1 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Judul : Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Penulis : Shivalingappa Venkatesha1, Mourad Toporsian, Chun Lam, Jun-ichi
Hanai, Tadanori Mammoto, Yeon M Kim, Yuval Bdolah, Kee-Hak
Lim, Hai-Tao Yuan, Towia A Libermann, Isaac E Stillman, Drucilla
Roberts, Patricia A DAmore, Franklin H Epstein, Frank W Sellke1,
Roberto Romero, Vikas P Sukhatme, Michelle Letarte & S Ananth
Karumanchi
Publikasi : Nature Medicine, Vol. 12, No. 6 (June)
Tahun : 2006

KONTRIBUSI ENDOGLIN BENTUK LARUT DALAM MENYEBABKAN
PRAEKLAMSIA

Praeklamsia merupakan sindrom hipertensif yang spesifik terjadi pada saat
kehamilan, yang secara signifikan menyebabkan morbiditas serta mortalitas ibu
dan janin. Disfungsi endotel maternal yang diperantarai oleh ekses reseptor VEGF
1 berbentuk larut yang berasal dari plasenta (sVEGFR1 atau sFlt1) muncul
sebagai komponen penting dalam patogenesis penyakit ini. Studi kami
melaporkan bahwa ko-reseptor TGF- bentuk larut baru yang dihasilkan plasenta,
endoglin (sEng), yang mengalami peningkatan di dalam sera individu penderita
praeklamsia, berkorelasi dengan tingkat keparahan penyakit dan mengalami
penurunan setelah kelahiran. sEng menghambat formasi tabung-tabung kapiler
secara in vitro dan memicu permeabilitas vaskular serta hipertensi secara in vivo.
Efeknya terhadap tikus yang hamil semakin diperbesar oleh pemberian sFlt1 di
saat yang sama, yang menyebabkan praeklamsia berat termasuk sindrom HELLP
dan restriksi pertumbuhan janin. sEng merusak pengikatan TGF-1 terhadap
reseptor-reseptornya dan pensinyalan hilir (downstream) termasuk dampak
terhadap aktivasi eNOS dan vasolidasi, yang menunjukkan bahwa sEng
mengakibatkan terdisregulasinya pensinyalan TGF- di vaskulatur. Hasil yang
kami temukan menunjukkan bahwa sEng bekerja secara bersamaan dengan sFlt1
untuk memicu praeklamsia berat.

2 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
Praeklamsia menimbulkan komplikasi pada 5% dari kehamilan di seluruh
dunia dan merupakan penyebab utama mortalitas ibu, janin dan neonatus,
khususnya di negara-negara berkembang. Kondisi ini dicirikan oleh onset
hipertensi dan proteinuria di trimester ketiga kehamilan. Praeklamsia berat dapat
menyebabkan munculnya sindrom HELLP, kejang-kejang (eklamsia), dan/atau
restriksi pertumbuhan janin. Plasenta memiliki peran sentral dalam praeklamsia,
seperti yang dibuktikan oleh menghilangnya gejala-gejala penyakit dengan cepat
setelah kelahiran. Manifestasi klinis praeklamsia merefleksikan disfungsi endotel
yang luas, yang menyebabkan vasokonstrisi, iskemia organ akhir, dan
meningkatnya permeabilitas vaskular. Oleh karena itu, telah terdapat dugaan
bahwa faktor-faktor dalam sirkulasi yang berasal dari plasenta dapat memicu
defek-defek endotel yang membawa pada praeklamsia.
Studi kami dan studi lainnya baru-baru ini menunjukkan bahwa kadar sFlt1
dalam sirkulasi yang tinggi (tirosin kinase berbentuk larut yang menyerupai fms,
juga dikenal sebagai reseptor VEGF 1 bentuk larut) yang berasal dari plasenta
dapat berkontribusi terhadap patogenesis praeklamsia. sFlt1 mengikatkan diri
pada VEG fan faktor pertumbuhan plasental (PlGF) serta menetralisir kerja
proangiogeniknya. Konsentrasi sFlt bersirkulasi yang tinggi, bersamaan dengan
berkurangnya VEGF serta PlGF bebas, tidak hanya terjadi selama praeklamsia,
namun juga sebelum onset gejala-gejala klinisnya. Ekspresi sFlt1 secara berlebih
pada tikus mengakibatkan hipertensi, proteinuria, dan endoteliosis glomerulus,
yang merupakan manifestasi-manifestasi klasik dari praeklamsia. Hal ini
menunjukkan bahwa ekses sFlt1 yang bersirkulasi berpotensi memiliki peran
dalam menyebabkan praeklamsia. Akan tetapi, hewan-hewan yang diberi sFlt1
tidak menunjukkan perkembangan hemolisis dan trombositopenia yang
merupakan tanda-tanda yang terdapat pada sindrom HELLP sebagai sub-jenis
praeklamsia berat. Karenanya, kami menduga bahwa faktor-faktor larut lainnya
dari plasenta bekerja secara bersama-sama dengan sFlt1 dalam menyebabkan
disfungsi endotel yang kemudian mengakibatkan praeklasmia berat.

3 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
Endoglin (Eng) atau CD105, suatu ko-reseptor permukaan sel untuk isoform
faktor pertumbuhan transformasi (TGF)-1 dan TGF-3, diekspresikan dalam
jumlah besar di sel-sel endotel dan sinsitiotrofoblas dan memodulasi kinerja TGF-
1 dan TGF-. Mutasi pada gen yang mengkodekan Eng, yaitu ENG, merupakan
penyebab dasar dari telangiektasia turunan dengan perdarahan tipe 1 (HHT1),
suatu kelainan autosom dominan yang dicirikan oleh malformasi pembuluh arteri
dan kehilangan kapiler secara terpusat. Mencit Eng
-/-
mengalami kematian di
pertengahan kehamilan karena perkembangan angiogenesis dan kardiovaskular
yang defektif, sedangkan mencit Eng
+/-
mengalami perkembangan tanda-tanda
HHT. Baru-baru ini, ditemukan bahwa Eng terlokalisir ke caveolae, dimana Eng
dapat berasosiasi dengan nitrik oksida sintase endotel (eNOS) dan meregulasi
aktivitas serta tonus vaskular lokalnya. Data-data ini menunjukkan keterlibatan
Eng tidak hanya dalam perkembangan kardiovaskular, namun juga dalam
homeostasis vaskular.
eNOS merupakan sintase nitrik oksida (NO) yang diregulasi oleh
Ca
2+
/kalmodulin yang dapat diaktivasi oleh perubahan tekanan cairan dan stimuli
saraf huor. NO yang berasal dari endotelium merupakan vasorelaksan kuat yang
berkontribusi terhadap regulasi tekanan darah sistemik, permeabilitas vaskular,
dan angiogenesis. Memang, efek-efek VEGF terhadap angiogenesis dan tonus
vaskular sebagian diperantarai oleh aktivasi eNOS melalui fosforilasi eNOS
Ser1177 (ref. 20) yang dipengaruhi oleh Akt dan meningkatnya asosiasi eNOS
dengan Hsp90 (ref. 21). Demonstrasi kami yang terbaru dimana sFlt-1 yang
berasal dari plasenta di dalam sera individu penderita praeklamsia dapat
menghambat angiogenesis dan memicu hipertensi pada kenyataannya dapat
merefleksikan terganggunya aktivasi eNOs yang dipengaruhi oleh VEGF.
Regulasi aktivitas eNOS bersifat kompleks, yang melibatkan regulasi dinamik
status fosforilasinya. Meskipun fosforilasi pada Ser1177 mengindikasikan aktivasi
eNOS yang dipicu oleh agonis, namun proses tersebut didahului oleh defosforilasi
pada Thr495. Koordinasi reaksi-reaksi tersebut menentukan aktivitas eNOS di sel-
sel endotel,

