Anda di halaman 1dari 10

ANALISIS PCR dan ELEKTROFORESIS

Laporan Praktikum Bioteknologi Tanaman


Oleh:
Ran pra!onggo """#"$%$"$&'
()R)SAN BIOLO*I
FAK)LTAS +ATE+ATIKA ,AN IL+) PEN*ETA-)AN ALA+
)NI.ERSITAS (E+BER
/$"%
BAB 1. PENDAHULUAN
"0" Latar Belakang
PCR adalah penggandaan pada tingkat DNA secara berulang kali dengan
metde dan cara tertentu. Prses tersebut mirip dengan prses replikasi DNA
secara in !i! "ang bersi#at semi knser!ati#.
Elektr#resis adalah teknik "ang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makrmlekul khususn"a prtein dan asam nukleat
berdasarkan ukurann"a. Elektr#resis merupakan metde "ang paling ban"ak
dipakai saat ini dalam percbaan bikimia dan bilgi mlekuler.
PCR dan elektr#resis merupakan teknik biteknlgi untuk mengetahui
keberhasilan trans#rmasi genetik pada tanaman "ang sudah diislasi sebelumn"a.
Dan mengetahuin"a dengan cara melakukan PCR dan elektr#resis$ selan%utn"a
di!isualisasikan pada U& transiluminatr.
"0/ Tu!uan
Untuk mengetahui keberhasilan trans#rmasi genetik pada tanaman
BAB '. (E)*DE
/0" Alat dan Bahan
1+ Alat
, (esin PCR
, U& iluminatr
, Cetakan gel
, Eppendr#
, (icr-a!e
, (icrpipet dan (icrtip
'+ Bahan
, DNA tanaman transgenik .kntrl psiti#+
, DNA tanaman nn transgenik .kntrl negati#+
, Agarse 1/
, )BE 10
, EtBr .Ethidium Brmide+
, (arker
, PCR kmpsisi
1mpsisi &lume
(aster (i0 12 3l
45 npt 44 1 3l
4R npt 44 1 3l
ddH
'
* 6 3l
DNA .hasil islasi+ 1 3l
/0/ Skema Ker!a
'.'.1 PCR
PCR kmpsisi
, Dimasukkan dalam mesin PCR dengan prgram7
Predenaturasi 89
2
C$ ' menit
Denaturasi 89
2
C$ :2 detik
Annealing ;2
2
C$ '2 detik
E0tentin 6'
2
C$ 1 menit
5inal E0tentin 6'
2
C$ < menit
=ak 1;
2
C$ < menit
, Diulang sampai seban"ak :< siklus dengan ttal -aktu 1 %am 92
menit
Hasil
'.'.' Elektr#resis
Agarse 1/ 2$'< gram
, Ditambah larutan )BE 10 seban"ak '< ml
, Dipanaskan di dalam micr-a!e$ sampai agarse terlarut dalam
)BE$ > selama 1 menit
, Ditambahkan EtBr 1$< 3l pada larutan$ diratakan
, Dituang larutan gel pada cetakan
, Ditunggu hingga gel padat > :2,;2 menit
, Dimasukkan pada kntainer elektr#resis
, Diisi dengan )BE 10 sampai gel terendam semua
, Dimasukkan DNA pada sumuran,sumuran gel dengan urutan7 1
marker$ ' kntrl psiti# dan : kntrl negati#
, Dirunning dengan tegangan ?2,122 &lt > 1 %am
, Di!isualisasi dengan U& transiluminatr pada pan%ang gelmbang
'?2 nm
, Dilihat hasiln"a .ada tidakn"a gen target "ang diamati+
Hasil
BAB :. HA=4L DAN PE(BAHA=AN
&0" -a1il
1eterangan7
1. (arker
'. 1ntrl Psiti# .terbentuk : pita DNA dengan ukuran > 6<2 bp$ > <<2 bp dan >
'<2 bp+
:. 1ntrl Negati# .tidak terbentuk pita DNA+
&0/ Pem2aha1an
)eknik bilgi mlekuler telah memberikan peluang untuk
mengembangkan dan mengidenti#ikasi peta genetik dari suatu kulti!ar tanaman.
Pendekatan genetika mlekuler dengan menggunakan penanda DNA telah
berhasil membentuk penanda mlekuler "ang mampu dalam mendeteksi gen dan
si#at,si#at tertentu$ e!aluasi keragaman dan e!lusi pada tingkat genetik .Hn,
Lim et al. 1888+. Deoxyribonucleic acid .DNA+ merupakan sen"a-a kimia "ang
paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan sen"a-a "ang
mengandung in#rmasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi
a
b c
selan%utn"a. 1eseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genm. @enm
meliputi bagian gen "ang #ungsinal maupun nn,#ungsinal dalam sel
rganisme. DNA genm meliputi gen danintergen .=ur"$ '229+.
Pada praktikum kali ini dilaksanakan metde PCR untuk meganalisa sel
transgen. PCR adalah singkatan dari Pl"merase Chain Reactin. )eknik ini
merupakan teknik perban"akan DNA secara in !itr. )eknik ini memungkinkan
adan"a ampli#ikasi antara dua regin DNA "ang diketahui$ han"a di dalam tabung
reaksi$ tanpa perlu memasukkann"a ke dalam sel .in!i!+. Dalam s"stem
ker%an"a$ PCR dilandasi leh struktur DNA. Dalam keadaan nati!en"a$ DNA
merupakan dubleheli0 $"ang terdiri dari dua buah pita "ang berpasangan anti
parallel antara satu dengan "ang lain dan berikatan dengan ikatan hidrgen. 4katan
h"drgen terbentuk antara basa,basa "ang kmplementer$ "aitu antara basa
Adenin.A+ dengan )h"mine .)+$ dan @uanine.@+ dengan C"tsin.C+. Basa,basa
itu terikat dengan mlekul gula$ deksiribsa$ dan setiap satu mlekul gula
berikatan dengan mlekul gula melalui ikatan #s#at .Restu dan @usmiat". '21'+.
Prgram PCR terdiri dari a-al denaturasi .pre,denaturasi+ pada suhu 89

