Mata Kuliah : Pengembangan Metode Transformasi In Planta pada

Berbagai Tanaman dan Analisa Kejadian Gene Targeting

pada Buckwheat (Fagopyrum esculentum)
Pokok Bahasan : Pengembangan metode transformasi in planta !ang
sederhana dan efisient pada padi dengan bantuan
Agrobacterium tumefaciens
"ub Pokok Bahasan : #$ Pendahuluan
# Bahan dan Metode
2.2.1 Strain A.tumefaciens dan binary vector
2.2.2 Transformasi
2.2.3 Deteksi A.tumefaciens pada tanaman tertransformasi
2.2.4 Sampling bii padi transformant
2.2.! "enentuan keta#anan ter#adap #ygromycin pada
transformant
2.2.$ %i #istokimia ter#adap aktifitas &glucuronidase
'(%S)
2.2.* +engisolasi D,A tanaman
2.2.- Analisa "./
2.2.0 "lasmid rescue
#% &asil dan Pembahasan
2.3.1 Transformasi dengan bantuan mutan A.tumefaciens
strain +&21
2.3.2 Deteksi A.tumefaciens yang digunakan dalam
transformasi pada transformant
2.3.3 Deteksi transgen dengan "./ pada transformant yang
ditransformasi dengan strain mutan +&21
2.3.4 Transformasi dengan strain 12A4434 yang
mengandung binari vektor p4(121&5m
2.3.! /escue dan Analisis ter#adap plasmid dari transformant
yang ditransformasi dengan strain 12A4434
mengandung binari vektor p24&res
T'K (
- +a#asis6a mema#ami tentang metode transformasi in planta pada tanaman padi
)aktu ( * +,menit
#$ Pendahuluan
Seak terobosan yang dilakukan ole# 5iei dan kelompok risetnya dia6al ta#un
1003an7 metode transformasi dengan bantuan A.tumefaciens pada padi tela#
berkembang pesat dan tela# menadi metode rutin diberbagai laboratorium di dunia.
1&!

"ada dasarnya metode ini sama dengan metode yang umum dilakukan pada tanaman
dikotil. "ertama&tama A.tumefaciens diinokulasikan pada aringan sel yang mengandung
sel&sel embryonic yang sedang aktif membela# seperti misalnya kalus dalam system
kultur aringan. 8emudian A.tumefaciens di#ilangkan dengan antibiotika dan sel&sel
yang tertransformasi diseleksi dengan media mengandung antibiotika. Terak#ir tanaman
ditumbu#kan dengan media yang sesuai. 9alaupun tela# digunakan secara luas metode
ini memiliki seumla# kelema#an yaitu memerlukan kondisi yang steril7 memakan
banyak 6aktu7 sering teradi variasi somaklonal saat penumbu#an secara in vitro dan
tidak semua tanaman dapat diregenerasi dengan metode ini.
Disisi lain transformasi in planta dapat mengatasi kelema#an&kelema#an tersebut.
$

2erbeda dengan metode transformasi diatas7 transformasi in planta tidak memerlukan
kultur secara in vitro yang mana #al ini merupakan suatu kelebi#annya. Seau# yang
kami keta#ui7 belum perna# ada dilaporkan sebelumnya metode transformasi in planta
pada padi.
Sebelumnya di laboratorium kami tela# dikembangkan metode transformasi in planta
yang seder#ana dan efisien pada tanaman buck6#eat 'Fagopyrum esculentum +.)7
mulberry 'Morus alba 1.) dan kenaf 'Hibiscus cannabinus 1.).
*&0
9alaupun ketiga
metode tersebut memiliki kemiripan7 beberapa modifikasi diperlukan agar sesuai
dengan keadaan dan enis tanamannya. %ntuk buck6#eat7 apical meristem pada bibit
tanaman diinokulasi dengan A.tumefaciens7 sedangkan untuk mulberry dipili# meristem
pada a:illary buds dari tanaman muda. %ntuk kenaf baik apical meristem maupun
meristem pada a:illary buds diinokulasi dengan A.tumefaciens. Sementara itu teknik in
planta pada padi yang dilaporkan disini menggunakan embryonic apical meristem dari
bii padi yang tela# direndam untuk diinokulasi dengan A.tumefaciens.
