DESARROLLO EMBRIONARIO DE PECES ANUALES

Expresión de genes relacionados con la

reproducción
Docentes: Nibia Berois,
Autores*: Magdalena Benítez, Jennyfer Martínez, Mathías Martínez, Lourdes Rariz, Mauro Rodríguez Nicolás Papa,
(en orden alfabético) Silvana D’Alessandro
Departamento de Biología Celular y Molecular
Sección Biología Celular
INTRODUCCIÓN
Uno de los propósitos de nuestro Seminario fue hacer un seguimiento de los diferentes estadios del desarrollo
embrionario de Austrolebias charrua; especie con ciclo de vida anual perteneciente al orden Cyprinodontiformes. C

Esta especie habita en masas de agua dulce temporales de Uruguay y sur de Brasil, las cuales se secan durante el A
verano, lo que provoca la muerte masiva de la población adulta. En cambio, sus embriones sobreviven quedando V
Pn
enterrados en el sustrato, ya que poseen la capacidad de resistir la desecación, eclosionando en la siguiente
estación lluviosa. Su desarrollo embrionario presenta características únicas, que lo diferencian de peces
teleósteos no anuales: una fase de dispersión-reagregación de blastómeras interpuesta entre los estadios de
segmentación y organogénesis así como la capacidad de experimentar detenciones en el desarrollo en tres Z

momentos bien definidos (diapausas) (Wourms, 1964).

Luego de reconocer y estudiar la morfología de los diferentes estadios del desarrollo embrionario, así como EP

también la de adultos, nos aproximamos a un análisis molecular utilizando las técnicas de RT-PCR. El grupo de 100 μm

investigación en el cual desarrollamos el Seminario utiliza estas técnicas con el fin de demostrar el posible rol del
gen dmrt1bY/DMY en la determinación del sexo. Este gen fue caracterizado en Oryzias latipes (medaka) en el año B
MATERIALES
2002 por dos grupos de investigación, Y MÉTODOS
Nanda et al. (dmrt1bY) y Matsuda et al. (DMY).
B
Comenzamos con la observación de los adultos en el acuario y estudiamos su
comportamiento durante la etapa reproductiva. Los huevos se encuentran en la turba (lugar
donde la hembra y el macho liberan sus gametos produciéndose la fecundación); extrajimos
los huevos con pipetas Pasteur depositándolos en cajas de cultivo. Luego de limpiarlos con
pinceles los observamos en microscopios para reconocer en que estadios se encontraban y
los detallamos en planillas para su seguimiento. Fotografiamos los diferentes estadios 100 μm

utilizando un microscopio con cámara incorporada Olympus-Vanox. Ubicamos los embriones

en placas de cultivo en solución de Yamamoto (NaCl: 7.5 gr.; KCl: 0.2 gr.; CaCl2.H2O: 0.3 gr.;
C
penicilina G: 0.060 gr./lt agua destilada), y los llevamos a la estufa de cultivo a 25°C. Luego V
C

hicimos un seguimiento del desarrollo de los embriones a lo largo de varios días y

fotografiamos diferentes estadios. Observamos embriones en etapas más avanzadas,
actualmente en cultivo en el laboratorio, para poder diferenciar los últimos estadios del
desarrollo. B

A partir del ARN total aislado de embriones de A. charrua se procedió a la síntesis de ADNc
(retrotranscripcion) y al control de la calidad del mismo mediante la amplificación por PCR 100 μm
EP
utilizando cebadores para el gen de actina. Asimismo analizamos los productos de PCR
obtenidos utilizando cebadores para DMY (Matsuda el al, 2002).Para interpretar los resultados
D
de las PCR realizamos electroforesis en geles de agarosa.
B

RESULTADOS
100 μm
Figura 1. Macho de Austrolebias Figura 2. Hembra de Austrolebias
charrua charrua
Los estadios del desarrollo de E
Productos de PCR utilizando oligos de actina Productos de PCR utilizando oligos para DMY (Matsuda et al, 2002)
A. charrua se presentan en la
figura 3 y 4. Se destaca la 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Oligos
B

Oligos
etapa especial de dispersión- RSA-1: 5´GCC GGT TTT GCT GGA GAT GAT 3´
RSA-2: 5´ATG GCAGGG GTG TTG AAG GTC3´
PG17.19: GAA CCA CAG CTT GAA GAC CCC GCT GA
PG17.20: GCA TCT GCT GGT ACT GCT GGT AGT TG G

reagregación (flechas)