C
selama ' menit dilan%utkan dengan prses denaturasi "ang dilakukan pada suhu
89

selama '2 detik. Pada tahap ini ikatan h"drgen DNA terputus .denaturasi+
dan DNA men%adi berbekas tunggal. Biasan"a pada tahap a-al PCR tahap ini
dilakukan agak lama untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan
ini men"ebabkan DNA tidak stabil dan siap men%adi templat .patkan+ bagi
primer. =etelah prses denaturasi selesai$ dilan%utkan dengan prses annealing
"ang dilakukan pada suhu <8C selama 12 detik. Pada tahap ini$ primer
menempel pada bagian DNA template "ang kmplementer urutan basan"a.
Penempelan ini bersi#at spesi#ik. =uhu "ang tidak tepat men"ebabkan tidak
ter%adin"a penempelan atau primer menempel di sembarang tempat.
Prses selan%utn"a adalah peman%angan atau extention dilakukan pada
suhu 6'

C selama <2 detik. =uhu untuk prses ini tergantung dari %enis DNA
pl"merase "ang dipakai. Dengan )aA,Plimerase$ prses ini biasan"a dilakukan
pada suhu 6; C. durasi tahap ini biasan"a 1 menit. (elting temperature .)m+
primer dapat dikalkulasikan dari primer "ang digunakan dengan menggunakan
beberapa persamaan$ %ika mungkin ketika mendesain sepasang primer haruslah
memiliki )m "ang sama .Rahma-ati$ et.al.$ '211+.
=elain DNA template "ang akan digandakan dan enBim DNA pl"merase$
kmpnen lain "ang dibutuhkan adalah7 Primer$ "aitu sepasang DNA utas tunggal
atau lignukletida pendek "ang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi
peman%angan rantai atau plimerisasi DNA. PCR han"a mampu menggandakan
DNA pada daerah tertentu sepan%ang maksimum 12222 bp sa%a$ dan dengan
teknik tertentu bisa sampai 92222 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen
"ang kmplemen dengan DNA template$ %adi dirancang agar menempel mengapit
daerah tertentu "ang kita inginkan .Restu dan @usmiat"$ '21'+. Primer "ang
digunakan kali ini adalah hpt 44 .h"grm"cin phsphtrans#erase 44+. Hpt 44 %uga
penun%uk atau penanda untuk gen "ang mengkde h"grm"cin
phsphtrans#erase .HP)+$ "ang mendetksi#ikasi h"grm"cin antibitic
aminc"clitl.
Prduk PCR di!eri#ikasi dengan elektr#resis menggunakan gel agarse.
Pembuatan gel agarse terdiri dari 1/ agarse dengan knsentrasi 2$< gr$ :3l
EtBr$ dan <2 3l bu##er )BE. Hasil elektr#resis diamati dan didkumentasi di
atas U& illuminatr.
=ebelum dilakukan elektr#resis$ suspensi DNA terlebih dahulu harus
ditambahkan lading d"e "ang ber#ungsi untuk 7 1+ menambah densitas sehingga
DNA akan selalu berada di dasar sumur$ '+ pe-arna untuk memudahkan
meletakkan sampel DNA ke dalam sumur$ :+ agar dapat bergerak ke arah anda
