Anda di halaman 1dari 23

FITOKIM (Fraksinasi)

FRAKSINASI
Landasan Teori
Fraksinasi adalah suatu proses pemisahan senyawa senyawa berdasarkan tingkat kepolaran.
Jumlah dan senyawa yang dapat dipisahkan menjadi fraksi berbeda beda tergantung pada jenis
tumbuhan. Pada prakteknya dalam melakukan fraksinasi digunakan dua metode yaitu dengan
menggunakan corong pisah dan kromatografi kolom.
Corong pemisah atau corong pisah adalah peralatan laboratorium yang digunakan
dalam ekstraksi cair-cair untuk memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran antara
dua fase pelarut dengan densitas berbeda yang takcampur.
Umumnya salah satu fase berupa larutan air dan yang lainnya berupa pelarut
organik lipofilik seperti eter, MTBE, diklorometana, kloroform, atau pun etil asetat. Kebanyakan
pelarut organik berada di atas fase air keculai pelarut yang memiliki atom dari unsur halogen.
Corong pemisah berbentuk kerucut yang ditutupi setengah bola. Ia mempunyai penyumbat di
atasnya dan keran di bawahnya. Corong pemisah yang digunakan dalam laboratorium terbuat
dari kaca borosilikat dan kerannya terbuat dari kaca ataupun Teflon. Ukuran corong pemisah
bervariasi antara 50 mL sampai 3 L. Dalam skala industri, corong pemisah bisa berukuran sangat
besar dan dipasang sentrifuge.
Untuk memakai corong ini, campuran dan dua fase pelarut dimasukkan ke dalam corong dari
atas dengan corong keran ditutup. Corong ini kemudian ditutup dan digoyang dengan kuat untuk
membuat dua fase larutan tercampur. Corong ini kemudian dibalik dan keran dibuka untuk
melepaskan tekanan uap yang berlebihan. Corong ini kemudian didiamkan agar pemisahan
antara dua fase berlangsung. Penyumbat dan keran corong kemudian dibuka dan dua fase larutan
ini dipisahkan dengan mengontrol keran corong.
Destilasi bertingkat atau fraksinasi adalah proses pemisahan destilasi ke dalam bagian-bagian
dengan titik didih makin lama makin tinggi yang selanjutnya pemisahan bagian-bagian ini
dimaksudkan untuk destilasi ulang. Destilasi bertingkat merupakan proses pemurnian
zat/senyawa cair dimana zat pencampurnya berupa senyawa cair yang titik didihnya rendah dan
tidak berbeda jauh dengan titik didih senyawa yang akan dimurnikan. Dengan perkataan lain,
destilasi ini bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa dari suatu campuran yang
komponen-komponennya memiliki perbedaan titik didih relatif kecil. Destilasi ini digunakan
untuk memisahkan campuran aseton-metanol, karbon tetra klorida-toluen, dll. Pada proses
destilasi bertingkat digunakan kolom fraksinasi yang dipasang pada labu destilasi. Tujuan dari
penggunaan kolom ini adalah untuk memisahkan uap campuran senyawa cair yang titik didihnya
hampir sama/tidak begitu berbeda. Sebab dengan adanya penghalang dalam kolom fraksinasi
menyebabkan uap yang titik didihnya sama akan sama-sama menguap atau senyawa yang titik
didihnya rendah akan naik terus hingga akhirnya mengembun dan turun sebagai destilat,
sedangkan senyawa yang titik didihnya lebih tinggi, jika belum mencapai harga titik didihnya
maka senyawa tersebut akan menetes kembali ke dalam labu destilasi, yang akhirnya jika
pemanasan dilanjutkan terus akan mencapai harga titik didihnya. Senyawa tersebut akan
menguap, mengembun dan turun/menetes sebagai destilat.
Macam macam proses fraksinasi:
a) Proses Fraksinasi Kering (Winterization)
Fraksinasi kering adalah suatu proses fraksinasi yang didasarkan pada berat molekul dan
komposisi dari suatu material. Proses ini lebih murah dibandingkan dengan proses yang lain,
namun hasil kemurnian fraksinasinya rendah.
b) Proses Fraksinasi Basah (Wet Fractination)
Fraksinasi basah adalah suatu proses fraksinasi dengan menggunakan zat pembasah (Wetting
Agent) atau disebut juga proses Hydrophilization atau detergent proses. Hasil fraksi dari proses
ini sama dengan proses fraksinasi kering.
c) Proses Fraksinasi dengan menggunakan Solvent (pelarut)/ Solvent Fractionation
Ini adalah suatu proses fraksinasi dengan menggunakan pelarut. Dimana pelarut yang digunakan
adalah aseton. Proses fraksinasi ini lebih mahal dibandingkan dengan proses fraksinasi lainnya
karena menggunakan bahan pelarut.
d) Proses Fraksinasi dengan Pengembunan (Fractional Condentation)
Proses fraksinasi ini merupakan suatu proses fraksinasi yang didasarkan pada titik didih dari
suatu zat / bahan sehingga dihasilkan suatu produk dengan kemurnian yang tinggi. Fraksinasi
pengembunan ini membutuhkan biaya yang cukup tinggi namun proses produksi lebih cepat dan
kemurniannya lebih tinggi.



