Anda di halaman 1dari 9

Karakterisasi dan pengaruh berbagai variasi senyawa terhadap aktivitas enzim

katalase pada kentang



1. Tujuan :

Mengetahui aktivitas enzim katalase pada kentang
Mengetahui pengaruh variasi senyawa terhadap aktivitas enzim katalase pada kentang
2. Latar Belakang

Enzim merupakan protein yang memilki sifat katalitik yang sangat tinggi. Enzim dapat
mempercepat reaksi namun tidak mempengaruhi kesetimbangan akhir. enzim bekerja hanya
pada satu macam reaksi dan sangat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, pH, suhu, dan
kofaktor. Enzim Katalase adalah enzim yang terdapat di dalam hampir semua sel hidup, dapat
mengkatalase penguraian H
2
O
2
menjadi air dan oksigen. Kentang merupakan salah satu
tanaman yang memiliki enzim katalase yang terdapat di dalam sel peroksisomnya.
Penelitian ini menggunakan bahan dasar kentang karena kentang mudah didapat dan
memiliki sel peroksisom dalam jumlah besar yang terdapat dalam daging buahnya. Enzim
katalase merupakan enzim yang tahan panas, karena sifat tersebut maka katalase digunakan
sebagai indikator untuk mengetahui aktivitas enzimnya dalam kentang melalui berbagai
perlakuan.

3. Tinjauan Pustaka

2.1. Enzim
Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator dalam reaksi pemecahan dan
pembentukan (metabolisme) suatu zat yang terjadi didalam sel jaringan. Enzim dihasilkan
oleh sel hidup (eukariotik dan prokariotik) dan berfungsi sebagai katalis biologi yang
spesifik, namun aktifitasnya dipengaruhi oleh kondisi fisik dan kimia. Seluruh reaksi kimia
yang berlangsung di dalam sel memerlukan jasa enzim. Enzim disintesis di dalam sel, tetapi
aktivitasnya tidak selalu di dalam sel. Berbagai reaksi kimia yang dikendalikan oleh enzim,
antara lain respirasi, pertumbuhan, kontraksi otot, fotosintesis, pencernaan, fiksasi nitrogen,
dan pembentukan urine.
Enzim mempunyai sifat sifat :
1. Enzim berfungsi sebagai katalisator, artinya sebagai zat yang mampu mempercepat reaksi
kimia, tetapi enzim tidak ikut bereaksi.Denagn demikian enzim tidak diperlukan dalam
jumlah yang banyak.
2. Enzim adalah suatu protein, ini terbukti karena enzim di dalam larutan membentuk suatu
koloid.
3. Kerja enzim bersifat khusus/khas, artinya bahwa enzim tidak dapat bekerja pada semua
zat
4. Enzim tidak tahan panas, Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu lingkungan dalam
sel.Kebanyakan enzim akan aktif pada kisaran suhu tertentu.
Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim:
1. Suhu, pada suhu 0
o
C (minimum) enzim non aktif tapi tidak rusak. Jika suhu dinaikkan
enzim akan aktif dan bekerja optimum pada suhu 30 40C. Pada suhu 60C enzim
mengalami denaturasi (rusak pada bagian sisi aktifnya dan tidak bisa balik) sehingga tidak
bisa mengikat substrat.
2. pH, pH optimum pada masing masing enzim bervariasi. Khusus enzim katalase pH
optimum 7 7,2 (sedikit basa). Perubahan pH menyebabkan sisi aktif enzim berubah
sehingga tidak sesuai dengan substratnya.
3. Konsentrasi enzim, konsentrasi enzim setara dengan kecepatan reaksi (jika konsentrasi
enzim ditambah maka reaksinya pun semakin cepat berlangsung)
4. Zat penggiat (aktivator), berfungsi untuk memacu / menggiatkan kerja enzim sehingga
bekerja lebih cepat (kofaktor : ion logam, koenzim : vitamin B kompleks)
5. Zat penghambat (inhibitor), pada dasarnya ada 2 macam berdasarkan sifatnya, yaitu :
Reversibel (bisa kembali ke bentuk semula dengan memperbanyak substrat, misalnya
kompetitif [inhibitor mirip substrat], non kompetitif [sisi aktif rusak]), Irreversibel (sisi aktif
enzim mengikat kuat inhibitor dan tidak dapat balik)
6. Konsentrasi substrat, jika konsentrasi substrat ditambah maka kecepatan reaksi pun
semakin lambat (Yulia,2009:1)
2.2. Enzim Katalase
Pada tahun 1818 Thenart penemu hydrogen peroksida H2O2 menyatakan bahwa
H2O2 dapat diuraikan oleh suatu enzim. Hal ini dibuktikan oleh Jacobson pada tahun 1892 .
Dan pada tahun 1901 lowie menamai enzim ini sebagai katalase. Sebagian besar enzim
bekerja di dalam sel, yang disebut enzim intraseluler. Salah satu contoh enzim intraseluler
adalah enzim katalase. Katalase memecah senyawa berbahaya, seperti Hydrogen peroksida
(H2O2) di dalam sel hati. Dalam hal ini Hydrogen peroksida bertindak sebagai substrat.
Hydrogen peroksida merupakan senyawa reaktif dan dapat merusak sel, kemudian akan
didegrasi oleh katalase. Katalase mendegrasi Hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O)
dan oksigen (O2).
Berdasarkan mekanisme kinerja dan aktivitas yang diketahui, mayoritas enzim
komersial adalah hidrolase( termasuk protease,karbohidrolase,esterase ) dan oksidoreduktase.
Salah satu klasifikasi enzim yang sering dipelajari adalah osidoreduktase yang di dalamnya
termasuk katalase. Katalase merupakan protein dengan gugus prostetik berupa empat gugus
protohemin terkonjugasi (ferriheme/Fe3+-Protohemin IX) yaitu heme b atau heme d.
Molekul katalase berupa tetramer yang tersusun atas empat sub unit identik (monomer) yang
masing-masing memiliki sebuah gugus protohemin (hemoprotein) pada sisi katalitiknya
(Balasubramanian 1987:1).

