Secara umum, kerusakan sperma selama kriopreservasi telah dikaitkan dengan beberapa

faktor termasuk cold shock, kerusakan akibat pembekuan, stres oksidatif, perubahan dalam
komposisi membran, toksisitas kimia dari CPA, dan stres osmotik [9]. Dalam rangka
pengembangan prosedur pembekuan sperma yang optimal, maka peneliti mempelajari laju
pendinginan yang optimal dalam berbagai pengencer sperm. Sebuah media pembekuan
sederhana dan efektif yang terdiri dari 18% rafinosa dan 3% susu skim tanpa menyerap CPA
telah berhasil digunakan untuk kriopreservasi sperm dari banyak strain tikus inbreed dan
outbreed [26,43]. Salah satu temuan menarik dari penelitian ini adalah bahwa, tampak
perbedaan pada efektivitas spermatozoa tikus, susu skim tidak efektif dalam melindungi tikus
dari kerusakan spermatozoa akibat pembekuan, bahkan spermatozoa dari spesies yang
berkerabat dekat (yaitu tikus dan mencit) memiliki karakteristik kriobiologis yang spesifik
dan menekankan pada pentingnya pengembangan protokol pembekuan yang spesifik.
Dibandingkan dengan spermatozoa mencit, terdapat sedikit keberhasilan dalam pembekuan
pada spermatozoa tikus. Yamashiro et al. melaporkan motilitas tertinggi sebesar 39.3% dari
post-thaw untuk spermatozoa pada epididimal tikus pada mKRB yang mengandung 0.1
rafinosa, 0,75% Equex STM dan 20% EY. Telah banyak dilaporkan bahwa CPA non-
penyerap lebih efektif daripada CPA penyerap untuk kedua spermatozoa tikus dan mencit
yang dibekukan [25,26,32,33,37,57]. Studi saat ini juga menunjukkan bahwa pengencer yang
dibekukan yang mengandung 0,1 M rafinosa merupakan krioproteksi yang baik untuk
spermatozoa tikus. Selain itu, dilaporkan bahwa terdapat efek perlindungan dari CPA non-
penyerap terhadap pendinginan [51], beberapa penelitian menunjukkan tidak efektifnya CPA
penyerap, gliserol, selama tikus sperma kriopreservasi [34,57].
Dalam penelitian peneliti sebelumnya, pengencer TL- HEPES, SM, laktosa, Tris dan TES
merupakan pengencer yang baik tetapi SM tidak efektif dalam menghindari kerusakan akibat
dingin [ 51 ]. Di sisi lain, pengencer yang mengandung SM dan 0,1 M rafinosa dalam
penelitian ini efektif dalam menghindari kerusakan akibat dingin, tapi itu tidak efektif selama
pembekuan. Kriopreservasi pada pengencer yang mengandung 0,1 M atau 0,1 M rafinosa
sukrosa disiapkan dalam medium TES dengan 0,75 % Equex - Paste dan 20 % kuning telur
secara signifikan meningkatkan motilitas sperma dibandingkan dengan TL- HEPES dan m-
KRB baik pada strain SD dan F344. Yamashiro et al. [ 52 ] menemukan bahwa kriopreservasi
spermatozoa tikus Wistar dalam m-KRB menjamin perbaikan dalam ofmolitas (39,3 %) dan
integritas akrosom (89,3 %). Kriopresrvasi spermatozoa di m-KRB dalam penelitian saat ini
memiliki motilitas yang lebih rendah (16,7 % dan 15,0 % untuk tikus strain F344 dan SD
tikus). Namun, dalam penelitian terbaru, Yamashiro et al. [ 58 ] melaporkan motilitas sperma
yang lebih rendah pasca-thaw (21,5 %) bila m-KRB digunakan sebagai extender.
Inkonsistensi dalam karakteristik spermatozoa pasca - thaw dalam epididimis sperma tikus
dapat dikaitkan dengan (1) laju pendinginan yang tidak terkendali (2) kurangnya komponen
pengencer sperma yang optimal dan (3) penanganan suboptimal seluruh prosedur
kriopreservasi. Misalnya meskipun protokol pembekuan sperma tikus yang dikembangkan
oleh Nakagata et al. [ 3 ], telah digunakan secara universal untuk kriobank spermatozoa dari
ribuan strain tikus, masih ada aspek-aspek yang belum ditentukan pada protokol pembekuan
yang dapat menyebabkan perbedaan dalam hasil yang signifikan.