Pembahasan

Pada praktikum kali ini kami melakukan fraksinasi terhadap maserat. Fraksinasi sendiri adalah
merupakan suatu metode pemisahan senyawa senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya. Pada
praktikum kali ini kami melakukan fraksinasi menggunakan corong pisah. Corong pemisah atau
corong pisah adalah peralatan laboratorium yang digunakan dalam ekstraksi cair cair untuk
memisahkan komponen komponen dalam suatu campuran antara dua fase pelarut dengan
densitas berbeda yang tak campur.
Metodologi
Alat :
1) Corong pisah.
2) Gelas ukur.
3) Erlenmeyer.
4) Botol vial.
Bahan :
1) H
2
SO
4
5 ml.
2) n - heksan 5 ml dan 15 ml.
3) Etil asetat 5 ml.
4) Kertas pH.
5) NH
4
OH untuk membasahi kertas pH secukupnya.
6) Metanol 5 ml.


Cara Pemakaian corong pisah:
1) Campuran dan dua fase pelarut dimasukkan ke dalam corong dari atas dengan corong keran
ditutup.
2) Corong ini kemudian ditutup dan digoyang dengan kuat untuk membuat dua fase larutan
tercampur.
3) Corong ini kemudian dibalik dan keran dibuka untuk melepaskan tekanan uap yang berlebihan.
4) Corong ini kemudian didiamkan agar pemisahan antara dua fase berlangsung.
5) Penyumbat dan keran corong kemudian dibuka dan dua fase larutan ini dipisahkan dengan
mengontrol keran corong.
Prosedur kerja dengan corong pisah:
Cara kerja seperti biasa, dilihat dalam bagan.
Semua proses dilakukan dalam corong pisah.
Setelah didapat beberapa fraksi, fraksi fraksi tersebut disimpan dalam botol vial.
Simpan.
Daftar Pustaka
http://www.wikipedia.com/corongpisah. Diakses pada tanggal 07 November 2011, pukul 21.55
WIB.
http://hidupituind4h.blogspot.com/2011/01/destilasi.html. Diakses pada tanggal 07 November
2011, pukul 23.13 WIB.









Praktikum Fraksinasi
Ilmu Farmasi : praktikum, bahan makalah fraksinasi, prosedur fraksinasi dll


1. Tujuan
Praktikan diharapkan mampu menguasai prinsip fraksinasi
Praktikan diharapkan mampu melakukan proses fraksinasi
2. Teori dasar
Sebagian besar senyawa kimia ditemukan di alam dalam keadaan tidak murni. Biasanya,
suatu senyawa kimia berada dalam keadaan tercampur dengan senyawa lain. Karena itu,
diperlukan proses pemisahan untuk mendapatkan senyawa murni atau untuk menghilangkan
pengotor yang dapat
mengganggu dalam proses analisis.
Tahapan fraksinasi, pemisahan, dan pemurnian dapat dilakukan dengan macam-macam
teknik yang diantaranya adalah dengan metode kromatografi ataupun kombinasi kromatografi
dengan metode lain. Kadang-kadang dengan satu kali saja dilakukan fraksinasi, misalnya dengan
fraksinasi, misalnya dengan fraksinasi menggunakan teknik ekstraksi cair-cair, dapat diperoleh
suatu senyawa dengan jumlah yang cukup besar yang selanjutnya tinggal dilakukan tahap
pemurniaan, misalnya dengan rekristalisasi yang sederhana. Tapi dalam kenyataannya, sering
kali diperlukan fraksinasi yang berulang-ulang, baik dengan teknik yang sama ataupun
kombinasi dengan teknik fraksinasi lainnya.
Metode pemisahan yang banyak digunakan adalah :
1. Ekstraksi cair-cair
2. Kromatografi, teknik kromatografi yang sering digunakan adalah kromatografi kertas (KKt),
kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas-cair (KGC), dan kromatografi cair kerja tinggi
(KCKT). Tapi pada modul penuntun praktikum ini hanya akan dibahas kromatografi kertas
(KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom (KK), dan kromatografi cair vakum
(KCV).

3. Alat dan Bahan
a) Alat :
Corong pisah
Cawan penguap
Gelas kimia
Tabung reaksi
Water bath
Gelas ukur
Pipa kapiler
Sinar UV
Silica gel
Kertas saring
Alumunium foil
b) Bahan :
Ekstrak pekat
N-butanol
Asam asetat
N-heksan
N-etil asetat
Metanol
Kloroform
Aquadest
4. Prosedur percobaan
Fraksinasi I
Ekstrak pekat + aquadest + N-heksan + Etanol

Dimasukkan kedalam corong pisah, kemudian kocok perlahan-lahan

Selang beberapa saat buang gas dari corong pisah

Didiamkan hingga terjadi pemisahan

Pisahkan komponen-komponen beda fasanya
(fraksi N-heksan dan fraksi residu ekstrak)

Fraksinasi II

Fraksi residu ekstrak + etil asetat

Dimasukkan kedalam corong pisah, kemudian kocok perlahan-lahan

Selang beberapa saat buang gas dari corong pisah

Didiamkan hingga terjadi pemisahan

Pisahkan komponen-komponen beda fasanya
(Fraksi etil asetat dan fraksi residu ekstrak)
Fraksinasi III