4 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
Sekarang kami akan melaporkan bentuk larut Eng (sEng) baru 65 kDa yang
berasal dari plasenta yang terdapat di dalam sera wanita hamil, yang mengalami
peningkatan pada individu penderita praeklamsia, dan semakin meningkat seiring
meningkatnya tingkat keparahan penyakit. sEng bekerjasama dengan sFlt1 untuk
memicu disfungsi endotel in vitro dan penyakit yang menyerupai praeklamsia
berat in vivo. Kami menunjukkan bahwa sEng menginterferensi pensinyalan TGF-
1 dan aktivasi eNOS di sel-sel endotel, sehingga mendisrupsi mekanisme
homeostasis kunci yang penting bagi pemeliharaan kesehatan vaskular.
HASIL
Regulasi naik Eng pada plasenta penderita praeklamsia
Untuk mengidentifikasi faktor-faktor baru dari plasenta yang terlibat dalam
praeklamsia, kami melakukan penyusunan profil ekspresi gen jaringan plasenta
dari wanita hamil normal dan wanita hamil dengan praeklamsia menggunakan
microarray chip Affymetrix U95A. Di samping regulasi naik mRNA yang
mengkodekan sFlt1 dan Flt1 secara mencolok pada plasenta penderita
praeklamsia dibandingkan plasenta dari kehamilan normal (dipasangkan
berdasarkan usia kehamilan), kami mencatat adanya peningkatan empat kali lipat
pada mRNA ENG, yang dikonfirmasi oleh analisis blot utara (northern blot).
Akan tetapi, tidak seperti sFlt1, tidak terdeteksi adanya mRNA ENG yang lebih
pendek atau tersambung. Pewarnaan imun potongan-potongan plasenta
mengkonfirmasi meningkatnya ekspresi Eng, khususnya pada sinsiotrofoblas
plasenta penderita praeklamsia pada minggu ke-25 dan 40 relatif terhadap
kehamilan kontrol yang dipasangkan berdasarkan usia. Analisis blot barat
(western blot) terhadap Eng yang menghasilkan imunopresipitasi plasenta normal
dan plasenta praeklamtik menunjukkan adanya monomer Eng 90 kDa, yang
merupakan karakteristik protein membran plasma integral pada kedua kelompok,
namun dengan kadar yang lebih tinggi pada sampel praeklamtik. Kami juga
menemukan adanya pita 65 kDa yang lebih kecil, yang menunjukkan bahwa
bentuk Eng larut (sEng) dihasilkan oleh plasenta. Ekspresi sEng di plasenta

5 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
penderita praeklamsia empat kali lipat lebih tinggi dibandingkan kehamilan
normal (n=10 per kelompok, P < 0,01). Meskipun baik Eng maupun sEng
teregulasi naik pada praeklamsia, kuantifikasi rasio sEng/Eng pada spesimen-
spesimen plasenta ini tidak menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan
antara sampel normal dan sampel praeklamtik, yang menunjukkan bahwa Eng
maupun sEng meningkat secara proporsional pada praeklamsia.
Peningkatan sEng pada serum berkorelasi dengan tingkat keparahan
praeklamsia
Setelah immunoblotting Eng menghasilkan imunopresipitasi Eng dari sera
pasien-pasien praeklamsia, kami menemukan sebuah pita 65 kDa tunggal. Protein
ini terdapat dalam jumlah yang jauh lebih kecil di dalam sera wanita hamil normal
dan hampir tidak terdeteksi pada wanita yang tidak hamil. Purifikasi sera wanita-
wanita penderita praeklamsia dan analisis dengan spektrometri massa
menunjukkan sejumlah peptida spesifik Eng yang berkisar dari Gly27 hingga
Arg393, yang mengindikasikan bentuk Eng larut (sEng) yang merujuk pada
daerah terminal-N pada protein dengan panjang utuh.
Kenaikan konsentrasi sEng yang kami temukan di dalam sera wanita
penderita praeklamsia menunjukkan bahwa hal tersebut dapat berperan sebagai
penanda diagnostik maupun prognostik bagi penyakit ini. Kuantifikasi konsentrasi
sEng serum oleh ELISA menunjukkan masing-masing peningkatan dua dan tiga
kali lipat pada kehamilan preterm dan aterm djbandingkan kondisi non-hamil,
yang menunjukkan peran bagi sEng selama kehamilan normal. Konsentrasi sEng
pada penderita praeklamsia ringan, praeklamsia berat, dan sindrom HELLP
masing-masing adalah tiga, lima, dan sepuluh kali lipat lebih tinggi dibandingkan
kontrol dengan kehamilan preterm yang dipasangkan berdasarkan usia kehamilan.
Karakteristik klinis dari individu-individu ini ditunjukkan pada Tabel Tambahan 1
(online). Konsentrasi sEng pada wanita-wanita hamil berkorelasi dengan
konsentrasi sFlt1 (R
2
=0,56) kecualli pada kelompok sindrom HELLP, dimana
kadar sEng lebih tinggi dibandingkan kadar sFlt1. Sampel darah dari subset

6 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
wanita yang diperoleh 48 jam setelah pengeluaran plasenta menunjukkan
penurunan 70% pada rerata kadar sEng yang bersirkulasi pada wanita dengan
kehamilan praeklamtik dibandingkan wanita dengan kehamilan normal. Meskipun
data-data ini menunjukkan bahwa plasenta merupakan sumber sEng utama selama
kehamilan, sumber-sumber lainnya seperti vaskulatur maternal tidak dapat
diabaikan.
Efek sEng terhadap fungsi endotel
TGF- dan VEGF merupakan faktor-faktor yang krusial dalam angiogenesis.
sEng rekombinan menghambat pembentukan tabung endotel pada Matrigel in
vitro hingga tahap yang sama seperti sFlt1. Terlebih lagi, sEng memberikan
potensi aksi antiangiogenik sFlt1, sebagaimana terlihat oleh pengurangan yang
lebih banyak dari jumlah struktur yang menyerupai kapiler saat kedua protein
hadir (Gambar 3a). Hal ini memperkirakan bahwa sEng dan sFlt1 menghambat
efek proangiogenik TGF-1 dan VEGF, secara berurutan, yang hadir pada
Matrigel. Permeabilitas kapiler meningkat dalam praeklamsia
22
, dan penderita
praeklamsia lebih rentan untuk mengalami edema periferal dan pulmonari. Oleh
karena itu, kami menguji peran sEng dan sFlt1 dalam permeabilitas mikrovaskular
menggunakan assay biru Evans pada tikus BALB/c yang sebelumnya diobati
dengan sFlt1 yang mengekspresikan adenovirus, sEng, sFlt1+sEng atau protein Fc
tikus sebagai kontrol negatif. Permeabilitas kapiler meningkat oleh sEng dan sFlt1
pada paru-paru, hati, dan ginjal (Gambar 3b). Utamanya, kombinasi sEng dan
sFlt1 menunjukkan efek tambahan pada hati, mengindikasikan bahwa reseptor-
reseptor bentuk larut ini dapat bertindak bersamaan untuk mengganggu integritas
endotel dan memicu kebocoran dan kerusakan vaskular yang besar.
Efek in vivo dari sEng dan sFlt1
Untuk memicu ciri-ciri klinis praeklamsia pada tikus hamil, kami menggunakan
ekspresi adenoviral dari sEng dan sFlt1, sendiri-sendiri atau digabungkan. Pada
hari ke 17-18 kehamilan, data hemodinamika dan biokimia mengindikasikan
bahwa sEng memicu perubahan signifikan dalam tekanan arteri rata-rata / mean

7 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
arterial pressure (MAP), meskipun lebih rendah dari yang teramati pada sFlt1
(Tabel 1). Proteinuria pada tikus yang diobati sEng bersifat sedang, tetapi bersifat
parah pada kelompok tikus yang diobati sFlt1. Kelompok sFlt1 + sEng
menunjukkan proteinuria rentang nefrotik, hipertensi parah dan bukti biokimia
sindrom HELLP (peningkatan laktat dehidrogenase (LDH) dan aspartate
aminotransferase (AST), dan penurunan jumlah platelet). Kami mengamati
penghambatan pertumbuhan janin pada anak-anak yang lahir dalam kelompok
sFlt1 + sEng, kemungkinan terkait dengan iskemia dan kerusakan plasenta (Tabel
1).
Histologi ginjal oleh mikroskop cahaya dan elektron menunjukkan
endoteliosis fokal dalam kelompok sEng dibandingkan dengan kelompok kontrol.
(Gambar 4a dan Gambar Tambahan 1 online). Endoteliosis glomerular parah
teramati dalam kelompok sFlt1 dan sFlt1 + sEng (Gambar 4a dan Gambar
Tambahan 1). Kami mengamati kerusakan vaskular ekstensif dari plasenta,
meliputi infarksi pada sambungan Ibu-janin pada kelompok sFlt1 + sEng, tetapi
tidak pada tikus kontrol atau pada tikus yang diobati dengan salah satu agen
(Gambar 4b). Kami mencatat peradangan yang tersebar pada lapisan sel raksasa
(berhubungan dengan trofoblas invasif manusia) pada kelompok sFlt1 dan sEng,
dan peningkatan peradangan pada kelompok sFlt1 + sEng dibandingkan dengan
kelompok sFlt1 atau sEng. Histologi hati menunjukkan tanda-tanda iskemia dan
area nekrosis pada kelompok sFlt1 + sEng, sama dengan yang terlihat pada
penderita sindrom HELLP (Gambar 4c). Bukti hemolisis pada kelompok sFlt1 +
sEng dipastikan pada noda darah periferal, yang mana kami temukan skistosit dan
retikulositosis (Gambar 4d). Kami juga melihat tanda-tanda kerusakan vaskular
Ibu yang parah setelah injeksi sFlt1 dan sEng bersamaan pada tikus yang tidak
hamil, memperkirakan bahwa fenotip pada tikus hamil berasal dari efek langsung
pada pembuluh maternal dan tidak membutuhkan plasenta (data tidak
ditunjukkan).


8 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
sEng menghambat vasodilasi bergantung NOS yang dimediasi TGF-
Karena efek yang diketahui dari VEGF dalam mengurangi reaktivitas vaskular
melalui aktivasi eNOS dan demonstrasi terbaru bahwa Eng memodulasi aktivitas
vasomotor yang bergantung eNOS
19
, kami menilai efek hemodinamik dari
isoform TGF- dan sEng pada pembuluh mikro ginjal tikus yang diisolasi. TGF-
1 dan TGF-3 memicu peningkatan diameter arteri yang tergantung dosis
(Gambar 5a), sedangkan TGF-2, yang bukan ligan untuk Eng, tidak
menghasilkan vasodilasi yang signifikan (< 2% pada 0,1 dan 1 g/ml). sEng
secara signifikan mengurangi efek TGF-1 dan TGF-3 (Gambar 5a). Efek akut
dari isoform TGF-1 dan TGF-3 pada tonus vaskular belum kami ketahui
sebelumnya dan juga terlihat pada pembuluh mesenterik (Gambar Tambahan 2
online). VEGF dan TGF-1 memiliki efek tambahan pada vasodilasi, yang
dihambat oleh kombinasi sEng dan sFlt1 pada konsentrasi yang tercatat pada
penderita praeklamsia (Gambar 5b).
L
-NAME menghambat vasodilasi yang
dimediasi oleh TGF-1 dan VEGF, mengindikasikan respon yang bergantung
NOS (Gambar 5b). Data-data ini memperkirakan bahwa sFlt1 dan sEng yang
beredar dapat melawan vasodilatasi bergantung NO fisiologis yang ditimbulkan
oleh faktor-faktor pertumbuhan angiogenik ini, berperan dalam perkembangan
hipertensi yang terlihat pada praeklamsia.
sEng menghambat pengikatan dan pensinyalan TGF-1 pada sel endotel
Mengingat bahwa endoglin merupakan koreseptor untuk isoform TGF-1 dan
TGF-3, kami memperkirakan bahwa sEng bekerja dengan mengganggu
pengikatan reseptor permukaan sel. Mem-pra-inkubasikan TGF-1 yang di-
radiolabel dengan rekombinan sEng menurunkan signifikan pengikatannya
terhadap reseptor tipe II TGF- (TRII) pada 50 dan 100 pM (Gambar 5c).
Sehingga, sEng beradu untuk pengikatan TGF-1 terhadap reseptornya pada sel
endotel. Untuk menguji apakah hal ini mengarah pada perusakan pensinyalan,
kami menilai aktivitas konstruksi CAGA-Luc reporter pada sel endotel manusia.

9 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
TGF-1 memicu aktivasi CAGA-Luc reporter yang bergantung pada Smad 2/3,
dan respon ini dibasmi oleh pengobatan dengan sEng (Gambar 5d).
sEng menghambat aktivasi eNOS yang dimediasi TGF-1
Meskipin studi-studi terdahulu telah menunjukkan bahwa paparan kronis sel
endotel terhadap TGF- memicu ekspresi gen dan protein eNOS
23,24
, efek
langsung dari TGF-1 pada aktivasi eNOS belum dicirikan. Karena penemuan
kami bahwa TGF-1 memicu vasorelaksasi yang bergantung NOS pada pembuluh
resisten ginjal dan mesenterik, kami menjelajahi efek langsungnya pada aktivasi
eNOS. Meskipun TGF-1 tidak memiliki efek pada fosforilasi eNOS Ser1177,
TGF-1 memicu defosforilasi signifikan (P < 0,01 terhadap kontrol baseline) pada
Thr495 (Gambar 5e), memperkirakan bahwa TGF- meregulasi status fosforilasi
dari residu kunci yang terlibat dalam aktivasi eNOS. Efek ini diturunkan
signifikan oleh sEng (Gambar 5e).
PEMBAHASAN
Disfungsi endotel Maternal yang disebabkan oleh faktor bentuk larut yang berasal
dari plasenta seperti sFlt1 muncul sebagai komponen utama dalam patogenesis
praeklamsia
25,26
. Kami melaporkan bentuk larut yang asing dari Eng yang berasal
dari plasenta yang hadir dalam sera wanita hamil, yang meningkat pada penderita
praeklamsia dan berkorelasi dengan tingkat keparahan penyakit. Sebagai
tambahan dari potensi penggunaan sebagai biomarker praeklamsia, kami telah
menunjukkan bahwa sEng mengganggu pembentukan tuba endotel in vitro dan
memicu permeabilitas vaskular dan hipertensi in vivo. Utamanya, sEng dapat
bekerja bersamaan dengan sFlt1 untuk meningkatkan disfungsi endotel dan
memicu gejala klinis praeklamsia parah, meliputi perkembangan sindrom HELLP
dan penghambatan pertumbuhan janin. Kami menunjukkan bahwa TGF-1
memicu vasorelaksasi melalui aktivasi eNOS dengan memicu defosforilasi
Thr495, memberikan mekanisme asing untuk vasoregulasi yang bergantung pada
endotelium. sEng mengganggu pengikatan reseptor TGF- dan pensinyalan hilir
pada sel endotel, dan mengurangi aktivasi eNOS. Kami mengusulkan bahwa

10 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
kontribusi sEng dan sFlt1 pada patogenesis praeklamsia Ibu, setidaknya terhubung
dengan penghambatan stimulasi VEGF dan TGF- dari aktivasi NO yang
bergantung pada endotel dan efek vasomotor.
Imunoreaktivitas Eng yang meningkat telah dilaporkan dalam plasma
individu penderita tumor angiogenik
27
, tetapi sifat alaminya masih sulit
dimengerti. Kami telah mencirikan bentuk Eng yang beredar dalam kehamilan
normal dan diregulasi naik dalam praeklamsia. Ketiadaan varian sambungan lain
dalam plasenta dan rangkaian peptida parsial dari sEng yang dimurnikan
memperkirakan bahwa hal itu adalah produk belahan N-terminal dari Eng panjang
penuh. Karena betaglikan, konseptor TGF- lain dengan rangkaian identitas
parsial terhadap Eng, dapat dilepaskan oleh metaloprotease-1 tipe membran /
membrane-type metalloprotease-1 (MT1-MMP)
28
, kami menduga bahwa sEng
dapat dihasilkan oleh mekanisme yang serupa.
Kami menunjukkan bahwa sEng mencegah pengikatan TGF-1 terhadap
TRII pada sel endotel, berakibat pada penurunan pensinyalan. Karena TGF-1
yang beredar dirumitkan oleh peptida yang terkait latensi dan protein pengikat
TGF-1 laten, TGF-1 yang beredar tidak dapat mengikat reseptornya kecuali
diaktifkan. Oleh karena itu ada kemungkinan bahwa sEng hanya menghambat
efek TGF-1 secara lokal, di mana TGF-1 aktif dihasilkan. Karena itulah sEng
tidak akan berakibat pada konsentrasi TGF-1 yang beredar. Ketika TGF-1 aktif
yang beredar diukur dalam kohort wanita hamil kami, TGF-1 tidak dapat
terdeteksi selama kehamilan, memastikan bahwa mayoritas TGF-1 yang beredar
tidak aktif. Meskipun beberapa studi klinis melaporkan perubahan sedang dalam
TGF-1 total yang beredar dalam praeklamsia
2931
, data kami tidak menunjukkan
perbedaan signifikan antara kehamilan normal dan praeklamtik (35,95 ng/ml
dibandingkan 37,74 ng/ml dalam serum, secara berurutan). Eng juga mampu
untuk mengikat ligan famili TGF- lain, seperti aktivin dan BMPs32, meskipun
tidak ada peran fungsional Eng dalam memediasi efeknya yang telah dijelaskan.