Komposisi media dan laju pendinginan memiliki efek yang signifikan pada kelangsungan
hidup sperma dan interaksi antara media dan laju pendinginan sebelumnya telah teramati
[55]. Sampai saat ini, pembekuan pengencer yang mengandung 23 % (v/v) kuning telur, 8 %
(b/v) laktosa monohidrat yang paling umum digunakan sebagai pengencer yang digunakan
untuk kriopreservasi spermatozoa tikus [34]. Semua penelitian ini sebelumnya mengandung
straw spermatozoa tikus yang didinginkan dengan meletakkannya pada 2 cm di atas
permukaan nitrogen cair (-150 sampai pada -170 C) selama 10-15 menit sebelum
dimasukkan ke LN2 [ 34,56-58 ]. Namun, mereka tidak melaporkan tingkat pendinginan
yang tepat. Sampai saat ini hanya ada satu penelitian kriobiologis dasar yang menyelidiki laju
pendinginan yang optimal untuk spermatozoa tikus. Hagiwara et al. [ 19 ] mengevaluasi
biofisika (permeabilitas membran) spermatozoa tikus untuk lebih memahami respon laju
pendinginan yang memberikan kontribusi untuk keberhasilan kriopreservasi. Sebuah
penelitian diferensial scanning kalorimeter diprediksi dan diuji eksperimental bahwa tingkat
pendinginan optimal yang berkisar 53-70C /menit untuk spermatozoa tikus. Motilitas
maksimum diperoleh dengan tingkat pendinginan antara 50 dan 80C/menit.
Ini merupakan salah satu dari penelitian pertama yang bertujuan untuk menentukan laju
pendinginan yang optimal menggunakan Linkam Cryostage. Laju pendinginan yang optimal
bervariasi dari spesies satu dan spesies yang lain. Telah terbukti untuk kelangsungan hidup
pada kriopreservasi spermatozoa tikus tergantung secara signifikan pada laju pendinginan,
dan agak tidak berkaitan dengan tingkat pemanasan selama pemanasan yang cepat (1000
C/menit) digunakan. Dalam penelitian ini peneliti juga menggunakan pemanasan yang cepat
(1000 C /menit). Tingkat pendinginan secara signifikan dipengaruhi motilitas spermatozoa
SD pasca-thaw pada pengencer TL-HEPES, m-KRB dan TES-R dan motilitas sperma F344
pada pengencer TL-HEPES, SM, TES-R dan TES-S. Dalam pengencer ini, motilitas pasca-
thaw menurun secara signifikan dalam 10 C/menit laju pendinginan dibandingkan dengan
100 C/menit laju pendinginan. Motilitas tertinggi diperoleh ketika spermatozoa tikus
didinginkan antara 40 dan 100 C/menit. Hal ini konsisten dengan laporan sebelumnya dari
Hagiwara et al. [19] dalam motilitas maksimum diperoleh dengan laju pendinginan antara 50
dan 80 C/menit. Dalam studi ini peneliti tidak menyelidiki laju pendinginan yang lebih
tinggi dari 100 C/menit karena keterbatasan tahap pendinginan Linkam. Mesin pendingin
yang paling umum digunakan di laboratorium tidak dapat mencapai laju pendinginan
dikendalikan dari 100 C/menit dan suhu diatasnya. Hal ini diterima karena konstan
pendinginan spermatozoa tikus tidak dapat tersimpan dalam LN2 yang mendinginkan sperma
antara 100 dan 130 C / menit. Stacy et al. [47] telah menunjukkan elegan reproduktifitas
rendah pembekuan protokol terutama karena variasi laju pendinginan dalam uap LN2. Untuk
sperma tikus, tingkat 114 _C pendinginan / min menghasilkan motilitas lebih tinggi dari
tingkat 39 _C / menit pendinginan tetapi, tingkat 192 _C pendinginan / menit menyebabkan
motilitas terendah [47]. Demikian pula, Koshimoto dan Mazur [27] menunjukkan bahwa
tingkat antara 27 dan 130 _C pendinginan / min menghasilkan sperma motil yang lebih
dibandingkan dengan tingkat yang lebih rendah atau lebih tinggi.