dengan la%u "ang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda
migrasi DNA .=urB"cki$ '222+.
Eletr#resis %uga menggunakan gel agarse "ang mempun"ai kemampuan
pemisahan dengan range "ang cukup luas. Penggunaan gel agarse mempun"ai
keuntungan$ dimana lkasi dari DNA dalam gel dapat diamati secara in situ
dengan menggunakan etidium brmida sebagai pe-arna. Etidium brmida
nantin"a akan berikatan dengan basa dari mlekul DNA dan memberikan -arna
ran"e #lursens diba-ah lampu U&. Hasil pen"inaran diba-ah lampu U& dapat
berupa ptngan pita,pita DNA "ang mempun"ai #ragmen,#ragmen. =ebelum
memadat$ pada u%ung gel dibuat lubang,lubang dengan menggunakan lembaran
perspe0 "ang tipis dan men"erupai sisir. Dengan demikian$ pada -aktu gel
memadat dan sisirn"a diambil akan terbentuk lubang kecil tempat DNA.
Hasil menun%ukkan tidak munculn"a pita DNA pada kntrl negati#$ dan
sebalikn"a pada DNA kntrl psiti#. Cumlah pita DNA "ang dihasilkan
merepresentasikan %umlah salinan gen "ang ada di dalam genm. DNA kntrl
psiti# merupakan penanda bah-a secara genetik telah mengalami trans#rmasi.
=edangakan pita DNA kntrl negati# tidak terbentuk karena memang tidak
dilakukan prses trans#rmasi pada DNA kntrl negati# .Prebski et al, 1886+.
BAB 9. PENU)UP
Ke1impulan
Dari pembahasan diatas dapat disimpulkan bah-a dalah pada prinsipn"a
analisis PCR merupakan perban"akan dan sintesis DNA secara in !itr dalam
mesin PCR "ang mana suhu dan prsedurn"a telah diatur sedemikian rupa.
)ahapan,tahapan PCR meliputi predenaturasi .89

C+$ denaturasi .89

C+$
Annealing .<8

C+$ E0tentin .6'

C+$ dan 5inal ekstentin .6:

C+.
,a3tar Pu1taka
Hn,Lim =$ Peng )eng PC$ Lee DH$ and @h CC. 1888. RAPD anal"sis # sme
species in the genus !anda .rchidaceae+. Annuals of Botany. 83:193-196.
Prebski$ =.$ Baile"$ L.@.$ and Baum$ B.R. 1886. (di#icatin # C)AB DNA
e0tractins prtcl #r plants ctaining high pl"sacharide and pl"phenl
cmpnents. Plant Molec Biol reporter 15: 8-15
Rahma-ati$ ="amsidah$ Agus Rachmat$ D-i Astuti$ dan =ri 4ndra"ani. '211.
Pengembangan Padi )leran 1ekeringan (elalui *!erekspresi 5aktr
)ranskripsi OsHox; dan Prmtr )erinduksi 1ekeringan OsLEA:. Laporan
Teknik Pusat Penelitian Bioteknoloi L!P!:"#-35
Restu$ (uhammad (ukrimin dan @usmiat". '21'. *ptimalisasi )eknik Ekstraksi
dan 4slasi DNA )anaman =uren .Toona Sureni (err.+ untuk Analisis
1eragaman @enetik berdasarkanRandom Amplified olymorp!ic DNA
.RAPD+. !n$onesian %ournal of Aricultural Biotec&noloi 1": 1-1'
=ur". 188<. (enetika. Dg"akarta 7 @a%ahmada Uni!ersit" Press
=urB"cki$ =. '222. Basic Tec&ni)ues in Molecular Bioloy. Ne- Drk7 =pringer,
&erlag