A partir de la imagen obtenida 1.- ADNc 0-10 somites

del gel para actina (Fig. 5a),
corroboramos que el ADNc
correspondiente a embriones
de 0-10 somites es
funcionante, no así el de 10-20
somites. En el mismo gel se
constató que la muestra de
ARN extraída inicialmente no
estaba contaminada con ADN
1.- ADNc pre-eclosión
100 μm
2.- ADNc 10-20 somites
2.- ADNc + 30 somites
3.- ARN total 0-10 somites
3.- ADNc 20-30 somites
4.- ARN total 10-20 somites
4.- ADN genómico O. latipes F
5.- control negativo mix
6.- marcador pares bases
5.- control negativo mix
6.- marcador pares bases
Figura 5. (a) Productos de PCR utilizando oligos de actina ; la flecha señala la banda de
actina (b) Producto de PCR utilizando oligos para DMY (Matsuda et al, 2002). Los carriles
1-3 muestran las 2 bandas presuntamente correspondientes a la secuencia DMY
100 μm

genómico. En el gel obtenido

Figura 3. (Columna
de la electroforesis de Izquierda) Primeras
productos de PCR utilizando etapas del desarrollo.
oligos para DMY se verifican 2 (A) Estadio de 1 célula. (B)
bandas en todos los estadios Estadio de 2 células. (C)
Estadio de 8 células. (D)
(Fig. 5b). Estadio de 32 a 64 células.
Comparando los diferentes estadios con otros peces anuales y no anuales, pudimos observar que A. charrua
DISCUSIÓN Y PERSPECTIVAS
presenta un patrón de desarrollo similar al descrito para otras especies del género Austrolebias durante el
Las blastómeras
observan en el polo animal.
se

(E) Migración de las

cual se presenta una serie de diapausas especificas del modelo (Arezo et al, 2005). En este género, la blastómeras hacia el polo
diapausa III parece ser obligatoria y observamos las consecuencias que su escape representa para el fenotipo vegetal. (F) Dispersión.
de especímenes de laboratorio (Papa, com. pers.).El análisis y seguimiento del desarrollo nos permitió Nótese las formas
aprender una herramienta morfológica aplicable al estudio de especies de peces que carecen de datos al geométricas de las células
(flechas). B: blastómeras;
iniciar una investigación. C: corion; EP: espacio
Con respecto al gen DMY se estima que el gen parálogo dmrt1bY/DMY se originó, hace unos diez millones de Figura 4. (Columna derecha)
perivitelino; Pn:
años, de una duplicación a partir de dmrt1 autosómico en dos de las especies del género Oryzias: O.latipes y Etapas
pronúcleos;mediasG: y tardías
gota
O. curvinotus. Este gen se encuentra específicamente localizado en el cromosoma Y, siendo el único gen del desarrollo.
lipídica; V: vitelo; Z: zigoto(A)
Reagregado temprano. En el
funcional en el locus SD (sex-determining locus) (Matsuda et al., 2002) y no se expresa en hembras. En recuadro superior se observa
adultos, se expresa exclusivamente en las células de Sertoli testiculares (Nanda et al., 2002). a mayor aumento la
El grupo de investigación en el cual desarrollamos el presente Seminario, se ha planteado la posible expresión aglomeración de
blastómeras.; RT. G: gota
del gen DMY durante las etapas tempranas del ciclo de vida en A. charrua. Estos estudios se enmarcan en el lipídica. (B) Reagregado
análisis de los mecanismos de determinación del sexo en peces anuales y los resultados aquí presentados medio; RM. G: gota lipídica.
forman parte de los análisis en curso. Aumenta la densidad celular
en el reagregado. Las células
se tornan redondeadas. (C)
Reagregado tardío; RTa.
Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. Molecular Biology of the cell. New York and London: Garland Science; 2002
lating Proteins, DNA and RNA
ro, S., Papa, N., Sà, R., Berois, N. Sex Differentiation pattern in the annual fish Austrolebias charrua (Cyprinodontiformes: Rivulidae). Tissue and Cell 2007; 39: 89-98.
Berois, N. Early development in the annual fish Cynolebias viarius. Journal of Fish Biology (2005) 66, 1357-1370. AGRADECIMIENTOS
a, Y., Shinomiya, A., Sato, T., Matsusa, C., Kobayashi, T. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 2002; 417: Se agradece
559-563. la colaboración de la Lic. Nuria Lahuerta por
ornung, U., Asakawa, S., Winkler, C., Shimizu, A., et al. A duplicated copy of DMRT1 in the sex-determining region of the Y chromosome of the medaka, Oryzias latipes. PNAS. 2002; 99: 11778-11783
la gentil colaboración en el armado de las fotos de los embriones