Anda di halaman 1dari 10

LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DNA
Disusun untuk memenuhi salah satu syarat tugas mata kuliah
BIOTEKNOLOGI

Add caption



Disusun oleh :
Rachmat Abdillah (4442080913)




AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SULTAN AGENG TIRTAYASA
SERANG-BANTEN
2011












BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193).
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada
bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).
Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi
berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses
isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu
penggabungan kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu
larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari
kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH
berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan
C berfungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi
berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na
+
bermuatan positif dan DNA
bermuatan negatif. Larutan ddH
2
O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang
dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan
bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan
larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus.
Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Ciran DNA yang dihasilkan
kemudina dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA
supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni.

1.2. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah agar mahasiswa mampu mengisolasi DNA dan
memahami bagaimana cara-cara/metode mengisolasi DNA yang baik dan benar sesuai prosedur.






BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Isolasi DNA
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di
dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast.
Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA
genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal
dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah,
DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau
dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan
kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih
plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil
dibanding kromosom.

Isolasi DNA kromosom.
Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-
komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.
Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada
ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase
(yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya
ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90
o
C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi
DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi
dengan air.

Isolasi DNA plasmid
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA
plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh
lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan
penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein
dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium.
DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan
yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian
ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid
dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

2.2. Metode Isolasi DNA
CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi
protein, memisahkan karbohidrat (Kaidah dan Suprapto, 2003), merusak membran sel dan
melarutkan DNA (Purwantara, 2001). Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat
keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.
Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti
merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat
aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins dan
Smart, 1996). Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon,
disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein (Milligan, 1992). Proses pemansan pertama
bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua
bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel.
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan
mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan
DNA (Ningrum, 2008). Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA
sehingga terjadi presipitasi (Purwantara, 2001). Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh
dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun
etanol.
Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE berfungsi
untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam
buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion
Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease (Sudarsono,
1996).
Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran
tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik
kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB
juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA.
Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).
Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan
menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yang diperoleh lebih
tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil
dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada
ektraksi dengan menggunakan kit ( Ningrum, 2008). Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi
CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara
maupun lama waktu penyimpanan (Wyatt and Brown, 1996).






BAB III
BAHAN & METODE

3.1. Waktu dan Tempat
Praktikum pertama dilakukan pada :
Hari/tanggal : 06 Juli 2011
Waktu : 08.00 s/d selesai
Tempat : laboratorium Agroekoteknologi Fakultas Pertanian

Praktikum kedua dilakukan pada :
Hari/tanggal : 07 Juli 2011
Waktu : 11.00 s/d selesai
Tempat : laboratorium Agroekoteknologi Fakultas Pertanian

3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan diantaranya adalah :
Vortex
Sentrifuge
Mortal
Inkubasi

Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah
Tanaman (sampel) Trembesi
Kloroform
Aquabidest
Isoamilalkohol
Merkaptoetanol

3.3. Cara Kerja
Pilih daun yang masih muda
Timbang daun sebesar 0.25 g 0.5 g
Timbang PVPP sebanyak 0.02 g
Masukkan ke dalam mortal, kemudian haluskan daun dan PVPP
Tambahkan 10l merkaptoetanol
Tambahkan 1 ml aquabides steril
Masukkan ke dalam microtube
Vorteks selama 2 menit
Letakkan ke dalam sterofoam, kemudian inkubasi pada suhu 65
0
C selama 30 menit
Purifikasi dengan cara menambahkan 750l kloroform : isopropanol
Vorteks selama 2 menit
Sentrifugasi














BAB IV
HASIL & PEMBAHASAN

4.1. Hasil


























4.2. Pembahasan
Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap tanaman trembesi. Isolasi DNA
ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan
yang ingin digunakan dengan mengambil beberapa bagian daun trembesi yang dihancurkan
didalam mortal. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan
pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer ekstraksi. Untuk mengisolasi jaringan daun trembesi,
maka jaringan tanaman tersebut yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu




dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam
tabung diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan di atas yang
merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis.
Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid ) yang akan membentuk
kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu
dalam larutan tersebut juga terdapat larutan NaCL yang berfungsi untuk menstabilkan larutan
sehingga mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya. Untuk melisiskan
membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang terisolasi tadi, diberikan pula larutan SDS
(Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga
leukosit hancur. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada
DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang
mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB, potassium asetat, dan SDS. Senyawa CTAB dan SDS
merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Selain itu CTAB
dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuclease.
Kemudian sampel tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah
dihomogenkan warna larutan berubah menjadi merah. Sampel yang telah homogen kemudian
diinkubasikan, setelah itu diberi larutan klorofoam : isomilalkohol (24 : 1) yang berperan untuk
mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom dan dihomogenkan, setelah
homogen sampel disimpan dalam wadah berisi es. Setelah itu sampel disentrifugasi pada 11.000
g selam 10 menit. Setelah sampel disentrifugasi terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan
ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang berwarna merah. Fasa
atas yang kemudian diambil untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga
dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel tanaman dari zat-zat
lainnya. Kemudian, pada tahap berikutnya, untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan
isopropanol digunakan alkohol 100%. Pemberian alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA
dari pengotor-pengotornya. DNA dalam alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan
DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan
terakhir, disebut juga tahap presipitasi presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon,
sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon,
yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-
benang endapan DNA pada dasar tabung.














BAB V
PENUTUP

5.1. Simpulan
Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik
untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung
Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa
DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya
dicampurkan berbagai macam larutan.
Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti
merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat
aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat