Anda di halaman 1dari 11

BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang.
Imunohistokimia merupakan proses untuk mendeteksi antigen (protein, karbohidrat,
dsb) pada sel dari jaringan dengan prinsip reaksi antibody yang berikatan terhadap antigen
pada jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari nama immune yang menunjukkan
bahwa prinsip dasar dalam proses ini ialah penggunaan =antibody dan histo menunjukkan
jaringan seara mikroskopis. Imunohistokimia seringkali digunakan untuk mengukur dan
mengidenti!ikasi karakteristik dari proses seluler seperti proses proli!erasi sel, apoptosis sel.
Imunohistokimia juga sering digunakan untuk penelitian dasar dalam rangka mengetahui
distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein terekspresi pada berbagai maam jaringan
pada tubuh. "ntuk mem#isualisasikan hasil interaksi antara antigen dan antibody dapat
dilakukan dengan berbagai maam ara, dimana ara yang paling sering digunakan ialah
dengan konjugasi antibody dengan en$im seperti peroksidase. %elain itu juga bias digunakan
!luorophore seperi !luoresin atau rhodamin. "ntuk mempelajari mor!ologi sel, sel
dalam jaringan di!iksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan di#isualisasikan dengan
mikroskop elektron atau mikroskop ahaya.
Imunohistokimia merupakan suatu ara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas
atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Imunohistokimia adalah metode
untuk mendeteksi keberadaan antigen spesi!ik di dalam sel suatu jaringan dengan
menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (&b) dan antigen (&g) pada jaringan hidup.
'emeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang ber#ariasi
tergantung dari tujuan pemeriksaan.
(eknik imunohistokimia berman!aat untuk identi!ikasi, lokalisasi, dan karakterisasi
suatu antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis kanker. (eknik ini
diawali dengan pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk diamati dibawah mikroskop.
Interaksi antara antigen)antibodi adalah reaksi yang tidak kasap mata. (empat pengikatan
antara antibodi dengan protein spesi!ik diidenti!ikasi dengan marker yang biasanya
dilekatkan pada antibodi dan bisa di#isualisasi seara langsung atau dengan reaksi untuk
mengidenti!ikasi marker. *arker dapat berupa senyawa berwarna + ,uminesene, $at
ber!luoresensi + !luoresein, umbelli!eron, tetrametil rodhamin, logam berat + olloidal,
mirosphere, gold, sil#er, label radioakti!, dan en$im + -orse .adish 'ero/idase (-.') dan
1
alkaline phosphatase. 0n$im (yang dipakai untuk melabel) selanjutnya direaksikan dengan
substrat kromogen (yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut)
yang dapat diamati dengan mikroskop bright field (mikroskop bidang terang). &kan tetapi
seiring berkembangnya ilmu pengetahuan khususnya dunia biologi, teknik imunohistokimia
dapat langsung diamati (tanpa direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan warna)
dibawah mikroskop fluorescense.
1.2 Rumusan Masalah
1.1.1 2agaimana langkah)langkah untuk pengujian Imunohistokimia3
1.1.1 2agaimana *etode dasar identi!ikasi antigen dalam jaringan dengan
imunohistokimia3
1.1.4 &pa saja *etode dalam Imunohistokimia3
1.1.5 2agaimana 'rosedur 6asar dalam Imunohistokimia3
1.1.7 2agaimana 'rosedur Imunohistokimia dalam 'ewarnaan (unggal (I-8)%ingle
%taining)3
1.1.9 2agaimana 'rosedur Imunohistokimia 'ewarnaan :anda (I-8)6ouble %taining)3
1.3 Tujuan
1.4.1 *engetahui langkah)langkah dalam Imunohistokimia
1.4.1 *engetahui *etode dasar identi!ikasi antigen dalam jaringan dengan
Imunohistokimia.
1.4.4 *engetahui *etode dalam Imunohistokimia
1.4.5 *engetahui 'rosedur 6asar dalam Imunohistokimia
1.4.7 *engetahui 'rosedur Imunohistokimia dalam 'ewarnaan (unggal (I-8)%ingle
%taining).