Fraksi residu ekstrak + N-butanol

Dimasukkan kedalam corong pisah, kemudian kocok perlahan-lahan

Selang beberapa saat buang gas dari corong pisah

Didiamkan hingga terjadi pemisahan

Pisahkan komponen-komponen beda fasanya
(Fraksi N-butanol dan fraksi residu ekstrak)

Profil KLT

Penjenuhan chamber
Eluen dimasukkan kedalam gelas kimia 1cm dari permukaan

Dimasukkan kertas saring yang telah ditotol ekstrak

Ditutup dengan alumunium foil

Ditunggu hingga eluen meresap keseluruh kertas
KLT

Fraksi yang sudah dipekatkan, masing-masing : fraksi N-heksan, fraksi etil asetat,fraksi N-
butanol dan fraksi air ekstrak

Fraksi yang telah pekat ditotol pada silica gel

Silica gel ditaruh secara tegak lurus di chamber yang telah dijenuhkan

Setelah bercak terbentuk

Keringkan silica gelnya


Diamati bercak yang terbentuk (diamati dibawah sinar UV)


[Oleh Mahasiswa Farmasi Unisba]
Baca Lagi Artikel Lain, Sedot Ilmunya :
Laporan Praktikum dan Makalah
Laporan Praktikum Tablet Kempa Langsung
Laporan Praktikum Isolasi Hespiridin Dari Kulit Buah Jeruk (Citrus aurantufolia)
Laporan Praktikum Kristalisasi, Sublimasi Dan Penentuan Titik Leleh
Laporan Praktikum Supositoria
Laporan Praktikum Emulsi
Laporan Praktikum Isolasi, Identifikasi Dan Konfirmasi Mikroba
Praktikum Pembuatan Sediaan Infus Glukosa
Praktikum Metode Ekstraksi
Laporan Praktikum Sediaan Larutan
Isolasi Fitosterol dari Kedawung
Laporan Praktikum Penentuan Spektrum Kerja Antibiotik
Laporan Kombinasi Antibiotik Tetrasiklin, Ampisilin, dan Kloramfenikol
Teori Praktikum Skrining Fitokimia
Sintesis Aspirin

Oleh: Fauzi Bt










KCV (kromatografi cair vakum)
1. Fraksinasi
Fraksinasi merupakan proses pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak berdasarkan
perbedaan tingkat kepolarannya. Salah satu metode yang dapat digunakan dalam fraksinasi
adalah Kromatografi Cair Vakum (KCV) (Gambar 2). Prinsip dasar KCV ini adalah pemisahan
secara adsorpsi dan partisi yang dipercepat dengan bantuan pompa vakum (Hostettmann dkk,
1997).
Keuntungan KCV dibandingkan dengan kromatografi konvensional terletak pada jumlah fase
gerak yang digunakan. Pada KCV, konsumsi fase gerak hanya 80% atau lebih sedikit
dibandingkan dengan kromatografi konvensional, sedangkan kekurangan metode ini adalah
membutuhkan waktu yang cukup lama (Hostettmann dkk, 1997).
Kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kemasan rapat yang
maksimal, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penyerap lalu divakum
kembali. Kolom dihisap sampai kering dan siap dipakai. Cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang
sesuai, mulai pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan
(Hostettmann dkk, 1997).




KROMATOGRAFI CAIR VAKUM (KCV)

Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu
dengan memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana.
Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya
dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau
alumunium oksida (Ghisalberti, 2008).
Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV.
Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu:
a. Cara Basah
Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam
dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam
kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase
diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al., 2006).
b. Cara kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase
diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya
dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al., 2006).
Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode
seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering (Canell,
1998). Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut
yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom
kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan
fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel
dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk.
Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan
ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker et al., 2006).





































