Acu A Porinas

Acuaporinas
Relevancia fisiolgica y estructural como

canal doble de agua y iones

2013
CTEDRA DEL CURSO DE FISIOLOGA
HUMANA:
Jefe de Ctedra:
Mdico Neil Flores Valdez Mdico Internista
Mdico Encargado del Seminario:
Mdico Mauricio Vsquez
Estudiante encargado:
Bruno lvaro Cruz Sosa

ACUAPORINAS Relevancia Fisiolgica y Estructural

Bruno lvaro Cruz Sosa (2012-36788)

1
Contenido
Estructura, funcin y relevancia translacional de acuaporinas como canales dobles de agua y iones ................ 2
1. Canales Inicos de acuaporinas ............................................................................................................. 3
1.1. Aquaporin-0, el canal MIP del cristalino ......................................................................................... 4
1.2. Nodulina 26 de la Soya .................................................................................................................. 7
1.3. Acuaporina 1 .................................................................................................................................. 8
1.4. Drosophila Big Brain ...................................................................................................................... 9
1.5. Acuaporina 6 ................................................................................................................................ 10
2. Bases moleculares de los canales inicos Acuaporinas, compuertas y conductancia ......................... 11
2.1. El Poro central inico ................................................................................................................... 11
2.2. Funcin del carboxilo terminal como dominio modulador: ........................................................... 13
2.3. El papel del bucle D como un dominio de compuerta .................................................................. 14
3. Papel fisiolgico de los canales inicos de acuaporinas ...................................................................... 16
3.1. Papel inesperado de canales de acuaporinas ............................................................................. 16
3.2. Nuevas estrategias de investigacin ............................................................................................ 17
Aquaporin 2: Desde el descubrimiento de la estructura molecular .................................................................... 20
y las implicaciones mdicas............................................................................................................................... 20
1. Introduccin: ......................................................................................................................................... 20
2. Descubrimiento de la AQP2, canal de agua regulado por vasopresina ................................................ 21
3. Acuaporina 2 humana:.......................................................................................................................... 23
4. Estructura y funcin de la AQP2 ........................................................................................................... 24
5. Funcin fisiolgica de AQP2 en el cuerpo: ........................................................................................... 26
a) Localization of AQP2 in the body ..................................................................................................... 27
b) Un jugador clave en la concentracin de la orina ............................................................................. 28
c) Funcin de la AQP2 fuera del rin ................................................................................................. 29
6. Regulacin de la AQP2 ........................................................................................................................ 30
6.1. Sntesis de la Protena ................................................................................................................. 31
6.2. Fosforilacin................................................................................................................................. 32
6.3. Complejo de la protena vinculante y el la translocacin ............................................................. 33
6.4. Endocitosis y degradacin ........................................................................................................... 35
6.5. La actividad del canal de cada molcula de AQP2 ...................................................................... 36
Las acuaporinas en el descubrimiento de frmacos y la farmacoterapia .......................................................... 37
1. Introduccin .......................................................................................................................................... 37
2. Acuaporinas como blanco de drogas en el Rin: ............................................................................... 41
Conclusiones ..................................................................................................................................................... 43
Bibliografa ......................................................................................................................................................... 44



2
Estructura, funcin y relevancia translacional de acuaporinas como canales
dobles de agua y iones

RESUMEN

Se ha asumido que las acuaporinas son selectivas solo para el agua, y
aquaglyceroporins son aceptadas como el transportador de agua y solutos pequeos
sin carga como el glicerol. Esta revisin presenta una vista ampliada de las
acuaporinas como canales con mecanismos ms complejos de regulacin y un
diverso repertorio de permeabilidad del sustrato que se aprecia inicialmente en el
pronto establecimiento del campo. Es probable que el papel de las acuaporinas como
canal dual de agua y canales inicos abiertos tenga relevancia fisiolgica y
potencialmente de traslacin, y se puede evaluar con herramientas moleculares y
farmacolgicas recin desarrollado.