Struktur Heme b Struktur Heme d
cishydroxychlorin spirolactone

Gambar 1. Struktur heme b dan heme d
Keempat ikatan koordinasi enam VI dari besi dalam protohemin berinteraksi dengan keempat
nitrogen cincin pirol (atom atomnitogen porifirin, A, B, C, D).
Haem iron coordination Haem iron coordination Haem iron coordination


Pentacoordinate Hexacoordinate Hexacoordinate
Gambar 2. Struktur heme Fe koordinasi ((Murshudov,1996:1).
Hidrogen peroksida merupakan salah satu zat sisa hasil sampingan dari metabolisme
tubuh, baik manusia, hewan maupun tumbuhan. Apabila hidrogen peroksida tidak diuraikan,
maka akan terjadi kematian sel secara massal. Enzim katalase mampu memecah ikatan
hidrogen peroksida, menjadi dua zat yang tidak berbahaya, yaitu hidrogen (H2) dan air
(H2O). Meskipun demikian, karena enzim katalase mempunyai mayoritas bahan dasar berupa
protein, maka sifat-sifat protein juga masih melekat erat di dalam enzim katalase. Salah satu
sifat enzim adalah termolabil, atau rentan rusak jika suhu lingkungan terlalu panas. Enzim
akan mengalami denaturasi, sehingga tidak bisa melakukan fungsinya. Demikian pula dengan
enzim katalase, jika suhu lingkungan terlalu panas, maka enzim ini tidak akan mampu
bekerja optimal. Enzim katalase dapat bekerja pada rentan keasaman (pH) yang sempit.
Enzim katalase bekerja maksimum pada pH netral (pH 7). Ketika kondisi keasaman bergeser
menjadi sedikit asam (pH < 7) ataupun sedikit basa (pH > 7), maka kapasitas enzim katalase
untuk menguraikan H2O2 akan semakin berkurang. Malah menurut beberapa literatur, pada
pH tertentu enzim katalase akan sama sekali tidak mampu bekerja.
Selain pH, juga masih ada beberapa faktor lain yang dapat mempengaruhi kerja enzim
katalase. Faktor-faktor tersebut di antaranya suhu, konsentrasi (banyaknya) substrat,
konsentrasi (banyaknya) enzim, keberadaan aktivator (pemicu enzim untuk bekerja lebih
cepat) serta adanya inhibitor (penghambat kerja enzim). Mengingat begitu sempitnya rentang
kerja enzim katalase, maka menjaga kondisi tubuh supaya tetap sehat sangatlah penting,
sehingga semua enzim di dalam tubuh kita dapat bekerja dengan optimal (Anne ahira,2010:1)
Katalase dinilai memiliki potensial komersial yang menarik karena spesifitasnya yang
tinggi terhadap substratnya (H
2
O
2
) dan produk reaksinya yang sangat aman (H
2
O dan O
2
),
diantaranya sebagai scavenger dan enzim antioksidan dalam jaringan suatu organisme.
Katalase juga sering digunakan sebagai biomaterial risety pada berbagai disiplin ilmu
biokimia molekuler. Katalase merupakan komponen sistem protektan dan antioksidan
endogen terpenting dalam jaringan tanaman, terutama pada kentang yang mengandung 2 %
protein dan memiliki suseptibilitas (rangsangan) cukup tinggi terhadap gangguan fisiologis.
Enzim katalase pada kentang terletak pada dagingnya karena dalam daging kentang
terdapat sel peroksisom yang dapat menghasilkan enzim katalase. Kentang yang memiliki
banyak enzim katalase adalah kentang yang belum tumbuh tunasnya Selain itu katalase dapat
dijadikan indikator terjadinya proses pematangan pada buah atau browning. Senyawa volatile
yang dihasilkan merupakan proses browning enzimatis dan non enzimatis. Browning
enzimatis tersebut diakibatkan oleh adanya aktifitas berbagai enzim, salah satunya enzim
katalase (Anonim,2010:1)
Katalase adalah enzim yang mengkatalisis dekomposisi hidrogen peroksida (H
2
O
2
)
selain peroksidase dan glutation peroksidase. Produk reaksi dekomposisi oleh katalase adalah
molekul air (H
2
O) dan oksigen (O
2
). Hidrogen peroksida sebagai substrat merupakan salah
satu metabolit atau spesi oksigen reaktif yang bersifat sitotoksik dan sebagai inhibitor
beberapa enzim (Anonim,2010:1).
Mekanisme pembentukan enzim katalase untuk memecah H
2
O
2
yaitu saat melakukan
respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H
2
O
2
. Bakteri yang
memiliki kemampuan memecah H
2
O
2
dengan enzim katalase maka segera membentuk suatu
sistem pertahanan dari toksik H
2
O
2
yang dihasilkannya sendiri. Bakteri katalase positif akan
memecah H
2
O
2
menjadi H
2
O dan O
2
dimana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas
katalase tersebut adalah adanya gelembung-gelembung oksigen seperti pada percobaan yang
telah dilakukan. Dengan enzim katalase, H
2
O
2
diurai dengan reaksi sebagai berikut:
2H
2
O
2
--> 2H
2
O + O
2