Kromatografi Cair-Vakum dalam Skrining Fitokimia
Jun 8
Posted by admin






1 Votes

Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Merupakan kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum, fase gerak
digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi
dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan maksimum. Alat yang digunakan
terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta
wadah penampung fraksi. Walaupun KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari
pada kromatografi lapis tipis (KLT), KCV tetap ekonomis dalam sisi biaya.
Tumbuhan sambiloto (Andrographis paniculata Ness.)
Sambiloto tumbuh liar di tempat terbuka seperti kebun, tepi sungai tanah kosong yang agak
lembap atau dipekarangan. Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang, bentuk
laset, pangkal runcing, ujung meruncing, tepi rata, permukaan atas hijau tua, bagian bawah hijau
muda, panjang 2-8 cm, lebar 1-3 cm. Bunga berbibir berbentuk tabung, kecil-kecil, warnanya
putih bernoda ungu,. Buah kapsul berbentuk jorong. Perbanyak dengan biji atau stek batang.
Klasifikasi tanaman:
Kingdom : Plantae (tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (berpembuluh)
Superdivisio : Spermatophyta (menghasilkan biji)
Divisio : Magnoliophyta (berbunga)
Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua/dikotil)
Subkelas : Asteridae
Ordo : Scrophulariales
Familia : Acanthaceae
Genus : Andrographis
Spesies : Andrographis paniculata Nees
Sifat-sifat kimia yang dimiliki tanaman sambiloto (Andrographis paniculata Nees ) antara lain
rasa pahit, dingin, masuk meridian paru, lambung, usus besar dan usus kecil. Daun dan
percabangannya mengandung laktone yang terdiri dari deoksiandrografolid, andrografolid (zat
pahit), neoandrgrafolid, 14-deoksi-11-12-didehidroandrografolid, dan homoandrografolid,
flavonoid, alkene, keton, aldehid, mineral (kalium,kalsium, natrium). Asam kersik, damar.
Flavonoid terbanyak diisolasi dari akar yaitu polimetatoksivaflavon, andrografin, pan, ikkulin.
Mono-0-metilwhitin dan apigenin-7,4 dimetileter. Zak aktif andrografoid terbukti berkhasiat
sebagai hepatoprotektor (melindungi sel hati dari zat toksin).
Efek farmakologis yang dimiliki Andrographis paniculata Nees antara lain sebagai bakteriostatik
pada Staphylococcus Aurcus, Pseudomonas aeruginosa. Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae
dan Escherichia Coli. Sambiloto juga efektif untuk pengobatan infeksi in vitro. Andrografoid
menurunkan demam yang ditimbulkan oleh pemberian vaksin yang menyebabkan panas pada
kelinci. Sedangkan andrografolid dapat mengakhiri kehamilan dan menghambat pertumbuhan
trofosit plasenta. Dari segi farmakologi, sambiloto mempunyai efek muskarinik pada pembuluh
darah, efek pada jantung iskenik, efek pada respirasi sel. Sifat kholeretik, anti inflamasi dan anti
bakteri. Komponen aktifnya seperti coandrografolid, deoksiandrografolid dan 14-deoksi-11, 12-
didehidroandrografolid berkhasiat anti radang dan antipiretik.
Khasiat herba Andrographis paniculata Nees antara lain pada penyakit hepatitis, infeksi saluran
empedu, disentri basiler, tifoid, diare, influenza, radang amandel (tonsilitis), abses paru, malaria,
radang paru (pneumonia), radang saluran nafas (bronchitis), radang ginjal (pielonefritis), radang
telingah tengah (OMA), radang usus buntu, sakit gigi, demam, kencing nanah (gonore), kencing
manis (diabetes melitus), TB paru, skrofulderma, batuk rejan (pertusis) sesak nafas, leptospirosis,
darah tinggi, kusta, keracunan jamur, keracunan singking, keracunan tempe bongkrek, keracunan
makanan laut. Kanker, penyakit trofoblas, kehamilan anggur (mola hidatidosa) tumor paru.
Metodologi
Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan
pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Kolom G-3 diisi adsorben sampai setinggi 5 cm,
kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut dilarutkan dalam pelarut organik yang
cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut ditambahkan adsorben dengan bobot sama
dengan bobot ekstrak. Campuran ini digerus sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke
dalam kolom G-3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kapas. Elusi
diawali dengan pelarut non polar dilarutkan dengan kombinasi pelarut dengan polaritas
meningkat.
Sebanyak 50 gram sampel Andrographis paniculata Nees yang telah berupa serbuk diekstraksi
secara maserasi menggunakan 200 ml metanol di dalam labu Erlenmeyer 250 ml. Metode
ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi karena ditinjau dari segi teksturnya yang
lunak, selain itu juga untuk mencegah terjadinya kerusakan komponen kimia yang tidak tahan
terhadap pemanasan. Penyari yang digunakan untuk mengekstraksi adalah metanol, karena
metanol merupakan pelarut yang bersifat semi polar, dengan demikian methanol dapat menyari
komponen-komponen kimia yang sifatnya polar maupun yang sifatnya non polar. Campuran
tersebut lalu digojog kuat setiap 10 menit selama 1 jam setelah itu disaring menggunakan kertas
saring. Filtrat yang didapatkan ditampung, dan ditambah 150 ml metanol kembali. Replikasi ini
dilakukan sebanyak 2 kali.
Filtrat yang diperoleh diuapkan diatas cawan porselen di atas penangas air, hingga didapatkan
volume filtrat 10 ml. Kemudian ambil sedikit cuplikan untuk dilakukan uji Kromatografi Lapis
Tipis (KLT) dan disimpan. Sisa dari cuplikan tersebut lalu ditambahkan 2 gram serbuk silika gel
(adsorben) lalu diuapkan hingga kering. Dalam hal ini, bobot silika gel yang digunakan harus
mempunyai bobot yang sama dengan ekstrak. Dengan demikian, silika gel tersebut akan tersalut
ekstrak. Silica gel yang telah tersalut ekstrak harus diuapkan hingga benar-benar kering, karena
jika tidak kering maka akan merusak proses pemisahannya. Silika gel yang telah tersalut ekstrak
tersebut digerus sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke dalam kolom G-3 sampai
setinggi 5 cm kemudian diratakan dan dipadatkan dengan bantuan vakum. Kemudian di lapisan
paling atas ditutup dengan kapas.
Sebelum vakum dijalankan, pelarut yang kepolarannya paling rendah dituangkan ke permukaan
adsorben kemudian vakum dijalankan. Elusi diawali dengan pelarut yang kepolarannya rendah
lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan (polaritas meningkat) dengan harapan bahwa
komponen kimianya terelusi secara berurutan berdasarkan tingkat kepolarannya.. Oleh karena
itu, Kromatografi Cair Vakum menggunakan tekanan yang rendah untuk meningkatkan lajua
aliran fase gerak. Kolom dihisap perlahan-lahan ke dalam wadah penampung fraksi sampai
kering dengan cara memvakumkannya.
Urutan pelarut yang digunakan adalah sebagai berikut:
Fraksi Pelarut Komposisi Volume (ml)
1 Heksana 100 100
2 Heksana-etil asetat 50:50 100
3 Etil asetat 100 100
4 Etil asetat-metanol 75:25 100
5 Etil asetat-metanol 50:50 100
6 Etil asetat-metanol 25:75 100
7 Metanol 100 100
Variasi fase gerak ini digunakan untuk mendeteksi polaritas sampel. Karena dengan adanya
variasi fase gerak maka akan menyebabkan perbedaan interaksi sampel yang terjerap dan hal ini
akan menyebabkan perbedaan hasil dalam uji kualitatif dengan KLT nanti. Apabila senyawa
sampel tersebut memilliki polaritas yang mendekati bahkan mirip dengan polaritas fase gerak,
maka hal ini akan menyebabkan senyawa sampel banyak yang akan ikut teradsorpsi oleh fase
gerak dan fase gerak yang ditampung tersebut akan banyak mengandung kandungan aktif sampel
dan fase gerak tersebut cocok untuk melarutkan senyawa sampel tersebut ( hal inilah yang
menyebabkan perbedaan variasi sampel saat dilakukan KLT ). Pelarut yang digunakan oleh
kelompok kami adalah no.5 yaitu etil asetat-metanol (50:50).
Setiap fraksi hasil KCV ditampung kemudian dipekatkan untuk selanjutnya dianalisis dengan
menggunakan KLT. Analisis KLT dilakukan dengan menggunakan fase diam lempeng silica gel
GF
254
berukuran 710 cm untuk setiap fraksi dan fase gerak. Pada analisis KLT ini untuk setiap
fraksi dibuat 6 spot yang akan dideteksi dengan menggunakan 6 macam pereaksi semprot.
Deteksi hasil bercak hasil elusi dilakukan dengan dilihat dibawah sinar UV 254 nm, UV 366 nm,
dan dengan 6 macam pereaksi semprot yaitu reagen FeCl
3
; 2,4-DNPH, Dragendorf, vanillin-
asam sulfat, antimony (III) klorida, dan sitroborat.
Fase gerak yang digunakan pada sistem KLT adalah sebagai berikut:
Fraksi Fase gerak Komposisi
1-4 Heksana-Etil asetat 3:2
5-8 Kloroform-Metanol 7:3
9-10 BAW 3:1:1
Elusi dilakukan dengan fase gerak yang berbeda tiap fraksinya sampai mencapai batas akhir.
Deteksi pertama adalah dengan sinar UV 366 nm dan 254 nm. Kemudian lempeng dibagi
menjadi 6 bagian, dan tiap bagian disemprot dengan reagen : FeCl
3
, 2,4-DNPH, dragendorf,
vanilin-asam sulfat dengan pemanasan 105C selama 5 menit, antimon (III) klorida ( sebelum
dan sesudah pemanasan 105C selama 5 menit), dan sitroborat ( dideteksi pada sinar tampak dan
sinar UV 366 nm.
Fungsi dari digunakannya pereaksi semprot ini adalah untuk uji kualitatif senyawa aktif
sambiloto. Fungsi dari pereaksi semprot FeCl
3
adalah untuk mendeteksi adanya gugus fenol pada
tanin atau polifenolat, reaksi positif adanya senyawa ini adalah dengan terbentuknya kompleks
berwarna biru, merah ungu, hijau, atau hitam kuat; pereaksi semprot dragendorf digunakan untuk
mendeteksi komponen alkaloid, reaksi positif dari uji ini adalah dengan ditunjukkan warna
coklat atau jingga-coklat dan merah-jingga dengan latar belakang kuning sampai kelabu;
pereaksi semprot sitroborat digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawa golongan
flavonoid dari glikosida saponin reaksi positif ditunjukkan dengan berpendar di bawah sinar UV
366nm.
Pereaksi semprot Antimon (III) klorida digunakan untuk mendeteksi turunan terpen dari mono
terpen sampai politerpen dan steroid, selain itu dapat juga digunakan untuk mendeteksi glikosida
jantung, saponin, lisnogin. Reaksi positif dari uji ini ditunjukkan dengan bercak berwarna ungu
atau coklat pada sinar tampak, apabila dibawah sinar UV 366 nm umumnya bercak berpendar
ungu merah, biru, dan hijau.
Vanilin-asam sulfat dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa atsiri (terpenoid, fenol dan
turunannya serta fenilpropan) dengan mekanisme abstraksi H
+
sehingga terbentuk senyawa
ikatan rangkap terkonjugasi, peristiwa ini tidak terjadi sekaligus tetapi satu persatu secara
berurutan yang menyebabkan warnanya semakin lama semakin tidak stabil, dapat juga untuk
mendeteksi senyawa saponin yang ditunjukkan dengan adanya bercak berwarna biru, violet biru
atau terkadang berwarna kekuningn bila diamati pada sinar biasa.
Pereaksi semprot 2,4-DNPH dapat digunakan untuk mendeteksi secara kualitatif gugus karbonil
dari keton atau aldehid, hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning. 2,4-NDPH
tidak bereaksi dengan gugus karbonil pada asam karboksilat, amida, dan ester.
Hasil
Hasil analisis dengan KLT fraksi dari KCV untuk masing-masing fraksi adalah sebagai berikut.
1. Fraksi 1
Pada praktikum ini, kelompok kami mendapatkan bagian fraksi pertama yaitu fraksi heksana:etil
asetat (60:40). Fraksi ini bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di
dalamnya juga yang bersifat nonpolar. Serbuk yang di KCV berwarna hijau sehingga cairan atau
fraksi yang didapatkan juga berwarna hijau tua.
Sitroborat adalah pereaksi untuk mengidentifikasi secara kualitatif adanya flavonoid. Jika positif
maka akan berwarna kuning di sinar tampak dan berpendar di UV 366. Pada plat, tidak ada
bercak yang berwarna kuning, tetapi terdapat bercak yang berpendar di UV 366 setelah di
semprot sitroborat. Hal ini menunjukkan bahwa dimungkinkan adanya kandungan flavonoid
pada fraksi ini. Fraksi yang terdapat pada fraksi ini diduga merupakan flavonoid dalam bentuk
bebas dan bukan dalam bentuk glikosidanya karena tersari oleh fase gerak dari KCV yang relatif
nonpolar yaitu heksana-etil asetat (60:40). Jika dalam bentuk glikosida akan bersifat polar dan
akan tersari dengan pelarut polar (like dissolve like). Sedangkan pada sinar tampak, tidak terlihat
warna kuning karena mungkin konsentrasi flavonoidnya sedikit sehingga bercaknya sangat tipis.
2. Fraksi 2
Dengan hasil ini diketahui bahwa ada satu bercak dimungkinkan mengandung tannin atau
senyawa fenolik lainnya karena berwarna orange dibawah UV 366. Selain itu juga positif
terhadap pereaksi semprot dragendroff, 2,4-DNPH, SbCl
3,
Vanilin H
2
SO
4,
dan sitroborat
.
Dengan
demikian fraksi kedua mengandung alkaloid, senyawa nitrogen heterosiklik, atau amina
kuartener, gugus keto atau aldehid, turunan terpena (monoterpen hingga politerpen, steroid),
senyawa minyak atsiri (terpenoid, turunan fenilpropana, dan fenol), senyawa 3,4-dihidroksi
flavon dan 3,4-dihidroksi flavonol.
3. Fraksi 3
Hasil KLT:
Pereaksi Rf
Warna Bercak
Hasil
Tampak 254 366
FeCl
3

0.13 - - Biru -
0.5 - - Biru -
Dragendorf
0.13 - Pemadaman Biru -
0.23 - - Orange -
0.5 - Pemadaman Biru -
0.96 - - Orange -
2,4-DNPH 0.13 - Pemadaman Biru -
0.23 - - Orange -
0.5 - Pemadaman Biru -
0.96 - - Orange -
SbCl
3

0.13 - Pemadaman Biru +
0.23 - - Orange -
0.5 - Pemadaman Biru +
0.96 - - Orange -
Vanilin-H
2
SO
4

0.13 - Pemadaman Biru -
0.23 - - Orange -
0.5 - Pemadaman Biru -
0.96 - - Orange -
Sitroborat
0.13 - Pemadaman Biru +
0.23 - Hitam Orange +
0.5 - Pemadaman Biru +
0.96 - - Orange +
Dari data di atas dapat disimpulkan bahwa pada fraksi dua memberikan reaksi positif pada
senyawa flavonoid dan glikosida saponin serta turunan terpen dari monoterpen sampai politerpen
dan steroid.
4. Fraksi 4
Fraksi 4 dielusi dengan fase gerak kloroform-metanol (7:3) dan pelarut etil asetat-metanol
(75:25). Setelah elusi, terlihat spot berwarna hijau tua dengan Rf 0.9615. Spot ini menyebabkan
peredaman berwarna hijau di bawah UV 254 dan berflouresensi ungu di bawah UV 366 dengan
Rf yang sama.
Fraksi 4 bereaksi positif dengan pereaksi FeCl
3
karena munculnya bercak hijau. Artinya fraksi 4
mengandung gugus fenol dari tanin atau polifenat. Namun fraksi 4 ini bereaksi negatif dengan
pereaksi lain. Sebenarnya fraksi 4 berfluoresensi merah di bawah UV 366 dengan pereaksi SbCl
3

(reaksi positif) tetapi tidak berwarna coklat atau ungu pada sinar tampak seperti yang seharusnya
terjadi jika reaksi SbCl
3
positif. Jadi kemungkinan fraksi 4 mengandung terpen dan turunannya
(monoterpen hingga politerpen dan streroid) tapi hal ini tidak dapat dipastikan karena seharusnya
muncul warna ungu atau coklat pada sinar tampak. Kemungkinan memang ada kandungan terpen
atau turunannya dalam fraksi 4 tetapi jumlahnya sangat kecil sehingga tidak ada warna ungu atau
hijau pada sinar tampak, atau pada fraksi 4 terdapat senyawa yang berfluoresensi merah seperti
terpen dan turunannya tetapi sebenarnya senyawa tersebut bukan terpen, hanya saja sama-sama
berfluoresensi merah setelah disemprot dengan SbCl
3
seperti terpen. Karena pelarut yang
digunakan tidak terlalu polar, maka senyawa nonpolar masih bisa ditemukan dalam fraksi 4
tetapi jumlahnya tidak banyak karena sudah terlarut dalam fraksi-fraksi sebelumnya yang lebih
nonpolar.
5. Fraksi 5
Pada percobaan ini, kelompok kami mendapat fraksi kelima yang menggunakan pelarut pada
KCV etil asetat-metanol (25:75). Pelarut tersebut relatif bersifat polar dibandingkan pelarut-
pelarut sebelumnya, sehingga senyawa yang tersari dari sampel sambiloto adalah senyawa-
senyawa yang bersifat polar. Fraksi yang diperoleh kemudian dipekatkan dan dilakukan KLT
dengan fase gerak Kloroform-Metanol (7:3). Fase gerak ini bersifat nonpolar, sehingga senyawa
yang bersifat polar akan tertahan dalam fase gerak silika gel yang bersifat polar, sedangkan
senyawa nonpolar akan terelusi bersama fase gerak. Dari hasil KLT hanya diperoleh satu bercak
saja dengan nilai Rf 1. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung dalam fraksi
kelima ini kemungkinan adalah senyawa yang nonpolar. Akan tetapi bercak yang dihasilkan
hanya satu, jadi kemungkinan senyawa yang terkandung dalam sambiloto telah tersari pada
fraksi-fraksi sebelumnya yang menggunakan pelarut yang lebih nonpolar.
Bercak tersebut terlihat berfluorosensi hijau dibawah UV 366 dan mengalami peredaman
fluorosensi di bawah UV 254. Setelah disemprot dengan pereaksi semprot FeCl
3
, 2,4-DNPH,
dragendorf, vanilin-asam sulfat dengan pemanasan 105C selama 5 menit, SbCl
3
,