Actividad de los canales inicos se ha demostrado para Acuaporinas -0, -1 y -6,
Drosphila Big Brain, y plant nodulina-26. Aunque el concepto de la funcin del canal
inico en las acuaporinas sigue siendo controversial, los avances de investigacin
estn comenzando a definir no slo la funcin de los canales inicos, sino tambin los
mecanismos moleculares detallados que regulan y median las capacidades
multifuncionales. En cuanto a la importancia fisiolgica, la ventaja adaptativa de la
expresin de la actividad de los canales inicos en las acuaporinas, que implica la
conservacin de la secuencia de aminocidos de los dominios de compuerta del canal
inico, sugiere que proporcionan ms de agua o glicerol y transporte de solutos. Los
canales dobles de iones y agua son de inters para la comprensin de la modulacin
de los gradientes de fluidos transmembrana, la regulacin del volumen, y la posible
transduccin de seales en los tejidos que expresan clases de acuaporinas que
tienen la capacidad de doble funcin. Otras clases de acuaporinas se pueden
encontrar en el trabajo futuro para tener actividades de los canales inicos, en espera
de la identificacin de las posibles vas de sealizacin que podran regir la activacin.



3
Opiniones sobre la investigacin de
acuaporinas tradicionalmente
comienzan con una simple clasificacin
binaria de las familias de los canales
en: acuaporinas y acuagliceroporinas.
Se supone que las acuaporinas son
selectivos para el agua sola, y
acuagliceroporinas se aceptan como
transportadores de una gama ms
amplia de otros solutos como glicerol.
Esta opinin ha sido til para la
elaboracin de las primeras etapas de
la investigacin de acuaporinas, pero
una visin global de los progresos
recientes muestra que una amplia vista
de las acuaporinas es oportuna. La
perspectiva completa debe tener en
cuenta un mayor grado de complejidad
en los mecanismos de regulacin y
ms repertorio de permeabilidad del
sustrato en las clases de acuaporinas
que podra haber sido apreciados
durante el pronto establecimiento del
campo. En particular, el papel de las
acuaporinas como canales inicos
abiertos, adems de sus papeles como
canales de agua, es probable que
tenga relevancia fisiolgica y
potencialmente translacional. Aunque
el concepto de la funcin del canal de
iones en acuaporinas sigue siendo
controversial, los avances de
investigacin estn comenzando a
definir no slo la funcin de los canales
inicos, sino tambin los mecanismos
moleculares detallados que rigen y
median las capacidades
multifuncionales. Con respecto a la
relevancia fisiolgica, el beneficio de
adaptacin de la expresin de las
acuaporinas no es evidente en todos
los tipos de clulas, y sugiere que
proporcionan ms que el agua o el
transporte de glicerol solo. En los
tejidos que expresan clases de
acuaporinas que tienen canales dobles
de iones y de agua, modulacin de
gradientes transmembrana que podra
aumentar la funcin del canal de agua,
o como en el caso de la acuaporina
relacionada al canal de Drosophila Big
Brain podra ser la funcin principal, ya
que no hay actividad del canal de agua
osmtica es evidente en el canal de
tipo salvaje.

1. Canales Inicos de acuaporinas
Las acuaporinas (AQPs) forman
parte de una gran familia de
protenas principales intrnsecas,
MIP. Durante las ltimas dos
dcadas, la actividad del canal de