1.4.9 *engetahui 'rosedur Imunohistokimia 'ewarnaan :anda (I-8)6ouble %taining)
BAB II
PEMBAHAAN
2
2.1 Langkah!langkah "alam melakukan #mun$h#st$k#m#a
&dapun langkah)langkah untuk melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 1, yaitu
preparasi sampel dan labeling. 'reparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat
jaringan dari jaringan yang masih segar. 'reparasi sample terdiri dari pengambilan jaringan
yang masih segar, !iksasi jaringan biasanya menggunakan !ormaldehid, embedding jaringan
dengan para!in atau dibekukan pada nitrogen air, pemotongan jaringan dengan
menggunakan mikrotom, depara!inisasi dan antigen retrie#al untuk membebaskan epitop
jaringan, dan bloking dari protein tidak spesi!ik lain. %ampel labeling adalah pemberian
bahan)bahan untuk dapat mewarnai preparat. %ampel labeling terdiri dari imunodeteksi
menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan ounterstaining untuk
mewarnai jaringan lain di sekitarnya. &ntibodi adalah suatu imunoglobulin yang dihasilkan
oleh sistem imun dalam merespon kehadiran suatu antigen tertentu. &ntibodi dibentuk
berdasarkan antigen yang menginduksinya. 2eberapa antibodi yang telah teridenti!ikasi
adalah Ig&, Ig6, Ig0, Ig:, dan Ig*. &ntigen adalah suatu $at atau substansi yang dapat
merangsang sistem imun dan dapat bereaksi seara spesi!ik dengan antibodi membentuk
kompleks terkonjugasi. Ikatan antibodi)antigen di#isualisasikan menggunakan senyawa
label;marker.
2.1.1 Met$"e "asar #"ent#%#kas# ant#gen "alam jar#ngan "engan
#mun$h#st$k#m#a
*etode dasar identi!ikasi antingen pada jaringan menggunaka 1 metode yaitu metode
langsung (direct method) dan tidak langsung (indirect method). *etode langsung (direct
method) merupakan metode pengeatan satu langkah karena hanya melibatkan satu jenis
antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, ontohnya antiserum terkonjugasi fluorescein
isothiocyanate (<I(=) atau rodhamin. 6i sisi lain, metode tidak langsung (indirect method)
menggunakan dua maam antibodi, yaitu antibodi primer (tidak berlabel) dan antibodi
sekunder (berlabel). &ntibodi primer bertugas mengenali antigen yang diidenti!ikasi pada
jaringan (first layer), sedangkan antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer
(second layer). &ntibodi kedua merupakan anti)antibodi primer. 'elabelan antibodi sekunder
diikuti dengan penambahan substrat berupa kromogen. 8romogen merupakan suatu gugus
!ungsi senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan
senyawa tertentu. 6isamping kedua metode di atas, analisis imunohistokimia juga dapat
3
dilakukan melalui metode 'ero/idase)anti)'ero/idase dan metode &#idin)2iotin)=omple/
(&2=).
*etode 'ero/idase)anti)'ero/idase ('&') adalah analisis imunohistokimia
menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua antibodi yang membentuk seperti roti
sandwich. (eknik ini meman!aatkan a!initas antibodi terhadap antigen (en$im) untuk
membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan terhadap proses kimia terkonjugasi
<itur unik dari prosedur ini adalah larutan en$im)antibodi dan kompleks imun '&'. 0n$im
Horseradish Peroksidase, protein imunogenik, digunakan untuk menyuntik spesies tertentu
dan merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap en$im. &ntiserum ini dipanen dan
ditempatkan dalam larutan pada en$im sehingga membentuk kompleks imun yang larut.
%edangkan metode &#idin)2iotin)=omple/ (&2=) adalah metode analisis imunohistokimia
menggunakan a!initas terhadap molekul a#idin) biotin oleh tiga en$im peroksidase. %itus
pengikatan beberapa biotin dalam molekul a#idin tetra#alen bertujuan untuk ampli!ikasi dan
merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen target.