dan sitroborat
sama sekali tidak menunjukkan perubahan. Dalam hal ini bercak mengalami pemadaman pada
UV 254 dan berfluorosensi hijau pada UV 366.
Reaksi dengan pereaksi semprot FeCl
3
adalah positif, terbukti dengan terbentuknya kompleks
berwarna hijau ketika dilihat dibawah UV 366. Hal ini menunjukkan adanya gugus fenol pada
tanin atau polifenolat. Reaksi dengan pereaksi semprot dragendorf menunjukkan hasil negatif
dengan tidak terbentuknya warna coklat atau jingga-coklat. Hal ini menunjukkan tidak adanya
senyawa alkaloid dalam fraksi kelima ini. Reaksi dengan pereaksi semprot sitroborat positif
ditunjukkan dengan berpendar hijau di bawah sinar UV 366 yang menunjukkan keberadaan
senyawa golongan flavonoid. Dengan pereaksi semprot SbCl
3
reaksi positif dibawah sinar UV
366, bercak berpendar hijau yang menunjukkan adanya senyawa terpen dan turunannya.
Sedangkan dengan pereaski semprot Vanilin H2SO4 bereaksi negatif yang menunjukkan tidak
adanya senyawa minyak atsiri (terpenoid, turunan fenilpropana, dan fenol). Sedangkan dengan
pereaksi semprot 2,4-DNPH bereaksi negatif, yang menunjukkan tidak adanya gugus karbonil
dari keton atau aldehid. Dari hasil KLT tersebut dapat disimpulkan bahwa kemungkinan dalam
fraksi kelima dari ekstrak sambiloto ini mengandung senyawa fenolat atau polifenol, flavonoid,
turunan terpen, akan tetapi tidak mengandung senyawa alkaloid, senyawa atsiri (terpenoid,
turunan fenilpropana, dan fenol), dan gugus karbonil dari keton atau aldehid.
6. Fraksi 6
Pada filtrat fraksi 6 yang didapatkan, kemungkinan tinggal sedikit senyawa fenolik yang ada.
Jika terdapat senyawa fenolik, maka akan terjadi tailing saat dielusi dan dapat dilihat di bawah
sinar UV. Apalagi, pada percobaan, penguapan dilakukan dengan panas dengan dialiri udara
dengan kipas angin. Maka, fenolik akan teroksidasi dan membentuk mulai dari difenol samapi
polifenol dan menyebabkan tailing. Dari semua pereaksi semprot yang digunakan, hanya
didapati bercak pada penyemprotan dengan reagen sitroborat, yaitu bercak fluoresensi ungu
muda, baik pada UV 254 nm maupun 366 nm dengan Rf 0.0641. Warna ini tidak menunjukkan
hasil positif untuk reagen sitroborat, maka tidak terdapat senyawa metabolit yang dapat
terdeteksi oleh sistem yang digunakan pada fraksi 6. Tidak didapatkannya bercak yang pasti
nyata mungkin terjadi karena senyawa metabolit telah banyak larut di fase nonpolar. Sedangkan
untuk metabolit polar, fase gerak yang digunakan masih kurang polar (kuat) untuk mengelusi.
Dimungkinkan, metabolit polar akan larut di metanol murni pada fraksinasi kelompok terakhir
(fraksi 7). Kemungkinan lain adalah didapatkannya hasil negatif palsu akibat kurang pekatnya
fraksi yang dielusi pada KLT, sehingga keberadaan senyawa tersebut secara kualitatif tidak
terdeteksi.
7. Fraksi 7
Dari percobaan, didapat data sebelum disemprot pada pengamatan dengan sinar tampak, hasil
elusi menghasilkan warna hijau kecoklatan. Pada pengamatan pada UV 254 nm pun tidak
tampak adanya bercak di ke enam totolan pada plat KLT. Sedangkan pada pengamatan di bawah
sinar UV 366 nm, tampak adanya peredaman bercak yang berjarak 2 cm dari totolan awal.
Semua totolan (6 totolan) memiliki bercak dengan Rf yang sama yaitu 0,25.
Setelah disemprot, pada sinar tampak tidak tampak bercak di sepanjang plat KLT. Dari ke enam
totolan tidak ada bercak yang dihasilkan. Pada pengamatan pada UV 254 nm pun tidak tampak
adanya bercak di ke enam totolan pada plat KLT baik sebelum atau sesudah dilakukan
pemanasan pada pereaksi semprot yang membutuhkan pemanasan. Sedangkan pada pengamatan
di bawah sinar UV 366 nm, tampak adanya peredaman bercak yang berjarak 2 cm dari totolan
awal pada bagian yang disemprot dengan pereaksi semprot sitroborat. Rf dari bercak tersebut
adalah 0,25. Adanya peredaman ini, menunjukkan tidak adanya kandungan flavonoid dalam
sampel uji (ekstrak daun sambiloto).
Pada proses fraksinasi, pelarut yang digunakan adalah metanol dengan komposisi 100%. Dari
semua komposisi pelarut yang digunakan, komposisi metanol 100% merupakan pelarut yang
paling polar. Fraksi yang didapat merupakan hasil fraksinasi yang paling akhir. Karena pelarut
yang digunakan merupakan pelarut yang paling polar, maka senyawa-senyawa yang polar yang
akan terfraksinasi. Namun, hasil percobaan yang kurang memuaskan yaitu hanya keberadaan
flavonid saja yang teridentifikasi mungkin disebabkan karena fraksi metanol yang di dapat
merupakan fraksi terakhir sehingga, senyawa-senyawa polar yang terkandung banyak yang telah
terfraksinasi pada pelarut-pelarut sebelumnya. Selain itu, senyawa-senyawa nonpolar juga tidak
atau sedikit sekali yang terfraksinasi karena pelarut yang digunakan bersifat polar.
Dari hasil diatas dapat disimpulkan sebagai berikut :
FRAKSI FeCl
3
Dragendorf 2,4-DNPH SbCl3 Vanilin-
H2SO4
Sitroborat
1 - + - + - +
2 + + + + + +
3 - - - + - +
4 + - - - - -
5 + - - + - +
6 - - - - - -
7 - - - - - -
Dengan demikian berdasarkan skrinning fitokimia yang telah dilakukan dapat dikatakan bahwa
secara umum tanaman sambiloto mengandung tanin atau senyawa polifenolat yang mengandung
gugus fenol. Sambiloto juga mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, serta senyawa terpenoid
dan turunannya yang bersifat nonpolar karena hanya terlarut pada fraksi awal hasil KCV dimana
pelarut-pelarut yang digunakan relatif bersifat nonpolar.
Kesimpulan
1. Pelarut yang digunakan pada KCV untukm fraksinasi dari fraksi kelima adalah etil asetat-metanol
(25:75) yang relatif bersifat polar.
2. Fraksi kelima bereaksi positif terhadap pereaksi semprot FeCl3, SbCl3, dan sitroborat. Akan
tetapi bereaksi negatif terhadap pereaksi semprot Dragendorff, 2,4-DNPH, dan Vanilin-H2SO4
3. Berdasar hasil KLT pada fraksi kelima terkandung senyawa fenolat atau polifenol, flavonoid,
turunan terpen, akan tetapi tidak mengandung senyawa alkaloid, senyawa atsiri (terpenoid,
turunan fenilpropana, dan fenol), dan gugus karbonil dari keton atau aldehid.
4. Secara umum hasil KCV daun sambiloto menunjukkan bahwa daun sambiloto mengandung
senyawa-senyawa yang sifatnya relatif nonpolar karena senyawa-senyawa tersebut lebih
terlarut pada fraksi-fraksi awal dimana pelarut yang digunakan mempunyai sifat nonpolar.
5. Berdasarkan percobaan, daun sambiloto secara umum mengandung senyawa tanin atau
senyawa polifenolat yang mengandung gugus fenol, senyawa terpenoid dan turunannya,
senyawa flavonoid, serta alkaloid.
Daftar Pustaka
http://www.erowid.org/archive/rhodium/chemistry/equipment/dry-
column.vacuum.chromatography.html
Harborne, J.B, 1987, Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan,
diterjemahkan oleh Dr. Kosasih Patmawinata dan Dr. Iwang Soediro, ITB, Bandung.
Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Penerbit ITB : Bandung.
Wagner H.,S. Bladt and EM. Zgainski, 1984, Plant Drugs Analysis., Springer-Verlag., Berlin
Oleh: Alwi Isnandar, Tedo Haris Candra, Aditya Wardhana (file nemu di komputer ccrc, terus
tak upload deh)