11 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
Dalam studi ini, kami mengidentifikasikan efek langsung dari TGF-1 dan
TGF-3 pada reaktivitas vaskular, konsisten dengan kekhususan yang diketahui
dari Eng permukaan sel untuk isoform-isoform ini, sehingga memperkirakan
peran pentingnya dalam vasodilatasi yang bergantung TGF-. Efek ini bergantung
pada NOS dan mendukung penemuan kami bahwa Eng berinteraksi dengan eNOS
dan menstabilkan aktivasinya
19
. Bersamaan, data-data ini memperkirakan peran
penting untuk Eng dalam menghubungkan aktivasi reseptor TGF- terhadap
sintesis NO. Kami telah menemukan bahwa TGF-1 men-defosforilasi-kan eNOS
pada Thr495, lagkah wajib yang penting untuk meningkatkan sensitivitas Ca
2+
dan
aktivitas enzim dan mencegah pelepasan dan produksi superoksida yang berasal
dari eNOS. Meskipun aktivasi eNOS juga melibatkan peningkatan terkoordinasi
dalam fosforilasi Ser1177, hal ini tidak teramati dalam tanggapan terhadap TGF-
1. TGF- dapat secara khusus memodulasi defosforilasi Thr495 dan bersinergis
dengan faktor-faktor seperti VEGF, yang dapat mengaktifkan eNOS dengan mem-
fosforilasi Ser1177. Kami mengamati bahwa TGF- dan VEGF memiliki efek
tambahan pada vasodilatasi bergantung NOS yang secara penuh dibalik oleh sEng
dan sFlt1 pada konsentrasi yang terlihat pada penderita praeklamsia.
Studi fungsional kami memperkirakan bahwa sEng dan sFlt1 bekerja
bersama untuk memicu kerusakan vaskular dan sindrom HELLP dengan
mengganggu pensinyalan TGF-1 dan VEGF, secara berurutan. Satu molekul
yang mungkin terlibat dalam patogenesis hipertensi
33
dan penting pada
pensinyalan VEGF dan TGF-1 adalah NO. Beberapa studi mendukung hipotesis
bahwa penurunan NO yang tersedia secara biologis penting untuk patogenesis
praeklamsia
34
Penghambatan aktivasi eNOS oleh sFlt1 dan sEng memperkirakan
basis molekular untuk peningkatan MAP. Terlebih lanjut, karena TGF-1 dan
VEGF menstimulasi ekspresi eNOS
24,35
, ada kemungkinan bahwa sEng dan sFlt1
menghambat ekspresi eNOS secara kronis dan kelebihan konsentrasinya yang
beredar dapat berperan dalam hipertensi yang ada pada praeklamsia. Efeknya
dalam menurunkan aktivasi eNOS juga dapat berperan dalam peningkatan
permeabilitas vaskular yang teramati pada praeklamsia
36
. Molekul lain yang

12 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
mungkin penting pada patogenesis keadaan prokoagulan dan trombositopenia
pada tikus yang diobati sFlt1 + sEng merupakan faktor antitrombotik prostasiklin
(PGI2). VEGF dan TGF-1 menstimulasi produksi PGI2 bahkan sebelum onset
klinis praeklamsia
40
. Karena diketahui bahwa TGF- memicu produksi VEGF
oleh perisit
41
, juga dimungkinkan bahwa sEng mengganggu fungsi VEGF secara
tidak langsung melalui rusaknya produksi VEGF oleh perisit.
Plasenta wanita penderita praeklamsia parah dicirikan oleh invasi dangkal
sitotrofoblas dan rusaknya peremajaan arteriol spiral. Selama plasentasi normal,
sitotrofoblas menjalani sebuah program pseudovaskulogenesis dengan
memperoleh penanda endotel VE-kaderin dan
v

3
integrin, sebuah proses yang
rusak dalam praeklamsia
42,43
. Plasentasi yang rusak ini dan iskemia yang
menyertainya dianggap peristiwa utama yang berakibat pada elaborasi faktor
bentuk larut ke dalam sirkulasi. Pengobatan kultur eksplan vili dengan antisense
ENG oligonukleotid meningkatkan migrasi dan pertumbuhan trofoblas ke arah
luar
44
, memperkirakan bahwa Eng permukaan sel secara negatif meregulasi proses
ini. Kami menduga bahwa sEng dihasilkan oleh plasenta sebagai mekanisme
kompensasi untuk membatasi efek Eng permukaan sel. Pada praeklamsia,
produksi endoglin permukaan sel yang berlebihan akan berakibat pada
peningkatan sEng dalam sirkulasi Ibu, yang nantinya akan berperan dalam
manifestasi klinis praeklamsia.
Penemuan kami dalam peran sEng pada praeklamsia memiliki implikasi
diagnostik dan terapeutik. Sejalan dengan sFlt1 (referensi 9), sEng yang beredar
mulai meningkat 610 minggu sebelum gejala klinis praeklamsia (S.A.K. & R.R.,
pengamatan yang tidak diterbitkan). Kami berasumsi bahwa uji prediktif yang
mengukur sEng, sFlt1, dan PlGF dalam serum akan memiliki peningkatan
sensitivitas dan kekhususan, dan memberikan alat yang berguna dalam mencegah
mortalitas yang disebabkan praeklamsia. Sebagai tambahan, menetralkan antibodi
pada sEng dan sFlt1 dapat menguntungkan dalam pengobatan praeklamsia.
Antibodi monoklonal terapeutik yang menargetkan Eng permukaan sedang
dikembangkan untuk pengobatan kanker metastatik
45
. Data kami memperkirakan

13 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
bahwa sEng mungkin merupakan jalan lain untuk mengganggu tumor yang aktif
secara angiogenik yang mengekspresikan banyak TGF-. Strategi serupa telah
dilakukan pada rangkaian pensinyalan VEGF menggunakan perangkap VEGF,
sFlt1 yang dimodifikasi yang sedang berada dalam percobaan klinis kanker
46
.
Singkat kata, kami telah menunjukkan bahwa konsentrasi beredar yang
berlebihan dari sEng dan sFlt1 pada penderita praeklamsia berperan pada
patogenesis hipertensi, proteinuria, endoteliosis glomerular, sindrom HELLP dan
penghambatan pertumbuhan janin semuanya tanda-tanda praeklamsia parah.
Memahami regulasi produksi sEng dan sFlt1 pada plasenta dan efeknya pada
fungsi vaskular sistemik dan plasenta seharusnya mengarah pada wawasan yang
lebih baik mengenai peran-perannya selama kehamilan normal dan patogenesis,
prediksi, dan pencegahan praeklamsia.
METODE
Reagen. Kami membeli sEng manusia rekombinan (1587 asam amino,
terhubung dengan daerah ekstrasel Eng permukaan sel), sFlt1 manusia, sEng dan
sFlt1 tikus, TGF-1 dan TGF-3 manusia, VEGF-164 tikus dan VEGF-165
manusia dari R&D Systems. Antibodi monoklonal tikus terhadap Eng manusia
(klon P4A4) dan antibodi poliklonal (H-300) terhadap daerah N-terminal Eng
manusia dari Santa Cruz. Peralatan ELISA untuk manusia dan sFlt1 tikus, dan
sEng rekombinan manusia diperoleh dari R&D systems.
Subjek. Seluruh studi klinis disetujui oleh Beth Israel Deaconess Medical Center
Committee dalam investigasi klinis di mana seluruh subjek direkrut dan diberikan
persetujuan terinformasi. Informasi klinis dijelaskan dalam Tabel Tambahan 1.
Praeklamsia didefinisikan oleh kriteria American College of Obstetricians and
Gynecologists
47
. Penderita sindrom HELLP ditampilkan sebagai kelompok
praeklamsia parah yang terpisah. Sindrom HELLP didiagnosa ketika individu
memiliki trombositopenia (< 100.000 sel/l) dan peningkatan LDH (4600 IU/L)
dan AST (> 70 IU/L). Wanita hamil sehat dimasukkan sebagai kelompok kontrol;
8 orang dengan persalinan prematur bertindak sebagai kontrol umur gestasi.