Agar transformasi dapat diverifikasi dengan berbagai enis pembuktian7 digunakan
tiga strain A.tumefaciens yang berbeda yaitu: strain avirulen mutan +&217
13
strain
12A4434 mengandung binary vector p4(121&5m7
11
dan strain 12A4434 mengandung
binary vector 'p24&res) yang dimodifikasi agar dapat direscue T&D,A yang tela#
terintegrasi dan D,A yang mengapitnya pada kromosom inang.
*
"ada mutan +&217
#anya gen iaaM7 yang terlibat dalam biosintesis indolacetic acid '4AA)7 yang termutasi
ole# Tn57 sementara gen&gen lainnya termasuk gen untuk biosintesis sitokinin pada T&
D,A tetap utu#. Dengan demikian tanaman tertransformasi dengan strain ini
di#arapkan mensintesa sitokinin dalam umla# banyak se#ingga p#enotypenya beruba#
secara dramatic7 dimana #al ini secara kasatmata dapat menadi indikasi yang baik dari
keadian transformasi. Transformasi dengan A.tumefaciens 12A4434 mengandung
binary vector p4(121&5m di#arapkan dapat dideteksi dengan perendaman
#istoc#emical untuk aktifitas ;&glucuronidasenya dan uga dari keta#anannya ter#adap
#ygromycin 2 mengingat pada binary vector p4(121&5m terdapat gen ;&glucuronidase
'(%S) dengan intronnya dan gen keta#anan ter#adap #ygromycin 2 pada T&D,Anya.
A.tumefaciens 12A4434 mengandung binary vector p24&res digunakan untuk
memastikan terintegrasinya transgene 'T&D,A) kedalam genom tanaman
tertransformasi dengan merescue kembali transgene dan D,A yang mengapitnya dari
genom tanaman tertransformasi.
# Bahan dan Metode
A. tumefaciens strains and binar! -ectors
T#e follo6ing A. tumefaciens strains and binary vectors 6ere used in t#e present
study. T#e +&21 mutant strain 6as produced by transposon ! 'Tn5) mutagenesis of
A23- virulent strain '.!- c#romosome7 nopaline type T3* pTi) in my laboratory
43)
.
T#e T&D,A construct of +&21 mutant 6as described previously
41)
. T#e mutant #ad a
Tn5 insertion in tryptop#an monoo:ygenase gene 'iaaM) in T&D,A region of Ti
plasmid7 6#ic# is involved in 4AA biosynt#esis. All ot#er genes including a gene for
cytokinin biosynt#esis 'ipt) in t#e T&D,A region of t#e +&21 mutant are intact. T#e
mutant retained t#e ability to integrate its o6n T&D,A as 6ell as of a binary vector
introduced in its cell to #ost c#romosome but produced no galls on #ost plants. A.
tumefaciens 12A4434 strain 6as described previously
44)
. T#e follo6ing t6o binary
vectors 6ere introduced to 12A4434 strain by transformation. A binary vector7 p4(121&
5m7 6as constructed by <#ta et al.
4!)
. T#e binary vector contains a kanamycin&
resistance 'nptII) and a #ygromycin&resistance 'hpt) genes as 6ell as ;&glucuronidase
'(%S) gene 6it# an intron in t#e ,&terminal region. T#is intron&(%S reporter gene
e:presses (%S activity in plant cells but not in t#e cells of A. tumefaciens
4!)
. Anot#er
binary vector7 p24&res7 6as constructed by replacing t#e Sma4=Eco/4 segment of t#e ;&
glucuronidase gene and ,os&terminator of p24121 binary vector 6it# a Pvu44=Eco/4
segment '2.3 kb) of an ampicillin resistance '&lactamase) gene and a replication origin
'ori) of p2/322 plasmid. T#e sc#ematic diagram of T&D,A of p24&res binary vector is
s#o6n in >ig. 2.1
43)
.
