukan agak
mirip, sistem pelarut ini menggunakan detektor UV yang mendeteksi hanya asam folat
karena sensitivitas dan spesifisitas tinggi tanpa lintas reaktivitas.

Nilai absolut dari HPLC lebih rendah MA, mungkin karena keterbatasan
detektor UV untuk mengidentifikasi turunan folat lainnya. Keterbatasan
Lb. rhamnosus dan organisme uji lainnya dalam membedakan derivatif folat dalam
ekstrak folat telah mendorong penggunaan teknik kromatografi. Hasil dari HPLC juga
ditemukan jauh lebih rendah (30-40%) dibandingkan hasil mikrobiologi..
Di antara berbagai metode MA, HPLC dan ELISA, masing-masing memiliki
pro dan kontra. Dalam penelitian ini estimasi folat dalam susu melalui HPLC, ELISA
dan uji mikrobiologi menunjukkan analisis komparatif dari estimasi nilai rata-rata
folat oleh tiga metode. Studi hasil menunjukkan bahwa di antara ketiga metode,
HPLC menjadi metode yang lebih sensitif dapat mengukur bentuk folat yang berbeda
dengan spesifisitas berbeda dengan deteksi metode konvensional lainnya. Oleh karena
itu, MA menjadi metode premium dari total estimasi folat, memiliki potensi untuk
dipekerjakan sebagai diet uji estimasi folat terutama di nutraceutical persiapan
sementara HPLC tampaknya lebih efisien dan layak untuk penentuan kuantitatif asam
folat yang di rekomendasikan dalam produk yang diperkaya.