Anda di halaman 1dari 11

ACARA II

ISOLASI DNA TANAMAN


A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Sel-sel tanaman seperti halnya sel-sel hewan, sel-sel tanaman
juga mengandung informasi genetik yang nantinya informasi tersebut dapat
diturunkan kepada generasi berikutnya.Informasi genetik ini dikode dalam
suatu molekul besar DNA yaitu kromosom. Pada sel tanaman ini DNAnya
dibagi menjadi DNA intrakromosomal dan ekstrakromosomal. DNA
intrkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel. Sedangkan
DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma sel.
Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan di
mitokondria dan kloroplas (Farrel 2008).
Isolasi merupakan pemisahan materi dari materi lain untuk di
identifikasi. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai
sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga,
kalus, akar batang, daging. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali
terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin,
pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak
mengandungn protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi
adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini
disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali
pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari
ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat
aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan
menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada
hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan
14
15

teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat
terpisah atau keluar dari sel.
Kemampuan mengisolasi DNA tanaman sangat diperlukan karena
sangat bermanfaat dalam kajian ilmu biologi molekuler dan ilmu lainnya.
Hal ini berkaitan dengan pemanfaatan hasil analisis dari DNA tanaman yang
dapat digunakan untuk berbagai macam hal, seperti mengetahui hubungan
kekerabatan, evolusin dan lain seabagainya. Selain itu, kemampuan dalam
mengisolasi DNA tanaman juga diperlukan dalam menentukan letak gen-gen
yang termutasi pada tanaman transgenik ataupun untuk menentukan letak
gen-gen yang mengkode sifat unggul dalam pembatan tanaman tansgenik
yang memiliki sifat unggul (Heldt 2010). Karena pentingnya mengetahui
cara mengisolasi DNA tanaman, maka praktikum tentang Iolasi DNA
Tanaman sangat perlu dilakukan.
2. Tujuan praktikum
Tujuan Praktikum acara Isolasi DNA Tanaman ini adalah:
a. Membandingkan 3 metode isolasi yang berbeda
b. Mengetahui Proses Isolasi DNA
c. Memahami fungsi tiap-tiap perlakuan
d. Mendapatkan DNA yang baik dan sesuai standar
3. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 10 Maret 2014 di
Laboratorium Bioteknologi Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Sebelas
Maret Surakarta.
B. Tinjauan Pustaka
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.
Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil
16

sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan
pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell et al 2007).
CTAB merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan membran
plasma sel dan akan membentuk komplek dengan DNA. CTAB adalah detergen
yang berkation yang akan membentuk komplek presipitasi dengan DNA ketika
konsentrasi NaCl di bawah 0,7 M. Presipitasi DNA dari buffer CTAB dengan
adanya etanol atau isopropanol sering menghasilkan massa bergelatin yang
komposisinya tidak diketahui. DNA pada umumya terlihat jelas dalam massa
tersebut, tetapi sulit untuk memisahkannya, sehingga untuk menghindari
terbentuknya massa ini digunakan presipitasi yang tidak menggunakan alcohol
(Chawla 2008).
Pemurnian DNA menurut dapat dilakukan menggunakan:
1. Enzim ribonuklease (Rnase) yang berfungsi untuk mendegradasi RNA
2. Ekstraksi phenol-chloroform, untuk menghilangkan protein
3. Pencucian menggunakan alkohol, untuk menghilangkan sisa-sisa pheno-
chloroform, garam-garaman dan kandungan ion lain
4. Sentrifuge dengan kecepatan sedang, untuk memisahkan kotoran sisa
degradasi sel.
Langkah penting selanjutnya adalah mengetahui konsentrasi DNA total yang kita
isolasi. Konsentrasi DNA dapat dilakukan menggunakan spektrofotometer pada
260 nm atau elektroforesis. Spektrofotometer kurang sensitif dan terkadang
terhalang oleh protein, sehingga elektroforesis lebih banyak digunakan.
Elektroforesis DNA merupakan proses pemisahan molekul DNA melalui pori-
pori agarose dengan bantuan arus listrik. Kecepatan pergerakannya tergantung
ukuran DNA yang dilarikan, arus listrik, dan konsentrasi gel
(Dale and Malcolm 2007).
Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) yaitu teknik
pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen
17

DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya
ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR
dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer
menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer
adalah terdiri atas 18-28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60%
(Subandiyah 2006).
Setelah tahapan presipitasi, DNA selanjutnya dipresipitasi dengan
menggunakan ethanol absolute. Penambahan larutan garam seperti amonium
asetat juga sangat membantu presipitasi DNA. Sedangkan ethanol 70% yang
ditambahkan setelah presipitasi ini dapat digunakan sebagai larutan pencuci.
DNA hasil kemudian ditambahkan dengan TE dan disimpan dalam frezer suhu -
20C (Birren et al 2007).
Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan fragmen-fragmen DNA ataupun RNA. Prinsip elektroforesis adalah
memisahkan molekul berdasarkan muatannya. DNA yang bermuatan negativ
karena adanya phosphate akan bergerak ke arah kutub positif selama
elektroforesis. Fragmen DNA mempunyai muatan negative yang sama untuk
tiap-tiap ukuran panjang, sehingga pergerakan DNA ini akan memiliki kecepatan
yang sama untuk mencapai kutub positif (Clark dan Christopher 2008).
Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen
lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi
untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk
menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al.,
2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman
dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang
kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol
perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008).
Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat
18

dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi
DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebski et al 2007).
C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja
1. Alat
a. Spektrofotometer
b. Centrifuge
c. Elektroforesis
d. Timbangan analitis
e. Water bath
f. Mortar dan pestle
g. Incubator
h. Hot plate
i. Vortex
j. Tabung Eppendorf
k. Mikropipet
l. Pinset
m. Gunting
n. Erlenmeyer
2. Bahan
a. Daun Mawar
b. Tris-EDTA
c. CTAB
d. Mercaptoetanol
e. CIAA
f. Isopropanol
g. Aquades
h. Sodium Asetat
i. Loading dye
j. Etidium Bromide
19

k. TAE/TBE
l. Etanol Chloroform
3. Cara Kerja
Cara kerja pada acara isolasi DNA tanaman ini menggunakan metode
2 dari Setiawan 2014, yaitu sebagai berikut
a. DNA genomik sampel diisolasi dengan menggunakan 50 mg daun, digerus
hingga halus, sebelumnya daun didinginkan dalam freezer terlebih dahulu
hingga beku.
b. Memanaskan buffer ekstraksi CTAB (yang sudah ditambahkan 10%
Mercaptoetanol) 800l pada suhu 65C selama 30 menit.
c. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam Waterbath selama 60
menit dan setiap 10 menit dibolak-balik.
d. Setelah 60 menit dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut
ditambahkan dengan 500l kloroform isoamil alkohol (24:1)
e. Campuran disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm.
f. Supernatan yang terbentuk diambil dengan hati-hati dan dipindahkan ke
mikrotube yang baru dan mencatat volumenya.
g. Menambahkan isopropanol 2/3 volume, kemudian di vortek hingga
tercampur rata dan menyimpan dalam freezer selama minimal 1 jam.
h. Sampel kemudian di sentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 12000
rpm.
i. Setelah disentrifugasi, buang cairan atas dan endapan DNA dicuci dengan
menambahkan etanol 70% 400l.
j. Melakukan sentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm.
k. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 25l bufer TE (10Mm
Tris-HCl pH 8,0 ; 1 Mm EDTA pH 8,0).
l. DNA disimpan pada suhu 4C.

20

D. Hasil dan Pembahasan
1. Hasil



























2a. Pemanasan Larutan Buffer
CTAB

2b. Mendinginkan daun
jeruk dengan mortar &
pastle dalam freezer selama
30 menit
Water bath

3. Memotong, Menimbang dan Menggerus
dengan larutan buffer CTAB,
memasukkan hasil ke tabung effendof
yang ditambahkan chloroform (800 nm)
dan digojog hingga homogen
Khloroforom

4. Melakukan sentrifuge pada kecepatan
12000 rpm selama 10 menit
5. Mengambil cairan lapisan atas,
kemudian dipindahkan ke tabung baru Lapisan Atas

6. Menambahkan 1/10 dari volume 2,5 Soidum asetat &
650 ul Isopropanol dingin, mencampur hingga homogen
kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 13.000 selama 5
menit
Isopropanol
dingin

Sodium Asetat

7. Membuang supernatant, kemudian mencuci pellet
dengan etanol 70% 500 ul
8. Mengeringkan pellet DNA
dengan
kering angin

Pellet

Supernatant + etanol

Ditutup dengan
tissue

21





2. Pembahasan
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan
DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama
dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut
Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses
isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan
seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk
semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan
fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan: preparasi
ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA, akan
tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah
berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida
dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga
mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease
restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan
DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian. (Zubaidah 2004).
Alat yang digunakan pada praktikum isolasi DNA yaitu sentrifuge,
mortar dan pestle, timbangan analitik, mikrotube, freezer, mikropipet.
Sentrifuge berfungsi untuk memisahkan suatu larutan dengan berat molekul
yang berbeda berdasarkan gaya sentrifugal, pada praktikum kali ini
9. Melarutkan DNA 200 ul TE, menghitung
konsetrasi DNA dengan spektrofotometer OD
kering angin