4
iones se ha demostrado para varias
clases de MIP, aunque el papel
fisiolgico de los canales inicos de
acuaporina in vivo queda por
determinar. Los mecanismos de
activacin, los determinantes
moleculares de propiedades
funcionales y selectividad inica
difieren entre tipos de canales
inicos de acuaporinas,
argumentando en contra de
explicacin de los resultados como
simplemente un efecto genrico de
fugas debido a la presencia de la
protena exgena. Una combinacin
de electrofisiologa y mutagnesis ha
demostrado ser til en la definicin
de los dominios moleculares
implicados en la compuerta y la
modulacin de la actividad de canal
inico AQP, dentro del subconjunto
encontrado hasta ahora para tener la
capacidad de conductancia inica.
En AQP1, el poro central en el eje de
simetra se cuadriplica en el
tetrmero y se ha propuesto como la
va ms probable para la conduccin
de cationes. En contraste, los flujos
de agua son aceptados debido a que
estn mediados por poros separados
y distintos que se encuentran en
cada una de las subunidades del
tetrmero. En otras AQPs tales
como AQP6 y Drosophila Big Brain,
el posible papel de los poros dentro
de la subunidad como vas de
conductancia inica es consistente
con la idea de que un repertorio
diverso multifuncional se expresa a
travs de la familia de canales de
MIP (fig. 1).

1.1. Aquaporin-0, el canal MIP del
cristalino

AQP0 el principal componente
proteico de las uniones
aisladas del cristalino, cuando
se reconstituye en bicapas se
ha demostrado que tiene
actividad de canal inico. Sin
embargo, otros grupos han
informado de la ausencia de un
cambio en la conductancia
inica con la expresin de MIP
lente en oocitos de Xenopus.
Los datos que apoyan la
actividad del canal de iones
han demostrado que la bovina
MIP26 tiene una conductancia
de 200 pS en vesculas
unilamelares con solucin


5
salina 100 mM. El canal de
iones es sensible al voltaje y al
pH, abierto a pH cido y que
tiende a cerrar de forma
permanente a pH neutro a una
amplitud de corriente
comparable a la de bicapas de
control. MIP28 de los pollos

Figura 1. Diagrama que ilustra la organizacin estructural canal acuaporinas y las vas de
penetracin. (A) topologa transmembrana de una subunidad acuaporina, con seis dominios
transmembrana (M1-6), los dominios amino y carboxilo terminales intracelulares, y dos bucles
plegados (B y E) que cumplen dentro de la regin transmembrana del canal para crear el poro
dentro de la subunidad de cada unidad. (B) Dos modelos para la permeacin de iones. Los
iones pueden pasar a travs del poro central en el medio del tetrmero de subunidades (como
se ha demostrado para Aquaporin-1, AQP1), o podran travs de las vas de poro dentro de la
subunidad individuales de canales de acuaporina (como ha sido propuesto para Drosophila
grande del cerebro, BIB y otros). El flujo de agua en AQP1 primaria est mediada por los
poros dentro de la subunidad. BIB no tiene permeabilidad al agua osmtica apreciable.

MIP28 tiene un solo canal de
conductancia de aprox. 230 pS
en 150 mM de KCl. La
evidencia en contra de la
actividad del canal de iones +
vino a partir de estudios de
impedancia utilizados para
determinar las conductancias
de la membrana de la fibra del
cristalino, la comparacin de
clulas de tipo salvaje y una
cepa de ratn mutante
heterocigtico (Cat
Fr
) que ha
reducido la translocacin del
canal MIP a la membrana; la
conductancia acoplamiento fue
ligeramente menos en la lente
mutante heterocigtico (n = 2)