I-= merupakan teknik deteksi yang sangat baik dan memiliki keuntungan yang luar
biasa untuk dapat menunjukkan seara tepat di dalam jaringan mana protein tertentu yang
diperiksa. I-= juga merupakan ara yang e!ekti! untuk memeriksa jaringan. (eknik ini telah
digunakan dalam ilmu sara!, yang memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi protein
dalam struktur otak tertentu. 8ekurangan dari teknik ini adalah kurang spesi!ik terhadap
protein tertentu tidak seperti teknik imunoblotting yang dapat mendeteksi berat molekul
protein dan sangat spesi!ik terhadap protein tertentu. (eknik ini banyak digunakan dalam
diagnostik patologi bedah terhadap kanker, tumor, dan sebagainya. &dapun marker untuk
diagnosa I-= adalah sebagai berikut+
=arinoembryoni antigen (=0&)+ digunakan untuk identi!ikasi adenocarcinoma.
=ytokeratins+ digunakan untuk identi!ikasi carcinoma tetapi juga dapat terekspresi
dalam beberapa sarkoma.
=617 and =64> + digunakan untuk identi!ikasi Hodgkin's disease
&lpha !etoprotein+ untuk tumor yolk sac dan karsinoma hepatoselluler
=611? (8I()+ untuk gastrointestinal stromal tumors (:I%()
=61> (=&,,&)+ untuk renal cell carcinoma dan acute lymphoblastic leukemia
4
'rostate spei!i antigen ('%&)+ untuk prostate cancer estrogens dan progesterone
staining untuk identi!ikasi tumor
Identi!ikasi sel 2 lim!a menggunakan =61>
Identi!ikasi sel ( lim!a menggunakan =6 4
2.3 Met$"e "alam Imun$h#st$k#m#a
1. Met$"e Langsung &"#re't meth$"(
*etode ini menggunakan sebuah antibodi berlabel yang akan langsung berikatan
dengan antigen yang sesuai. 6alam tahapannnya antigen dilokalisasi satu tahap dengan
antibodi yang dikonjugasi dengan marker. *etode ini memiliki kelebihan yaitu sederhana
dan hasilnya epat didapatkan. %edangkan kekurangannnya adalah mor!ologi latar tidak
tampak, pada tiap antigen yang berbeda diperlukan antibodi terkonjunggasi yang berbeda)
beda. *etode ini lebih jarang digunakan dalam aplikasinya. 'enggunaan metode ini
direkomendasikan dalam identi!ikas immunoglobulin, komplemen, komplek imun pada
biopsi ginjal dan kulit. %erta melokalisasi antigen @iral, bakterial, proto$oal, dalam smear
atau airan tubuh.
*etode imunohistokimia diret menggunakan antibody primer yang sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target seara
langsung.
2. M
et$ "e
t#"ak Langsung &#n"#re't meth$"(
*etode ini menggunakan antibodi primer yang tidak berlabel yang akan berikatan
dengan antigen, selanjutnya antibodi sekunder yang berlabel akan berikatan dengan antibodi
primer. ,abel antibodi sekunder dapat berupa en$in, !luoresen, atau biotin. (ahapannya ada
5
dua langkah, pertama inkubasi dengan antibodi primer, kemudian antibodi
sekunder.kele)#han adalah @ersatility, dan lebih sensiti#e dari pada metode langsung.
%edangkan kekurangan a"alah latar tidak tampak, dan harus dengan !ro$en setion metode
ini direk$men"as#kan pada antibodi pada dalam serum (dipakai sebagai antibodi primer+
penyakit autoimun, in!eksi bakteri dan parasit).
*etode imunohistokimia indiret menggunakan antibody primer yang tidak ada
labelnya, namun digunakan juga antibody sekunder yang sudah memiliki label dan akan
bereaksi dengan Ig: dari antibody primer.
2.* Pr$se"ur Dasar
'rosedur histoteknik umumnya menggunakan !iksasi !ormalin dalam pembuatan
preparat. <ormalin dapat melakukan ikatan silang (ross)lingking) dengan protein target pada
jaringan, sehingga antigen ( protein target) menjadi tertutup (masking) sehingga tidak bisa
dikenali oleh antibodi yang digunakan. "ntuk itulah diperlukan tahap antigen Retrival yang
bertujuan membuka (unmasking) pada protein target. (erdapat beberapa maam prosedur
antigen retrival tergantung dari jenis protein targen yang dituju.