Transformation
A. tumefaciens 6as cultured on eit#er 12 medium containing kanamycin '!3
?g=ml) and rifampicin '13 ?g=ml) '+&21 mutant) or 12 medium containing
streptomycin '!3 ?g=ml)7 kanamycin '!3 ?g=ml) and rifampicin '13 ?g=ml) '12A4434
strain 6it# a p4(121&5m or a p24&res) at 2-@. for 2 days. T#e bacteria 6ere #arvested
6it# a loop and suspended at density of 1.3 : 13
0
cells=ml in 6ater. T#e seeds of rice
'!ry"a sativa 1. var. 8os#i#ikari) 6ere steriliAed 6it# et#anol and sodium #ypoc#lorite
and imbibed at 23@. for 2 days. 9ater 6as replaced once during soak. After 2 days of
soak7 t#e embryo region of seed turned to 6#ite. At t#is stage7 neit#er s#oots nor roots
appeared yet. To inoculate A. tumefaciens onto embryonic apical meristem in t#e
imbibed seed7 a site of #usk 6#ere a s#oot emerged later 6as pricked at a point in 1 &
1.! mm dept# 6it# a needle ' 3.*1 mmB Taiki 5ome .raft7 Tokyo) t#at #ad been
dipped in t#e inoculum of A. tumefaciens. T#e inoculated seeds 6ere placed on t#e filter
papers on vermiculite 6etted by 6ater in flasks covered 6it# aluminum foil and
incubated at 23@. in t#e dark for 0 days7 during 6#ic# *3 to *!C of inoculated seeds
germinated to seedlings. T#en t#e seedlings 6ere immersed7 at room temperature7 in
6ater solution '1333 ppm) of cefota:ime '5oec#st +arion /oussel7 Tokyo) for 1 #.
>inally7 33 seedlings 6ere planted in t6o pots '1! seedlings=pot ' 24 cm)) containing
soil prepared for rice plants 'Dennou7 Tokyo) and gro6n to maturation 'T
3
) under
nonsterile conditions and allo6ed to pollinate naturally to set t#e seeds 'T
1
). >or control
plants7 eit#er 12A4434 strain 6it#out a binary vector or 6ater 6as used for inoculation.
.etection of A. tumefaciens used for transformation in transformed
plants#
Eoung leaves at s#oot apices of mature rice plants 'T
3
and T
1
) 6ere aseptically
#omogeniAed 6it# autoclaved 6ater using a mortar and pestle. T#e #omogenates 6ere
inoculated onto 12&medium 6it# eit#er kanamycin '!3 ?g=ml) and rifampicin 'l3
?g=ml) for +&21 mutant or streptomycin '!3 ?g=ml)7 kanamycin '!3 ?g=ml) and
rifampicin '13 ?g=ml) for 12A4434 strain #arboring a p4(121&5m or a p24&res binary
vector. T#e inoculated media 6ere incubated at 2-@. for 3 days. ,o colonies appeared
6it# any #omogenates7 indicating t#e absence of A. tumefaciens used for transformation
in t#e s#oot apices of transformants. T#e lo6er parts of t#e plants 'T
3
) 6ere not
e:amined for t#e presence of A. tumefaciens for t#e reason t#at t#e lo6er part of t#e
plants 6ere assumed not to contribute to production of germ cells7 namely pollens and
eggs7 for t#e follo6ing generation. T#e genomic D,A for "./ and Sout#ern
#ybridiAation analyses 6as also isolated from young leaves at s#oot apices of rice
plants.
"ampling of seeds
>or t#e e:periment t#at produced t#e results s#o6n in >ig. 2.27 seeds from one
nontransformed plant and one transformed 'T
3
) plant t#at 6ere gro6n separately 6ere
used. 4n t#e ot#er e:periments7 o6ing to t#e limitation of space7 eac# rice plant 6as not
gro6n separately to prevent cross&pollination7 but 1! plants 6ere gro6n toget#er in a
large '2! cm) pot. .onseFuently7 some cross&pollination likely occurred to set seeds.