10. Menyimpan dalam suhu
rendah -20
o
C
kering angin

-20
o
C

22

sentrifuge digunakan untuk memisahkan antara supernatant dan pellet.
Mortar dan pestle digunakan untuk menghaluskan daun mawar. Timbangan
analitik digunakan untuk menimbang berat mawar hingga 0,15 gram.
Mikrotube digunakan sebagai wadah komponen yang akan diisolasi. Freezer
digunakan untuk mendinginkan daun mawar agar mudah untuk dihancurkan
sebagai pengganti nitrogen cair, dan mikropipet digunakan untuk mengambil
larutan ataupun cairan dengan ukuran mikro.
Bahan yang digunakan pada acara isolasi DNA kali ini adalah buffer
CTAB, chloroform, sodium asetat, isopropanol dingin, dan etanol 70%.
Buffer CTAB digunakan untuk melisiskan membrane sel DNA pada isolasi
DNA serta purifikasi DNA. Chloroform digunakan sebagai pendenaturasi
protein. Sodium asetat digunakan untuk mengendapkan DNA. Isopropanol
dingin digunakan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga menjadi presipitasi.
Etanol 70% digunakan untuk memurnikan DNA.
Hasil isolasi yaitu setelah dilakukan sentrifuge, larutan seharusnya
terlihat perbedaannya dan jernih. Pada hasil isolasi DNA kelompok kami,
didapatkan daun mawar. Proses sentrifuge berlangsung lebih lama dari
prosedur, karena cairan lapisan atas belum terpisah dengan lapisan bawah,
dan supernatan yang diperoleh hasilnya agak keruh. Hal ini diduga
disebabkan kurang sterilnya alat dan kesalahan praktikan dalam melakukan
proses isolasi sehingga pengotor ikut masuk ke dalam mikrotube.
A. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh dari acara isolasi DNA tanaman ini adalah :
a. Perbedaan dari ketiga metode isolasi DNA yang ada adalah berbagai
pereaksi dan buffernya.
b. Proses isolasi DNA dimulai dari menimbang bahan dengan berat tertentu
hingga didapatkan pellet melalui beberapa tahapan.
23

c. Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan padatan dan cairan dengan berat
tertentu.
2. Saran
Saran untuk praktikum acara isolasi DNA tanaman ini berjalannya sudah
cukup baik, namun untuk ketepatan waktu dirasa masih kurang sehingga untuk
praktikum kedepan diharapkan praktikum yang dilaksanakan tepat pada
waktunya.






















24

DAFTAR PUSTAKA
Birren,B.; E.D. Green; S. Klapholz; R.M. Myers;J. Roskams. 2007. Genome
Analysis. A Laboratory manual. Volume 1. Cold Spring Harbour Laboratory
Press.New York. Halaman 621
Chawla, H. S. 2008. Plant Biotechnology : A Practical Approach. Science Publishers,
Inc. Plymouth.
Clark, W. dan K. Christopher. 2008. An Introduction to DNA : Spechtrophotometry,
Degradation, and the Frangekel Eksperimen http://www. zoo. utoronto. ca/
able/ volumes/ vol-22/5-clark. pdf. Tanggal akses 20 Oktober 2007.
Farrel, R.E. 2008. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and
Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal. 693-
705
Heldt, H. W. 2010. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press.
California. 491
Lodhi MA, Ye GN, Weeden NF, Reisch BI (2004). A simple and efficient method for
DNA extraction from grapevine cultivars and vitis species. Plant Mol. Biol.
Rep. 12(1): 6-13.
Moyo M., Amoo S.O., Bairu M.W., Finnie J.F., Van Staden J. 2008. Optimising
DNA isolation for medicinal plants. South African Journal of Botany 74, 771
775.
Porebski S, Bailey LG and Baum BR (2007) Modification of a CTAB DNA
extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol
components. Plant Mol Biol Reptr 15: 815.
Ranjan M, Mukerjee A, Luchowski R 2010. Enhanced Fluorescence of curcumin on
plasmonic platforms. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11:223-228
Subandiyah, S. 2006. Polumerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi
Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan
Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. Hlm.43-50