- Siklus terjadinya reaksi enzim katalase

Pada siklus reaksi katalase diatas yang bereaksi dengan molekul dari peroksida untuk
membentuk campuran intermediate/antara dari suatu kation porfirin radikal berisi FeIV.
Berikutnya, oksidasi dari suatu donor elektron mengembalikan campuran siklus reaksi dari
katalase-katalase mulai dengan highspin ferric (FeIII) pada kondisi awal (Simon,2008:1).
- Sifat-Sifat Enzim Katalase
Aktivitas katalitik katalase memiliki dua jenis reaksi yaitu secara katalitik dan
peroksidatik yang mendekomposisi hydrogen peroksida dan hidroperoksida
Katalitik : H
2
O
2
+ H
2
O
2
2 H
2
O + O
2

Peroksidatik : H
2
O
2
+ 2 AH
2
2 H
2
O + HAAH (suatu produk terpolimerisasi).
Katalase memiliki berat molekul berkisar antara 53.000-65.000 Da. Molekul katalase
memiliki lebih dari 500 residu asam amino tiap rantai protoprofirinnya. Katalase aktif pada
kisaran pH 2-12 dan optimum pada pH 5,0 9,0. Katalase tidak stabil terhadap panas dengan
temperatur optimum berkisar 0 55C, sehingga katalase akan kehilangan aktifitasnya
dengan cepat pada 35C dan akan rusak pada 65C. Katalase akan mengalami denaturasi
dingin bila dibiarkan pada temperatur rendah bukan beku atau chilling. Katalase merupakan
enzim oksidoreduktase (Wikipedia,2010:1).
2.3 Ekstraksi dan Fraksinasi Enzim
Ektraksi merupakan salah satu metode pemisahan kimia. Pada percobaan ini ektraksi
dilakukan dengan cara penyaringan. Penyaringan merupakan pemisahan endapan dari larutan
induknya, tujuannya adalah agar endapan dan medium penyaring secara kuantitatif bebas
dari larutan. Media yang digunakan untuk penyaringan adalah :
1. Kertas saring
2. Penyaring asbes murni (krus gooch) atau platinum ( krus munroe)
3. Lempeng berpori yang terbuat dari kaca bertahanan, silika atau porselen
(Vogel,1994:).
Fraksinasi adalah presipitasi ekstrak kasar dengan konsentrasi bertingkat dari garam
atau pelarut organik jenuh
.
Metode ini dilakukan secara bertahap atau step by step agar
didapatkan zat fraksi fraksi enzim yang lebih murni. Metode ini dapat menggunakan garam
(NH
4
)
2
SO
4,
presipitasi dengan (NH
4
)
2
SO
4
didasarkan pada kecenderungan protein untuk
memebentuk agregat dan mengendap dalam larutan akibat adanya garam berkonsentrasi
tinggi (salting out).(NH
4
)
2
SO
4
lebih dipilih sebagai garam yang digunakan karena memiliki
kelarutan dan daya pengendapan yang tinggi, memiliki panas pelarutan yang rendah dan
fleksibilitas pH , serta tidak akan mempengaruhi bentuk dan fungsi enzim (Winarno.1995).
Selain itu, metode pemisahan dalam fraksinasi biasa dilakukan dengan sentrifugasi
untuk memurnikan suatu senyawa. Sentifugasi merupakan tahap pertama dalam fraksinasi,
memisahkan organel berdasarkan ukuran dan densitasnya. Prinsip sentrifugasi ialah bahwa
untuk memperoleh organel yang besar, diperlukan kecepatan sentrifugasi yang rendah, dan
sebaliknya (Anonim,2010:1)