(ahap selanjutnya yang menetukan tingkat keberhasilan prosedur Imunohistokimia,
yaitu melakukan bloking en$im)en$im endogen terutama bila menggunakan en$im
peroksidase untuk melabel antibodi sekunder. 0n$im peroksidase adalah en$im yang
umumnya terdapat pada berbagai jenis jaringan dan sel terutama sel darah merah
(pseudoperoksidase) dan sel darah putih (peroksidase endogen). 2ila en$im peroksidase ini
tidaak diblok terlebih dahulu, maka substrat kromogen yang diberikan dapat bereaksi dengan
peroksidase pada jaringan dan sel, bahkan dapat bereaksi dengan peroksidase yang digunakan
untuk melabel. 6engan demikian, hal tersebut akan menghasilkan interpretasi yang tidak
6
benar. 2loking en$im endogen peroksidase dilakukan dengam memberikan hidrogen
peroksidase sebagai substrat peroksidase pada slide. %ubstrat ini akan mengakibatkan
peroksidase yang ada didalam sel, sehingga yang bereaksi dengan substrat kromogen hanya
peroksidase yang ada pada antibodi. 2ila en$im alkalin !os!atase dipakai untuk melabel
antibodi, maka prosedur bloking en$im endogen tidak diperlukan. 2iotin endogen sering
dijumpai pada hati dan ginjal. "ntuk mengatasinya, sebaiknya digunakan sistem deteksi yang
tidak mengandung a#idin)biotin atau melakukan preinkubasi dengan a#idin.
(ahap berikutnya yang juga penting yaitu bloking untuk menegah terjadinya
pewarnaan latar yang nonspesi!ik dimana hasil positi! yang diperoleh bukan karena reaksi
ikatan antigen)antibodi. -al ini sering terjadi karena adanya ikatan ionik nonspesi!ik antara
antibodi dengan muatan dari jaringan ikat pada spesimen seperti halanya dengan kolagen.
Ikatan nonspesi!ik tersebut dapat dikurangi dengan menggunakan serum non)imun dari
spesies yang sama dengan antibodi sekunder.
2.+ Pr$se"ur Imun$h#st$k#m#a Pe,arnaan Tunggal &IH-!#ngle ta#n#ng(
,angkah)langkah yang harus dilakukan dalam pewarnaan tunggal adalah sebagai
berikut +
1. *elakukan depara!inasi preparat dengan /ilol I dan II, masing)masing selama 7
menit.
1. 8emudian, lakukan dehidrasi dengan etanol absolut sebanyak dua kali, dan dengan
etanol A>B dan ?>B masing)masing selama 7 menit.
4. 'reparat yang telah dilakukan dehidrasi dengan etanol selanjutnya, preparat direndam
dalam larutan phosphate bu!!er seline( '2%) sebanyak 4 kali,masing)masing selama 7
menit, setelah itu direndam dalam 1> m* bu!!er sitrat p- 9 dan dipanaskan dalam
marowa#e bersuhu tinggi selama kurang lebih A menit.
5. 'reparat dikeluarkan dari marowa#e dan didiamkan sesaat pada suhu ruangan.
7. 'reparat kemudian direndam dengan menggunakan '2% sebanyak 4 kali, masing)
masing selama 7 menit.
7
9. %isa)sisa '2% kemudian dikeringkan yang terdapat pada preparat, kemudian preparat
diletakkan dalam wadah yang telah dilapisi tissue yang disemprot dengan air agar
menjadi lembab.
?. %iapkan larutan blotto (susu skim 1B dalam aCuades), diteteskan keatas preparat
jaringan dan didiamkan selama 1 jam pada suhu ruang.
D. 'reparat kemudian diui dengan '2% sebanyak 4 kali, masing)masing selama 1>
menit.
A. 8eringkan kembali sisa)sisa '2% yang masih menempel dan siapkan antibodi primer
yang dilarutkan dalam larutan blotto dengan perbandingan 1+1>>>.
1>. 'reparat kemudian ditetesi dengan larutan antibodi primer tersebut dan diinkubasi
selama 1 jam pada suhu ruangan.
11. 8emudian preparat diui kembali dengan '2% sebanyak 4 kal, masing)masing
selama 1> menit.