T#us7 t#e seeds from all 33 transformed plants 6ere pooled7 from 6#ic# seeds 6ere
randomly selected.
.etermining h!grom!cin resistance of transformants
T#e seeds 6ere #ulled and steriliAed 6it# et#anol and sodium #ypoc#lorite '1C).
T#e steriliAed seeds 6ere rinsed t#ree times in 6ater and germinated in #ygromycin 2
6ater solution '23 ?g=ml) '2 & 3 mm dept#) at 2-@.7 for 1$ #rs lig#t and - #rs dark7
under sterile conditions. /esistance 6as scored $ days later.
&istochemical assa! of /0glucuronidase (G1") acti-it!
G:pression of (%S in rice cells 6as assayed by t#e met#od of 8apila et al.
4$)
. T#e
6#ole plant bodies of 13 days old seedlings 6ere stained.
'solation of .2A
/ice genomic D,A 6as e:tracted from young leaves at s#oot apices of rice plants
by t#e procedure described by .#en et al.
4*)
.
P34 anal!sis
T#e nested "./ for detection of transgene in t#e genome of transformants 'T
1
)
generated by a +&21 mutant of A. tumefaciens 6as carried out as follo6s. 4nstead of
"./ consisting of one round of reactions7 nested "./ 6as used to obtain reproducible
results. 4n t#e +&21 mutant7 a Tn5 is inserted bet6een 13!! bp and 13!$ bp of
tryptop#an monoo:ygenase gene 'iaaM) in t#e T&D,A region on Ti plasmid
43)
. T#e
follo6ing nested "./ primers 6ere designed suc# t#at t#e D,A segment '*$3 bp)
spanning iaaM and Tn5 6ould be amplifiedB primers for t#e 1st "./7 !H .(. TTA
.AT .TA T(T T(( .A 3I for for6ard direction7 !H .AT (TT A(( A(( TA. .AT
(( 3H for reverse directionB primers for t#e 2nd "./7 !H T(. .AT .(A ..T T(.
A.. AT 3H for for6ard direction7 !H A(( TT. .(T T.A ((A .(. TA 3H for reverse
direction. 4n t#e first "./7 genomic D,A 'about 133 ng) 6as added to a reaction
mi:ture of 2! ?l of final volume '!3 m+ 8.l7 13 m+ Tris&5.l7 p5 -.37 1.! m+
+g.1
2
7 233 ?+ d,T"7 3.2 ?+ eac# primer and 3.$3 unit of JTaF polymerase 'Takara
SyuAou). T#e "./ 6as done at 04@. for 1 minute once7 at 04@. for 33 seconds7 at !!@.
for 1 minute7 at *2@. for l minute for t#e first 23 cycles and t#en *2@. for * minutes.
>or t#e second "./7 2 ?l of t#e first "./ mi:ture 6as used as a template7 and "./ 6as
done as follo6sB 04@. for 1 minute once7 at 04@. for 33 seconds. at !-@. for 1 minute7
at *2@. for 4! seconds for first 2! cycles and t#en *2@. for * minutes. T#e reaction
mi:ture of 2nd "./ '! ?l) 6as applied to agarose gel '1C) electrop#oresis and t#en
stained by et#idium bromide to e:amine t#e product. 9#en t#e product of 2nd "./
using total D,A of t#e +&21 mutant as a template 6as digested 6it# Hind4447 t#e
fragments of 403 bp and 2*3 bp 6ere yielded7 as e:pected from D,A seFuence of t#e
genes. T#e *$3 bp D,A amplified from genomic D,A of transformants 6as also
digested by Hind444 to confirm t#e identity.
