Anda di halaman 1dari 5

Perkembangan terbaru dari strategi skrining

berdasarkan generasi dan layar besar


perpustakaan fragmen antibodi telah memungkinkan cukup
uang muka untuk isolasi in vitro
antibodi monoklonal ( mAbs ) . Sebelumnya kami kembangkan
teknologi disebut sebagai ' AdLib
( Mandiri Diversifikasi Library) sistem , yang
memungkinkan skrining cepat dan isolasi in vitro
antibodi monoklonal - antigen spesifik ( mAbs )
dari perpustakaan imunoglobulin M ( IgM ) ditampilkan
oleh garis sel B - ayam DT40 . Di sini , kami melaporkan
aplikasi baru dari sistem AdLib untuk produksi
dari mAbs manusia chimeric . Kami memiliki
gen dirancang knock-in konstruksi untuk menghasilkan
Strain DT40 yang coexpress chimeric IgG manusia
dan ayam IgM melalui B - sel spesifik alternatif RNA
splicing . Kami menunjukkan bahwa penerapan
Sistem AdLib strain ini memungkinkan satu langkah
Operator- antigen spesifik manusia IgG chimeric . di
Selain itu , produksi chimeric IgG dapat
selektif meningkat ketika kita memodulasi pengolahan RNA
dengan overexpressing polyadenylation yang
Faktor CstF - 64 . Metode ini memberikan cara baru untuk
efisien desain mAbs cocok untuk berbagai
tujuan termasuk terapi antibodi .
PENDAHULUAN
Penggunaan antibodi monoklonal (mAbs) telah mengangkat cukup
bunga dalam beberapa tahun terakhir, terutama untuk diagnostik
dan aplikasi terapeutik. Perkembangan
teknologi hibridoma (1) telah memungkinkan pilihan yang luas
dan produksi mAbs secara khusus mengikat untuk menargetkan
antigen yang menarik, termasuk beberapa mAbs disetujui untuk
penggunaan klinis terhadap penyakit manusia seperti kanker (2).
Namun, teknologi konvensional berdasarkan imunisasi hewan
untuk mengisolasi mAbs baru tetap memakan waktu , dan
mengecualikan generasi mAbs terhadap buruk imunogenik
antigen seperti auto - antigen dan kecil
senyawa .
Untuk mengatasi masalah ini , berbagai sukses in vitro
Sistem penyaringan dari mAb fragmen perpustakaan memiliki
muncul dari tampilan teknologi molekuler seperti
tampilan fag (3,4 ) . Baru-baru ini , kami telah mengembangkan baru
metode untuk generasi cepat mAbs menggunakan
ayam sel - B yang diturunkan garis sel DT40 ( 5,6 ) . dengan meningkatkan
konversi gen ( 5,7 ) , yang merupakan diversifikasi utama
proses imunoglobulin ( Ig ) variabel daerah di
Sel ayam B (8,9 ) , kami memperoleh memperluas secara alami
perpustakaan mAbs ditampilkan pada permukaan sel sebagai
membran - terikat IgM . DT40 klon mengekspresikan
mAbs - antigen spesifik kemudian dapat diisolasi dengan menggunakan
manik-manik magnetik terkonjugasi untuk setiap antigen target
bunga. Teknologi ini , bernama sistem AdLib
( Mandiri Diversifikasi sistem Library) ( 5,6 ) , memiliki
keuntungan yang memungkinkan akuisisi seluruh IgM
molekul dengan cara yang cepat dan nyaman . Selain itu , diberikan kemudahan manipulasi dan budaya
genetik
Sel DT40 ( 10 ) , klon yang dipilih dapat segera
diperluas dan dimanipulasi untuk mengakomodasi kebutuhan
untuk produksi skala- up atau immunoreactivity ditingkatkan ,
termasuk , misalnya , pengembangan
dalam sistem maturasi afinitas vitro berdasarkan genetik
peningkatan Ig hypermutation ( 11,12 ) .
Sistem AdLib telah terbukti menjadi efektif
metode untuk akuisisi de novo - antigen spesifik
mAbs bunga ( 5,6 ) . Namun, salah satu keterbatasan adalah bahwa
Sel-sel DT40 dapat menghasilkan hanya ayam IgM , baik yang
membran - terikat atau disekresikan bentuk . Konversi ke lainnya
Isoform Ig , terutama IgG , sering diinginkan untuk praktis
digunakan, terutama untuk aplikasi yang melibatkan pengakuan
wilayah Fc . Perkembangan in vivo tes dan
aplikasi medis juga memerlukan imunogenisitas
mAb sendiri harus dikurangi sebanyak mungkin , yang
* Untuk siapa korespondensi harus ditangani . Tel : +81 3 5465 8834 ; Fax : +81 3 5465 8834 ; Email :
kohta@bio.c.u-tokyo.ac.jp
Hadir alamat :
Waka Lin , Divisi Farmakologi , Institut Nasional Ilmu Kesehatan , Kamiyoga 1-18-1 , Setagaya - ku , Tokyo
158-8501 , Jepang .
Diterbitkan online 9 November 2010 Asam Nukleat Penelitian , 2011, Vol . 39 , No 3 E14
doi : 10.1093/nar/gkq1122
? Penulis ( s ) 2010. Diterbitkan oleh Oxford University Press .
Ini adalah artikel Open Access didistribusikan di bawah persyaratan Creative Commons Attribution
License Non Komersial ( http://creativecommons.org/licenses/
by-nc/2.5 ) , yang memungkinkan penggunaan non - komersial terbatas , distribusi , dan reproduksi
dalam media apapun , asalkan karya asli benar dikutip .
Download dari http://nar.oxfordjournals.org/ oleh tamu pada 1 Juni 2014