14 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
Spesimen darah dari 4 wanita sehat yang tidak hamil dalam kelompok usia (3045
tahun) juga dimasukkan. Sampel plasenta diperoleh segera setelah kelahiran.
Sampel plasenta yang digunakan dalam studi ini dipilih secara acak dari
kelompok praeklamsia (ringan, parah, HELLP) dan kelompok kontrol (kelahiran
tepat waktu dan prematur) yang dijelaskan dalam Tabel Tambahan 1, dan satu-
satunya kriteria yang digunakan untuk seleksi adalah kelompok kontrol cocok
dalam umur gestasi terhadap penderita praeklamsia. Serum dikumpulkan pada
saat kelahiran (012 jam sebelum) dan pada 48 jam (8 jam) sesudah kelahiran.
Blot utara, ELISA, blot barat, imunokimia dan imunopresipitasi. Kami
melakukan blot utara, ELISA, blot barat, imunokimia dan imunopresipitasi
sebagaimana dijelaskan dalam Metode Tambahan online.
Pemurnian sEng dan analisis oleh spektometri massa. Kami secara berurutan
memberikan serum (10 ml) dari penderita praeklamsia ke kolom biru CM Affi-gel
untuk membuang albumin dan Sefarosa A protein (Bio-rad) untuk membuang
imunoglobulin. Kami dengan perlahan memberikan aliran 2,5 ml kolom antibodi
monoklonal 44G4 IgG ke Eng manusia, yang terkonjugasi ke Sefarosa. Kami
mengelusi fraksi ikatan dengan 0,02 M dietilamin (pH 11,4) dan segera
menetralkannya dengan 1 M Tris pH 7,8. Kami mengumpulkan fraksi 4 dan 5
dengan peningkatan penyerapan pada 280 nm, menguranginya dengan 10 mM
DTT selama 1 jam pada 57
0
C dan mengalkilasinya dengan 0,055 M
iodoasetomida. Kami kemudian mengolah sampel sepenuhnya dengan tripsin
(1:100). Kami menunda kembali sampel yang telah diliofilisasi pada 0,1% asam
trifluoroasetik dan menginjeksinya ke CapLC (Waters) instrumen kromatografi
cairan performa tinggi. Kami memisahkan peptida menggunakan kolom Nano
Series 75 mm (LC Packings) dan menganalisanya menggunakan sistem Qstar XL
MS/MS. Kami mencari data menggunakan mesin pencari Mascot (Matrix
Science) terhadap basis data protein manusia NCBInr.

15 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
Assay tuba endotel dan eksperimen permeabilitias mikrovaskular. Kami
melakukan assay tuba endotel dan permeabilitas vaskular sebagaimana dijelaskan
dalam Metode Tambahan.
Penghasilan adenovirus. Vektor adenovirus yang mengandung sFlt1 dan Fc telah
sebelumnya dijelaskan
4,48
. Untuk menghasilkan adenovirus sEng, kami
menggunakan Adeasy Kit (Stratagene). Dengan singkat, kami memperkuat sEng
manusia (Thr27Leu586) yang terhubung dengan daerah ekstrasel penuh dengan
PCR menggunakan cDNA manusia yang menyandi (encoding) klon Eng panjang
penuh (Invitrogen) sebagai contoh dan primer berikut: maju 5-
ACGAAGCTTGAAACAGTCCATTGTGACCTT-3 dan mundur, 5-
TTAGATATCTGGCCT TTGCTTGTGCAACC-3. Kami membuat sub kloning
fragmen PCR yang ditingkatkan ke dalam vektor pShuttle-CMV (Stratagene) dan
memastikan ekspresi oleh blotting barat. Kami memperkuat klon sEng yang
dipastikan dalam sel 293T dan memurnikannya pada gradien ketebalan CsCl2
(Qbiogene). Ad-CMV (kontrol) diperoleh dari Qbiogene.
Model tikus praeklamsia. Seluruh protokol hewan disetujui oleh Beth Israel
Deaconess Medical Center Institutional Animal Care dan Komite Penggunaan.
Kami menginjeksi tikus Sprague-Dawley hamil dengan 2 x 10
9
unit Ad-CMV
(kontrol) pembentuk plak, Ad-sFlt1, Ad-sEng atau Ad-sFlt1+Ad sEng secara
intravena. Kami menginjeksikan hewan pada hari 8 atau 9 kehamilan dan
mengukur MAP intrakarotid pada hari 17 18 dalam pengaruh anestesia
sebagaimana dijelaskan sebelumnya
4
. Kami memastikan kadar sFlt-1 dan sEng
yang beredar dengan blotting barat dan mengkuantifikasinya dengan
menggunakan peralatan ELISA yang tersedia untuk umum (R&D Systems). Kami
mengukur albumin urin dengan dipstick standar dan mengkuantifikasinya
menggunakan peralatan ELISA Nephrat (Exocell). Kami mengukur kreatinin urin
menggunakan assay kreatinin Metra (Quidel Corp). Kami mengukur AST dan
LDH menggunakan alat komersil dari Thermo Electron. Kami memperkirakan
jumlah platelet dengan hemositometri (Hemavet 850). Kami mendeteksi skistosit
dengan mewarnai bercak darah periferal dengan warna withWright. Tikus