T#e nested "./ to prepare T&D,A&flanking D,A segment in t#e plasmid rescued
from genomic D,A of transformant 'T
3
) generated by A. tumefaciens '12A4434)
#arboring a p24&res binary vector 6as performed as follo6s. T6o primer sets 6ere
designed to amplify t#e D,A segment outside of T&D,A region in t#e rescued plasmidB
primers for t#e 1st "./7 1&1 primer7 !H (.( T.A T.. .TT A.( T.A (T 3H for
for6ard directionB 1&2 primer7 !H .T( T(A (AT ..A (TT .(A T( 3H for reverse
directionB primers for t#e 2nd "./7 1&3 primer7 !H T.T T(A T(A (A. .T( .T( .(
3H for for6ard directionB 1&4 primer7 !H T(( ..( T.( TTT TA. AA. (T 3H for
reverse direction. T#e positions of primers are s#o6n in >ig. 2.1. 4n t#e first "./7 t#e
rescued plasmid 'about 233 ng) 6as added to a reaction mi:ture of 2! ?l of final
volume '!3 m+ 8.l7 13 m+ Tris&5.l7 p5 -.37 1.! m+ +g.1
2
7 233 ?+ d,T"7 3.2
?+ eac# primer and 3.$3 unit of JTaF polymerase 'Takara SyuAou). T#e "./ 6as done
at 04@. for 1 minute once7 at 04@. for 1 minute7 at !-@. for 1 minute7 at *2@. for 2
minutes for first 43 cycles and t#en *2@. for ! minutes. >or t#e second "./7 1?l of t#e
first "./ mi:ture 6as used as a template7 and "./ 6as done as t#e first "./. T#e
product 'ca. 1.3 kb) of t#e second "./ 6as recovered from t#e electrop#oresed agarose
gel to seFuence it. T#e seFuence of t#e 2nd "./ product 6as determined using t#e
for6ard and reverse primers of t#e second "./ 6it# A24 "/4S+ 3133 (enetic
AnalyAer 'Applied 2iosystems).
Plasmid rescue
(enomic D,A 6as e:tracted from a flag leaf7 a leaf ust belo6 inflorescence7 of a
transformant 'T
3
) at flo6ering stage generated by A. tumefaciens #arboring a p24&res
binary vector. T#e D,A 6as digested 6it# Sph47 of 6#ic# restriction site is not included
in t#e p2/322 plasmid&derived D,A segment '2.3 kb) containing a replication origin
and ampicillin resistance gene in T&D,A of p24&res binary vector. T#e digested D,A
6as self&ligated 6it# D,A ligation kit ver.1 'Takara SyuAou7 8usatsu) and transformed
to Escherichia coli '52 131). T#e transformed E. coli 6as screened on 12 medium
containing ampicillin '!3 ?g=ml). T#e plasmids 6ere isolated from E. coli gro6n on 12
medium 6it# ampicillin '!3 ?g=ml). T#e isolated plasmid 6as of big siAe7 larger t#an -
kb7 and #ence follo6ed by t#e procedure to make t#e plasmid smaller. T#e plasmid 6as
again digested 6it# Hind4447 6#ic# did not split t#e above p2/322&derived D,A
segment and t#en self&ligated. T#e self&ligated D,A 6as transformed to E. coli7 from
6#ic# t#e plasmid 6as isolated and used for analysis of its construct. T#e D,A segment
flanking T&D,A in t#e final rescued plasmid 6as prepared and seFuenced as described
above.