11. 8eringkan kembali sisa)sisa '2% yang masih menempel pada preparat dan disiapkan
antibodi sekunder yang dilarutkan didalam larutan blotto dengan perbandingan
1+17>>.
14. 'reparat kemudian ditetesi dengan larutan antibodi sekunder tersebut dan diinkubasi
selama 1 jam pada suhu ruang.
15. 'ereparat kemudian diui menggunakan '2% sebanyak 4 kali, masing)masing
selama 1> menit.
17. 8eringkan kembali '2% yang masih menempel dan selanjutnya preparat hasil
pewarnaan I-8 siap untuk diamati.
2.. Pr$se"ur Imun$h#st$k#m#a Pe,arnaan /an"a &IH-!D$u)le ta#n#ng(
'rosedur yang dilakukan pada pewarnaan ganda adalah sebagai berikut +
8
1. %lide preparat direndam dalam /ylol I dan /ylol II, masing)masing selama 7 menit,
kemudian direndam kedalam etanol absolut selama 7 menit sebanyak 1 kali dan
dilanjutkan dengan etanol A>B dan ?>B masing)masing selama 7 menit.
1. %elanjutnya, direndam didalam '2% I,II,III, masing)masing selama 7 menit.
4. 8emudian, preparat dimasukkan kedalam 1> m* bu!!er sitrat (p- 9) dan dipanaskan
didalam mirowa#e bersuhu tinggi selama 1> menit preparat dan wadah selanjutnya
dikeluarka dari dalam mirowa#e.
5. %elanjutnya, preparat dikeluarkan dari larutan bu!!er sitrat dan ditunggu hingga
dingin.
7. 'reparat diuu menggunakan '2% I,II,III, masing)masing selama 7 menit, lalu
bloking menggunakan 1B susu skim selama 1 jam.
9. 8emudian, ui kembali dengan '2% I,II,III, masing)masing selama 7 menit.
?. %elanjutnya, tetesi dengan menggunakan !irst primary antibody (1+1>>>) dalam 1B
susu skim pada suhu ruang selama 1 jam.
D. 'reparat kemudian diui kembali dengan '2% I,II,III, masing)masing selama 1>
menit kemudian ditetesi dengan !irst seondary antibody (1+17>>) dalam 1B susu
skim selama 1 jam dalam suhu ruang tanpa ahaya.
A. 'reprat diui lagi menggunakan '2% I,II,III, masing)masing selama 1> menit dan
bloking kembali menggunakan 1B susu skim semalaman.
1>. %etelah itu, preparat diui lagi dengan '2% I,II,III, masing)masing selama 7 menit.
11. 8emudian tetesi dengan seond primary antibody (1+1>>>) dalam 1B susu skim
disuhu ruang selama 1 jam.
11. %etelah itu, preparat diui lagi dengan '2% I,II,III, masing)masing selama 1> menit.
14. 'reparat lalu ditetesi dengan seond seondary antibody (1+17>>) selama 1 jam dalam
suhu ruangan tanpa ahaya, kemudian diui kembali mengunakan '2% I,II,III
masing)masing selama 1> menit.
15. 'reparat siap untuk dibaa warnanya.
9
BAB III
-EIMPULAN
10
3.1 -es#m0ulan
Imunohistokimia merupakan suatu teknik penentuan keberadaan (lokasi) antigen
(protein target) dalam suatu jaringan ataupun sel menggunakan reksi antigen dan antibodi.
(eknikini diawali dengan penggunaan metode histoteknik yaitu dengan ara pembuatan irisan
jaringan untuk diamati. .eaksi yang terjadi pada ikatan antara antigen dan antibodi
merupakan ikatan yang kasat mata (tidak dapat dilihat dengan mata) oleh karena itu
diperlukan alat bantu untuk melihat apakah pada pengujian Imunohistokima akan terbentuk
warna yang akan membedakan ikatan yang terjadi pada antigen)antibodi yang telah dilabel.
&dapun untuk melabel pada uji Imunohistokimia ini menggunakan en$im kemudian akan
direaksikan dengan substrat kromogen (yaitu substrat yang akan menghasilkan produk akhir
yang berwarna dan tidak dapat larut) kemudia diamati menggunakan mikroskop.
11