16 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
terbunuh, anak-anaknya dihitung dan janin dan plasenta setiap tikus ditimbang.
Kami menggunakan ginjal dan plasenta yang diambil untuk histopatologi dan
mikroskopi elektron sebagaimana dijelaskan sebelumnya
4
.
Pengikatan TGF-1 pada sel endotel. Kami memberi label berdasarkan afinitas
pada lapisan mono sel endotel yang bertemu selama 4 jam pada 4
0
C dengan
peningkatan konsentrasi [I
125
] TGF-1 (DuPont NEN) setelah prainkubasi dengan
atau tanpa 2,5 nM sEng rekombinan atau TGF-1 dingin (kelebihan 40 kali lipat),
membersihkannya dan menghubungkan silang dengan disuccinimidyl suberate
(Pierce). Kami melarutkan sel dalam buffer yang mengandung 1% Triton X-100
dan memisahkan ekstrak dalam kondisi penurunan dengan SDS-PAGE pada 4
12% gel
13
. Kami memvisualisasi kadar ikatan [I
125
]TGF-1 terhadap TRII
dengan pencitra fosfor STORM dan mengkuantifikasikannya dengan
densitometri menggunakan piranti lunak Image-Quant.
Aktivasi Smad 2/3 bergantung TGF-1. Kami mentransfeksikan sel endotel
umbilik manusia (HUVECs, Clonetics; passage 3) dengan (CAGA)12-Luc
plasmid (dari K. Miyazano, University of Tokyo) dalam ketiadaan TGF-1
dan/atau sEng dan mengukur aktivitas lusiferase sebagaimana dijelaskan
sebelumnya
49
.
Eksperimen reaktivitas mikrovaskular. Kami melakukan eksperimen
reaktivitas mikrovaskular sebagaimana dijelaskan sebelumnya
4
menggunakan
pembuluh mikro ginjal atau mesenterik tikus (diameter internal, 70150 m).
Dalam seluruh kelompok percobaan, kami menguji respon relaksasi pembuluh
mikro ginjal setelah prakontraksi dengan U46619 (agonis A2 tromboksan)
terhadap 4060% diameter baseline pada tekanan 40 mmHg. Ketika nada yang
tetap telah tercapai, kami menguji respon terhadap TGF-1, TGF-3 atau VEGF
dalam urutan yang terstandarisasi. Kami memberikan seluruh obat-obatan secara
ekstraluminal. Ketika diperlukan, kami mengobati pembuluh lebih awal dengan
sEng, sFlt1 atau 10
5
M
L
-NAME selama 30 menit.

17 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
Fosforegulasi eNOS bergantung TGF-1. Kami menginkubasi sel endotel tikus
yang bertemu dalam media tanpa serum selama 2 jam. Kami menstimulasi sel
dengan TGF-1 dalam hadir dan tidak hadirnya sEng (100 ng/ml) selama 15
menit dan mengekstrak protein dalam 2% buffer SDS yang disuplemen dengan 1
mM Na
8
VO
4
, 10mM Na
4
P
2
O
7
, 25 mM NaF dan penghambat protease
(RocheMolecular Biochemicals). Kami mengkuantifikasi protein dan meng-
imunoblot-nya dengan antibodi poliklonal terhadap eNOS Thr495, Ser1177 atau
antibodi monoklonal khusus untuk eNOS total.
Analisis Statistik. Hasil-hasil ditampilkan sebagai mean s.e.m. dan
perbandingan antara berbagai kelompok dibuat dengan analisis variansi
menggunakan ANOVA. Perbedaan signifikan ditandai dengan P < 0,05.
Catatan: Informasi tambahan tersedia pada situs Nature Medicine.


18 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Gambar 1. Ekspresi mRNA ENG dan Eng dalam plasenta kehamilan normal dan
praeklamtik. (a) analisis blot utara untuk mRNA ENG dari plasenta normal dan
praeklamtik dengan umur gestasi (GA) yang terkait. Kadar RNA ribosoma 18S
digunakan sebagai kontrol muatan. (b) Pewarnaan immunofluorescence ganda
dari Eng (merah) dan aktin otot polos (hijau) ditunjukkan untuk plasenta
praeklamtik dan plasenta kontrol yang terhubung yang berasal dari individu
dengan persalinan prematur. Pembesaran dari asli, x200. (c) Penggambaran blot
barat imunopresipitasi Eng menunjukkan Eng panjang penuh (90 kDa) dan
fragmen yang lebih kecil (65 kDa), yang lebih terlihat dalam plasenta
praeklamtik. Sampel normal dan praeklamtik mewakilkan wanita individu.
Pemuatan seimbang untuk lysate yang digunakan untuk imunopresipitasi
dipastikan oleh blot barat aktin pada lysate yang sama.


19 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia


Gambar 2. Kadar sEng yang meningkat dalam sera dari individu praeklamsia. (a)
blot barat representatif dan grafik imunopresipitasi Eng menunjukkan kadar yang
lebih tinggi dari fragmen (sEng) 65kDa bentuk larut dalam sera wanita
praeklamtik (pada minggu 28, 33 dan 32,2) dibandingkan dengan wanita hamil
normal (pada minggu 34,1, 28,2 dan 39,4; **P < 0,01) dan wanita yang tidak
hamil (

P < 0,01; n = 3 / kelompok). Kadar sEng pada wanita hamil normal lebih
tinggi dibanding yang tidak hamil (##P < 0,01). Ekstrak HUVEC (H) dan sEng
rekombinan manusia bekerja sebagai kontrol positif (90 kDa dan 75 kDa, secara
berurutan). Individu yang cocok untuk usia gestasi dipilih secara acak dari
kelompok normal (prematur dan tepat waktu) dan praeklamsia (parah dan
HELLP) yang dijelaskan dalam Tabel Tambahan 1. (b) sEng dimurnikan dari
serum individu praeklamtik. Fraksi 4 dan 5 yang dielusi dari sefarosa 44G4-IgG
(khusus Eng), dijalankan pad SDS-PAGE dalam kondisi menurun dan diuji oleh

20 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia
blot barat menggunakan antibodi poliklonal terhadap Eng. Fraksi yang dielusi
dipaparkan terhadap analisis spektometri massa (tiga kali), dan peptida yang
diidentifikasi ditebalkan dan digarisbawahi hurufnya dalam rangkaian Eng
manusia. Asam amino 562-586 yang digarisbawahi melambangkan domain
transmembran Eng permukaan sel manusia. Sera dari 10 individu acak dengan
praeklamsia (parah dan HELLP) dalam Tabel Tambahan 1 dikumpulkan. (c)
Hasil ELISA untuk sEng dan sFlt1 dalam sera individu dengan praeklamsia
berbagai taraf, kehamilan kontrol dan 4 relawan sehat yang tidak hamil. *P < 0,05
dibandingkan dengan kontrol prematur, #P < 0,05 dibandingkan dengan
praeklamsia parah. Seluruh individu yang dijelaskan dalam Tabel Tambahan 1
telah dianalisa. (d) Hasil ELISA untuk sEng dalam subset individu hamil (normal,
n=6; praeklamsia, n=11) dijelaskan pada poin c dengan darah yang diambil
sebelum (012 jam) atau setelah (48 jam) kelahiran. *P < 0,05 sebagaimana
dibandingkan dengan sampel T=0. Seluruh individu yang dijelaskan dalam Tabel
Tambahan 1 yang dapat kami peroleh spesimen serumnya 48 jam setelah
melahirkan telah dianalisa.