#% &asil dan Pembahasan
Transformasi dengan mutan A.tumefaciens strain M0$#
Tanaman tertransformasi 'transformant) ole# A.tumefaciens strain +&21 di#arapkan
menunukkan peruba#an p#enotype akibat terganggunya keseimbangan #ormone. <le#
karena itu kami mentransformasi padi menggunakan mutan +&21 agar dapat
menentukan apaka# tanaman padi tertransformasi menunukkan peruba#an p#enotype
dan apaka# peruba#an ini uga diturunkan ke generasi berikutnya. Sebagaimana
ditunukkan pada (br 17 tanaman tertransformasi ole# strain +&21 menunukkan
peruba#an p#enotype dimana tanaman menadi lebi# tinggi dari kontrolnya. 2elum elas
#alnya apaka# peruba#an ini disebabkan ole# efek langsung dari dugaan adanya
produksi #ormone tumbu# sitokinin yang berlebi#an. Akan tetapi7 satu #al yang dapat
dipastikan disini ba#6a peruba#an p#enotype ini diturunkan pada generasi berikutnya7
dimana transformant T1 nya uga menunukkan p#enotype yang lebi# tinggi dari
kontrolnya. 5al ini dapat menadi satu indikasi teradinya transformasi.
.eteksi transgene dengan P34 pada transformants (T$) oleh strain mutan M0$
Segment D,A terbentang antara iaaM dan Tn5 pada T&D,A dari strain +&21 dipili#
sebagai transgene mengingat konstruksi D,A ini #anya terdapat pada strain mutan +&
21 dan tidak terdapat pada genom organisme lain '(br. 2). 1ebi# dari itu7 data sekuen
D,A di sekitar Tn5 pada mutan +&21 suda# tersedia se#ingga memungkinkan untuk
mengkonfirmasi identitas produk "./ dari ukurannya dan dari ukuran pemotongan
dengan enAim restriksi.
Transgene '*$3 bp) dideteksi pada 0 tanaman '43C) dari 22 tanaman 'T1) yang diui
dan dipili# secara acak7 sementara dari $ tanaman control yang diui semuanya tidak
menunukkan keberadaan transgene '(br. 3). 8onfirmasi dari pemotongan dengan
enAim restriksi Hind444 menunukkan produk "./ berukuran *$3 bp terpotong menadi
ukuran 403 bp dan 2*3 bp dili#at dalam gel elektroporesis seperti yang di#arapkan.
Transformasi dengan strain 5BA66,6 mengandung binar! -ector p'G$$0&m
2inary vector p4(121&5m memiliki gen (%S dengan intronnya dan gen keta#anan
ter#adap #ygromycin pada T&D,Anya. Dengan demikian keberadaan gen&gen tersebut
pada transformants dapat dideteksi dengan #istoc#emical assay untuk gen (%S dan ui
keta#anan ter#adap #ygromycin.
Dari 33 tanaman 'T1) yang diui 13 diantaranya '43C) menunukkan reaksi positif
ter#adap (%S assay. Sementara itu dari 33 tanaman control yang diui kesemuanya
menunukkan reaksi negative ter#adap (%S assay '(br. 4).
8eta#anan ter#adap #ygromycin diui dengan perkecamba#an bii dalam larutan
#ygromycin 2 '23 ppm). Dari 1* bii yang diui 12 bii diantaranya '*3C) dapat
berkecamba# dalam larutan #ygromycin 2 sedangkan 1! bii padi dari tanaman control
beberapa diantaranya dapat berkecamba# dengan tidak normal. Tidak demikian #alnya
pada bii&bii padi transformants maupun nontransformants yang dikecamba#kan pada
air steril7 semuanya dapat berkecamba# secara normal '(br. !).
4escue dan Analisis plasmid dari transformant 5BA66,6 mengandung binar!
-ector pB'0res
%ntuk mengkonfirmasi integrasi T&D,A kedalam genom tanaman tertransformasi7 T&
D,A ini #arus dapat direscue atau diambil kembali dari genom transformant dimana
selain T&D,A uga akan diperole# D,A dari genom padi yang mengapit T&D,A di
tempatnya berintegrasi. %ntuk keperluan ini genomic D,A diekstrak dari daun bendera
pada transformant 'T
3
) saat p#ase berbunga dari transformant yang menunukkan
peruba#an p#enotype 'ukuran tanaman lebi# tinggi). Sekuen D,A dari #asil rescue atau
yang diambil kembali dari genom transformant di teliti dan dicari #omologinya dengan
genom tanaman padi 'nontransformant) dengan bantuan 21AST soft6are. 5asil yang
didapat dari #omology searc# ini menunukkan T&D,A dari binary vector diapit ole#
c#romosomal gene padi dengan accession no. A.3-4*$4. 5al ini dapat sebagai bukti
ba#6a T&D,A berintegrasi pada genom padi '(br. $).