gusually dicapai dengan rekayasa chimeric atau manusiawi
versi mAb yang dipilih. Dalam laporan ini, kami menyajikan
pendekatan baru untuk generasi langsung chimeric
IgG manusia di DT40 display sel perpustakaan. Dengan knock-in
dari manusia IgG wilayah konstan ke dalam IgM ayam
berat rantai lokus, kami merancang turunan DT40 yang
mengungkapkan oleh splicing alternatif kedua ayam IgM dan
chimeric IgG berbagi domain antigen-mengikat yang sama.
Strain ini dapat menghasilkan sebuah perpustakaan untuk layar untuk
-antigen spesifik mAbs oleh aplikasi langsung dari
Sistem AdLib, sehingga memungkinkan isolasi simultan
IgG chimeric dari tertentu yang menarik. Selain itu, kita menunjukkan
bahwa produksi chimeric IgG dapat selektif
meningkat selama ayam IgM oleh modulasi efisiensi
pengolahan RNA.
BAHAN DAN METODE
Kondisi kultur sel
Sel DT40 dikultur seperti yang dijelaskan sebelumnya (5,7) di
IMDM (Invitrogen) ditambah dengan 10% janin sapi
serum (FBS, SAFC Biosciences), 1% serum ayam
(Invitrogen), 50 U / ml penisilin-50 mg / ml streptomisin
(Invitrogen), 55 mM 2-mercaptoethanol (Invitrogen), di
39,5? C dalam 5% CO2 inkubator. Media yang berubah secara teratur
setiap 1 atau 2 hari untuk menjaga kepadatan sel pada
2? 105-1,5? 106 sel / ml. TSA (Wako) ditambahkan di
media di setiap bagian sebesar 2,5 ng / ml bila diindikasikan.
Untuk pemurnian chimeric IgG, budaya dipindahkan
hari sebelumnya menjadi medium yang mengandung 10%
Ultra-Low IgG FBS (Invitrogen) bukannya biasa FBS
dan tidak ada serum ayam untuk mengurangi kontaminasi dengan
serum IgG.