21 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Gambar 3. sEng menghambat pembentukan kapiler dan meningkatkan
permeabilitas vaskular. (a) Assay angiogenesis dilakukan menggunakan sel
endotel vena umbilik manusia / human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)
dalam Matrigel yang dikurangi oleh faktor pertumbuhan dan dilakukan dengan
hadirnya 1 mg sEng rekombinan, sFlt1 atau keduanya, dan panjang tuba endotel
dikuantifikasi. Eksperiman representatif (n=4) ditunjukkan, dengan panjang tuba
rata-rata (dalam piksel) diindikasikan di bawah panel. Hasil panjang tuba
dikuantifikasi, menunjukkan 62,2% 3,9, 62% 4,1 dan 39,7% 4,2 penurunan
dalam sEng dan sFlt1+sEng, secara berurutan (P < 0,01 dibanding kontrol). (b)
Permeabilitas mikrovaskular dinilai oleh kebocoran biru Evans pada tikus yang
diinjeksikan adenovirus yang mengandung Fc (kontrol), sEng, sFlt1 atau
sFlt1+sEng. Kebocoran biru Evans dikuantifikasi dalam berbagai organ. Data
menunjukkan rata-rata empat eksperimen independen. *P < 0,05 dibandingkan
terhadap kontrol, #P < 0,05 dibandingkan sFlt1 sendiri.


22 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Tabel 1. Data hemodinamika dan biokimia tikus hamil
Data ditulis sebagai mean s.e.m. *P < 0,05 dibandingkan dengan kelompok
kontrol.
a
MAP = tekanan diastolik + 1/3 tekanan denyut.
b
Berat badan janin
merupakan berat rata-rata dari anak-anak untuk setiap kelompok. Ekspresi sFlt1
dan sEng dipastikan pertama kali pada plasma tikus oleh blot barat (Gambar
Tambahan 3) dan konsentrasi yang beredar dikuantifikasi menggunakan
peralatan ELISA yang tersedia untuk umum. Konsentrasi plasma rata-rata sFlt1
pada kelompok kontrol, sEng, sFlt1 dan sFlt1+sEng adalah 0,64 ng/ml, 0,66
ng/ml, 249 ng/ml and 204 ng/ml, secara berurutan. Sama halnya, konsentrasi sEng
dalam keempat kelompok ini adalah 0,39 ng/ml, 129 ng/ml, 0,37 ng/ml dan 123
ng/ml, secara berurutan.


23 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Gambar 4 Perubaham histologis ginjal, plasenta, dan hati dan noda darah
periferal pada tikus hamil setelah pengobatan sEng dan sFlt1. (a) Histologi ginjal
(bagian plastik) kelompok kontrol, sEng, sFlt1 dan sFlt1+sEng. Tikus yang
diobati sEng menunjukkan endoteliosis fokal ringan (mata panah, b) tidak terlihat
dalam glomeruli kelompok kontrol. Tikus yang diinjeksisFlt1 menunjukkan
endoteliosis sedang sampai parah dengan oklusi penuh lumen kapiler. Tikus yang
diobati sFlt1+sEng menunjukkan glomeruli yang sangat bengkak dan menandai
endoteliosis dengan butiran resorpsi protein dalam podosit. Skala ukuran, 50 mm.
(b) Histologi plasenta (warna H&E) dari kelompok kontrol, sEng, sFlt1 dan
sFlt1+sEng. Tikus yang diobati sEng dan sFlt1 menunjukkan peradangan
menyebar (mata panah) pada sambungan Ibu-janin yang tidak terlihat dalam
kelompok kontrol. Ada infarksi perdarahan dan nekrosis fibrinoid dengan
obstruksi lumen pembuluh Ibu (panah) dalam desidua plasenta yang diobati
sFlt1+sEng. Skala ukuran, 200 mm. (c) Histologi hati dalam kelompok kontrol,
sEng, sFlt1 dan sFlt1+sEng. Perubahan iskemik dengan nekrosis multifokal (mata
panah) tercatat dalam kelompok sFlt1+sEng. Kelompok kontrol dan tikus yang
diberikan sEng atau sFlt1 tidak menunjukkan perubahan. Skala ukuran, 200 mm.
(d) Noda darah periferal (Wright stain) dari kelompok kontrol, sEng, sFlt1 dan
sFlt1+sEng. Warna representatif dalam kelompok sFlt1+sEng menunjukkan
skistosit aktif (mata panah) dan retikulositosis (panah). Tidak terlihat hemolisis
dalam kelompok lain.

24 Soluble Endoglin Contributes to Preeclampsia

Gambar 5. sEng rekombinan mengurangi pengikatan TGF-1 dan berpengaruh
pada vasodilasi melalui aktivasi eNOS. (a) Reaktivitas mikrovaskular pembuluh
mikro ginjal tikus diukur dalam hadirnya TGF-1 atau TGF-3 dari 200 pg/ml
sampai 200 ng/ml, dan dengan atau tanpa sEng rekombinan pada 1 mg/ml (n = 4
per eksperiman; *P < 0,05 sebagaimana dibandingkan dengan TGF-1 atau TGF-
3 sendiri). (b) Respon mikrovaskular pembuluh mikro ginjal terhadap VEGF,
TGF-1 (1 ng/ml masing-masing) atau kombinasi keduanya. Efek dari 100 ng/ml
setiap sFlt1 dan sEng dalam respon kombinasi ditunjukkan (n = 4 eksperimen).
Juga ditunjukkan efek penghambatan dari
L
-NAME pada respon yang distimulasi
TGF-1 dan VEGF. (c) Autoradiogram representatif dan grafik menunjukkan
peningkatan bergantung dosis dalam [I
125
]TGF-1 (6100 pM) terikat pada TRII
pada sel endotel tikus. Pengobatan dengan 5 nM sEng rekombinan dengan
signifikan menurunkan pengikatan pada 50 pM dan 100 pM (*P < 0,05
dibandingkan dengan kelompok yang tidak diobati). Kompetisi dengan 40x ekses
TGF-1 dingin dalam sel yang diobati dengan 100 pM [I
125
]TGF-1 menghapus
pengikatan reseptor dan bertindak sebagai kontrol latar belakang (C). (d) Grafik
yang menunjukkan aktivasi konstruksi CAGA-Luc reporter yang bergantung pada
Smad 2/3 yang dipicu TGF- yang ditransfeksikan pada sel endotel vena umbilik
manusia (HUVECs) dan penghambatan oleh pengobatan dengan sEng (n=3
eksperimen, **P < 0,01 dibandingkan dengan kelompok yang tidak diobati sEng).
(e) Blot barat representatif dan grafik (n=4) menunjukkan defosforilasi signifikan
pada Thr495 eNOS setelah pengobatan dengan TGF-1 dan pengurangan oleh
sEng (*P < 0,05 dibandingkan dengan yang tidak diobati). Fosforilasi tidak
berubah pada Ser1177 dan kadar eNOS total tetap konstan selama eksperimen.