Dengan demikian pada penelitian ini tela# ditunukkan lima enis bukti untuk
memverifikasi transformasi pada padi dengan metode in planta yang kami kembangkan.
Adapun kelima bukti tersebut yaitu: satu7 transformants 'T
3
) diperole# dari strain +&21
menunukkan p#enotype berbeda dengan p#enotype tanaman control dan peruba#an
p#enotype ini di6ariskan ke generasi berikutnya 'T1). .ua7 transgene 'T&D,A disisipi
Tn5) dapat dideteksi dengan "./ sebanyak 43C dari transformant 'T1) yang dipili#
secara acak #asil transformasi dengan strain +&21. Tiga7 transformants dari #asil
transformasi dengan strain 12A4434 mengandung binary vector p4(121&5m mampu
menunukkan aktivitas gen (%S. 7mpat7 bii padi transformants dari #asil transformasi
dengan strain 12A4434 mengandung binary vector p4(121&5m menunukkan
keta#anan ter#adap #ygromycin 2 '23 ppm) pada p#ase perkecamba#an. 5ima7 plasmid
mengandung T&D,A yang tela# terintegrasi dan D,A genom padi yang mengapitnya
dapat direscue dari genomic D,A transformant 'T
3
) #asil transformasi dengan strain
12A4434 mengandung binary vector p24&res.
Gfektifitas transformasi pada penelitian ini keli#atan cukup tinggi bila dibandingkan
dengan penelitian lain '2anks et al. 10037 2irc# 100*7 .#en et al. 10037 5iei et al.
1004). Akan tetapi efektifitas transformasi yang dicapai pada penelitian ini cukup
beralasan mengingat A.tumefaciens adala# bakteri p#ytopat#ogenic di alam yang
mampu menginduksi tumor cro6n gall pada tanaman dengan cara mentransfer T&D,A
pada pTi yang dalam selnya ke dalam genom tanaman7 dengan kata lain transformasi
tanaman secara alami. 8etika A.tumefaciens strain A23-7 yang merupakan induk dari
strain +&217 diinokulasikan pada daun atau batang tanaman cocor bebek '#alanchoe
$aigremontiana) dalam pot dengan cara menusukkan tusuk gigi yang tela# dilumuri
A.tumefaciens7 gall terbentuk '133C) pada semua tempat inokulasi setela# $ minggu.
13

Gfektifitas infeksi7 dalam #al ini adala# transformasi pada tanaman yang diinokulasi7
kemungkinan dipengaru#i ole# factor provisi seperti au:in7 sitokinin dan lainnya yang
belum teridentifikasi yang diperlukan dalam pembentukan gall pada 6aktu yang tepat7
dengan konsentrasi optimal dan dengan kombinasi yang terbaik. Selain itu7 sel&sel atau
aringan dari tanaman utu# pada system in planta memiliki kekuatan ter#adap pat#ogen
dan stress7 dan memiliki kapasitas yang besar untuk diferensiasi dan regenerasi serta
#al&#al lainnya dibandingkan dengan sel&sel atau aringan pada kultur in vitro. System
in planta yang dikembangkan disini memiliki kesamaan dengan infeksi ole#
A.tumefaciens pada tanaman utu# dimana A.tumefaciens diinokulasikan pada meristem
dari tanaman utu#7 selanutnya ditumbu#kan dalam pot #ingga de6asa. Dengan
demikian transformasi in planta pada penelitian ini menyerupai proses infeksi ole#
A.tumefaciens pada tanaman di alam. 4ni merupakan alasan tingginya efektifitas
transformasi dari metode yang kami kembangkan.