Enzim dapat diisolasi (difraksinasi) berdasarkan informasi tentang lokasi enzim
tersebut di dalam sel. Enzim ekstraseluler (Eksoenzim) lebih mudah diisolasi karena dapat
diperoeh tanpa pemecahan sel, sedangkan enzim intraseluler (Endoenzim) diisolasi dengan
memecah dinding sel dan organel di dalam sel secara kimia maupun fisika. Sebagai
makromolekul yang memiliki ukuran, bentuk dan muatan tertentu, maka enzim dapat
dipisahkan atau dimurnikan terhadap campuran enzim yang ada. Berbagai cara dapat
dilakukan diantaranya adalah melalui presipitasi, dialysis, adsorpsi, pertukaran ion, filtrasi
dalam gel, ultrafiltrasi, pengikatan berdasarkan afinitas dan hidrofobisitas diisolasi dari sel
organisme melalui pemecahan dinding sel, membran sel, dan organel. Pada percobaan ini
dilakukan menggunakan metode Fisika Mekanik yaitu dengan diblender. Katalase merupakan
enzim intraselular (Endoenzim) sehingga dapat diisolasi dari sel organisme melalui
pemecahan dinding sel, membran sel, dan organel. Pada percobaan ini dilakukan
menggunakan metode Fisika Mekanik yaitu dengan diblender (Whitaker,1994:1).






4. Metodologi Percobaan
4.1 Alat dan Bahan
4.1.1 Alat
1. Blender
2. Sentrifugasi
3. Tabung reaksi
4. Beaker glass (100 mL)
5. Pipet tetes
6. Botol
7. Gelas ukur (50 mL dan 10 mL)
8. Labu ukur (10 mL)
9. Corong
10. Kertas saring
11. Termometer
12. pH-meter
13. Neraca Analitik

4.1.2 Bahan

1. Kentang
2. Hidrogen Peroksida
3. Asam Askorbat
4. KCN
5. Asam Sitrat
6. NaCl
7. Bovine Serum Albumin (BSA)
8. Natrium fosfat (

) (0,05M)
4.2 Prosedur Kerja
1. Ekstraksi
Sebanyak 15 gram kentang dikupas dan potong kecil-kecil. Kemudian sampel
ditambahkan dengan 10 mL buffer Natrium Fosfat dengan konsentrasi 50 mM dengan pH 7,
dan 0,5 gram asam askorbat. Campuran diatas dihomogenkan dengan cara blender. Setelah
campuran diblender, didiamkan selama kurang lebih 5 jam pada suhu 4
0
C agar dihasilkan
enzim yang maksimal. Kemudian saring dan ambil filtratnya untuk dilakukan sentrifugasi.
Lamanya proses sentrifugasi ini adalah selama 30 menit dan kemudian ambil bagian
supernatannya untuk kemudian dilakukan pengujian lebih lanjut.
2. Penentuan Protein
Supernatan yang diperoleh dari prosedur sebelumnya kemudian dilakukan pengujian
kadar protein dengan menggunakan bovine serum albumin sebagai pengujinya.
3. Penentuan Enzim
Aktivitas enzim ditentukan pada suhu 25
0
C. Campuran reaksi yang berisi 30 mM
H2O2 pada 50 mM buffer natrium fosfat pH 7,0 dan 0,1 mL enzim pada volume total 3 mL.
Aktivitas enzim diperkirakan dengan penurunan absorbansi H2O2 pada 240 nm
4. Melihat pengaruh pH, suhu dan inhibitor
Pengaruh pH
Pengaruh pH pada aktifitas CAT pada kentang perbedaan nilai pH (pH 3-9). pH optimum
dari CAT pada kentang ditentukan
Pengaruh Suhu
Pengaruh suhu pada aktifitas CAT pada kentang perbedaan suhu (pH 20-80). suhu
optimum dari CAT pada kentang ditentukan
Pengaruh Inhibitor
Pengaruh inhibitor KCN, asam sitrat, dan CuSO4