Dalam studi ini , pembekuan dan pencairan tikus sperma mengakibatkan penurunan motilitas
, integritas membran plasma , integritas akrosom dan MMP . Hasil penelitian kami
menunjukkan bahwa MMP ini sangat dipengaruhi dari pembekuan untuk kedua SD dan F344
tikus strain . Motilitas dan integritas akrosom dari SD tikus sperma adalah sekitar 32 % dan
27 % untuk TES - R dan TES - S extender pada 100 _C / menit laju pendinginan . Di sisi lain
, plasma dan integritas membran mitokondria adalah sekitar 21 % dan 4 % untuk TES - R dan
TES - S , masing-masing. Hasil ini menunjukkan bahwa cedera pembekuan dan motilitas
progresif lebih rendah pada tikus sperma mungkin sebagian besar disebabkan oleh kerusakan
MMP . Yamashiro et al . [ 58 ] sebelumnya menunjukkan bahwa suplementasi adenosin 5 -
triphosphate ( ATP ) untuk extender , sebelum pembekuan , ditingkatkan cryosurvival sperma
dengan meningkatkan kapasitas metabolisme tikus sperma . Demikian pula , Kim et al . [ 25 ]
di laboratorium kami memperoleh jumlah sedikit lebih tinggi ( 36,5 % ) dan progresif ( 6,0%
) motilitas setelah menambahkan 2 g / L ATP untuk TES - sukrosa - EY extender . Namun,
membran plasma integritas dan MMP menunjukkan hanya sedikit peningkatan dibandingkan
dengan penelitian ini .
Sperma motilitas adalah tes yang paling umum digunakan untuk mengevaluasi kualitas
sperma segar atau beku - dicairkan . Namun tes ini tidak cukup untuk menentukan kesuburan
sampel sperma . Sel viabilitas , integritas akrosom dan evaluasi fungsi mitokondria
memungkinkan deskripsi yang lebih akurat kapasitas fertilisasi spermatozoa [ 15 ] . Post-
mencair spermatozoa motil bisa tapi tidak mampu pemupukan akibat kerusakan akrosom [ 43
] . Untuk alasan ini , semua parameter sperma harus dipertimbangkan untuk mengevaluasi
kemampuan kesuburan sperma . Dalam studi ini , motilitas adalah parameter paling tidak
terpengaruh dari pembekuan dibandingkan dengan membran , akrosom dan integritas
membran mitokondria . Integritas akrosom menurun setelah beku tetapi tidak terpengaruh
dari pembekuan tingkat dan extender dan berkisar 18,5-32,2 % untuk kedua SD dan F344
sperma . Hasil ini lebih rendah dari studi Yamashiro et al . [ 57 ] yang melaporkan 89,3 %
integritas akrosom di mKRB extender . Konflik ini mungkin karena klasifikasi utuh dan rusak
spermatozoa . Hasil lain yang menarik terungkap dalam penelitian kami adalah bahwa
extender dan tingkat pendinginan yang tidak sangat efektif dalam melindungi integritas
akrosom dari pembekuan cedera . Selain itu, kami menemukan bahwa integritas membran
sperma dan MMP yang sangat terpengaruh dari pembekuan dibandingkan dengan motilitas .
Selain MMP tarif yang lebih rendah , integritas membran lemah mungkin terlibat dalam
motilitas progresif rendah tikus sperma .
Singkatnya, prosedur pembekuan secara signifikan menurunkan motilitas sperma tikus, tetapi
tidak ada perbedaan antara Sprague Dawley-dan strain F344 tikus. Meskipun SM telah
berhasil digunakan untuk cryopreserve sperma tikus, hal itu tidak memberikan cryoprotection
untuk tikus sperma. Selain itu, hasil menunjukkan interaksi lemah antara Extenders dan laju
pendinginan pada parameter viabilitas sperma tikus. Hasil penelitian kami menunjukkan
bahwa TES extender yang mengandung non-penetrasi CPA (raffinose atau sukrosa) dengan
moderat (40 _C / menit) dan cepat (100 _C / menit) laju pendinginan lebih unggul extender
lain dan tingkat pendinginan diuji.