.aftar Pustaka
1. .#an7 +. T.7 .#ang7 +. 5.7 5o7 S. 1.7 Tong7 9. >.7 and Eu7 S. +.: Agrobacterium&
mediated production of transgenic rice plants e:pressing a c#imeric K&amylase
promoter=&glucuronidase gene. "lant +ol. 2iol. 227 401&!3$7 1003.
2. 5iei7 E.7 <#ta7 S.7 8omari7 T. and 8umas#iro7 T. '1004). Gfficient transformation
of rice '!ri"a sativa) mediated by Agrobacterium and seFuence analysis of t#e
boundaries of t#e T&D,A. T#e "lant Lournal $: 2*1&2-2
3. "ark7 S. 5.7 "rinson7 S. /.7 and Smit#7 /. 5.: T&D,A integration into genomic D,A
of rice follo6ing Agrobacterium inoculation of isolated s#oot apices. "lant +ol.
2iol. 327 l13!&114-7 100$.
4. Terada7 /.7 Asano7 5.7 and 4ida7 S.: A 1arge&scale Agrobacterium&mediated
transformation procedure 6it# a strong positive&negative selection for gene targeting
in rice '!ry"a sativa 1.). "lant .ell /ep. 227 $!3&$!07 2334.
!. .#eng7 +.. 1o6e7 2. A.. Spencer7 T. +.. Ee7 M.7 and Armstrong7 .. 1.: >actors
influencing Agrobacterium&mediated transformation of monocotyledonous species.
4n Nitro .ell Dev. 2iol. "lant. 437 31&1!7 2334.
$. 2irc#7 /. (..: "lant transformation&problems and strategies for practical application
Ann. /ev. "lant "#ysiol. "lant +ol. +ol. 4-7 20*&32$7 100*.
*. 8oima7 +.7 Arai7 E.7 46ase7 ,.7 S#iratori7 8.7 S#ioiri7 5.7 and ,oAue7 +.:
Development of a simple and efficient met#od for transformation of buck6#eat
plants 'Fagopyrum esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. 2iosci.
2iotec#nol. 2ioc#em. $47 -4!&-4*7 2333.
-. "ing7 1. M.7 ,oga6a7 +.7 ,oAue7 +.7 +akita7 +.7 Takeda7 +.7 2ao7 1.7 and 8oima7
+.: In planta transformation of mulberry trees 'Morus alba 1.) by Agrobacterium
tumefaciens. L. 4nsect 2iotec#nol. Sericol. *27 1**&1 -47 2333.
0. 8oima7 +.7 S#ioiri7 5.7 ,oga6a. +.7 ,oAue7 +.7 +atsumoto7 D.7 9ada7 A.7 Saiki7
E.7 and 8iguc#i7 8.: In planta transformation of kenaf plants 'Hibiscus cannabinus
var. aoka6a no. 3) by Agrobacterium tumefaciens. L. 2iosci. 2ioeng. 0-7 13$&1307
2334.
13. +aumder7 ".7 Eos#ida7 5.7 S#ioiri7 5.7 ,oAue7 +.7 and 8oima7 +.: +&31 mutant
'virA::Tn5) of Agrobacterium tumefaciens is capable of transferring its T&D,A into
t#e nucleus of #ost cell7 but incapable of integrating it into t#e c#romosome. L.
2iosci. 2ioeng. 037 34!&3!27 2333.
11. 5oekema7 A.7 5irsc#7 ". /.7 5ooykaas7 ". L. L.7 and Sc#ilperoort7 /. A.: A binary
plant vector strategy based on separation of vir& and T&D,A of t#e Agrobacterium
tumefaciens Ti&plasmid. ,ature. 3337 1*0&1-37 10-3.
2anks S.9.7 (ossett D./.7 1ucas +...7 +ill#ollen G.".7 1a.ell +.(.: Agrobacterium
mediated transformation of kenaf '5ibiscus cannabinus 1.) 6it# t#e ;&glucuronidase
'(%S) gene. "lant +olecular 2iology /eporter 117 131&1347 1003