6
en comparacin con el tipo
salvaje (n = 1), pero las
diferencias no fueron
estadsticamente significativas.
Este hallazgo podra desafiar a
los datos de los ensayos de
bicapa; alternativamente, la
falta de una diferencia podra
ser los bajos valores de n
utilizados, el hecho de que el
mutante heterocigoto todava
tena algo de expresin de MIP
en la membrana, aunque a un
nivel reducido, o la posibilidad
de que los iones la actividad
del canal de AQP0 est
regulada y la supuesta
actividad de canal inico puede
ser ms evidente en
condiciones distintas de las
utilizadas en la colagenasa
preparacin de clulas
disociadas de cristalino de
conejo. El mutante homocigoto
Cat
Fr
muestra la formacin de
cataratas de diagnstico,
mientras que el heterocigoto
utilizado para las medidas de
conductancia es normal en
apariencia. La observacin por
Varadaraj y colegas que en el
heterocigoto Cat
Fr
la
permeabilidad al agua de la
fibra del cristalino reduce
significativamente y no justifica
el supuesto de que la
conductancia inica debera ser
reducida, ya que las
mutaciones del canal de
acuaporina pueden afectar
diferencialmente flujos inicos
o agua (como se discute a
continuacin para AQP1). El
nico canal de la permeabilidad
al agua de AQP0 es de
aproximadamente l/40th que de
AQP1. Reglamento por el pH
que oscila 7.5 a 6.5 est
mediado por una histidina en el
bucle extracelular. Una funcin
propuesta para MIP en
cristalino est en la regulacin
del volumen, la prevencin de
la acumulacin de lquido
extracelular a travs de la
captacin de agua en el
cristalino rica en citoplasma
clula fibrosa, lo que minimiza
el espacio extracelular para
mejorar las propiedades de
transmisin de luz.



7
1.2. Nodulina 26 de la Soya

El MIP de la soya, nodulina
(nod26), reconstituido en
bicapas es un canal sensible al
voltaje con una gran
conductancia de un solo canal
y selectividad dbil de aniones.
En el dominio carboxilo
terminal, servicio 262 de
nodulin 26 se fosforila por la
calmodulina con su dominio
preoteinquinasa, lo que
aumenta la compuerta
dependiente de voltaje y la
ocupacin preferencial de
estados subconductancia.
Nod26 es el principal
componente de protena de
membrana en ndulos de las
races que encierran
bacteroides fijadoras de
nitrgeno simbiticas. Cuando
se reconstituye en
proteoliposomas, nod26 facilita
el transporte de amonio
mercurio sensible, lo que
sugiere un papel importante en
el transporte de nitrgeno fijo
del simbiosoma.


8

Figura 2. Activaci Reversible de los canales de Drosophila Big Brain acuaporinas expresados en
oocitos de Xenopus. (A) la activacin reversible de la (BIB) la conductancia inica medida por dos
electrodos de tensin abrazadera de un oocito que expresa hemaglutinina (HA) eptopo de etiquetado
canales BIB. (B) de imgenes confocal con anti-HA anticuerpo etiquetado de la protena BIB, que
muestra la expresin en las membranas de plasma de ovocitos de Xenopus para los canales de tipo
salvaje y para un no-inico mutante (glutamato a la asparagina 71) que ejerce un efecto negativo
dominante sobre la actividad de la conductancia inica .

1.3. Acuaporina 1
AQP1 del humano es un canal
de agua y funciona como un
canal monovalente no selectivo
de cationes cuando es activado
por GMPc intracelular, con una
gran conductancia del canal
nico de aproximadamente 150
pS en condiciones salinas
fisiolgicas normales y los
estados subconductancia
aparentemente ms pequeas
cuando se reconstituye en
bicapas lipdicas. El tipo salvaje
AQP1 la conductancia de iones
lleva cationes monovalentes
(K
+
Cs
+
> Na
+
>
tetraetilamonio
+
), pero no
aniones, protones, o los
cationes divalentes Ca
2+
o Mg
2+



9
como se determina a partir de
los potenciales de inversin
medidos en los experimentos
de sustitucin de iones (Yool et
al., 1996). El poro central AQP1
est revestida por los residuos
de barrera hidrfobiica (valina
50, y leucinas 54, 170, y 174;
humana AQP1) ubicados en los
dominios segundo y quinto
transmembrana, M2 y M5. La
sustitucin de todos los cuatro
residuos de barrera por alanina
aumenta la permeabilidad
relativa de tetraetilamonio, una
gran catin monovalente que
bloquea los poros de agua
monomricos pero lleva una
corriente inica a travs del
gran poro del canal activado
por GMPc. La sustitucin de
cistena por lys 51 en el
dominio del poro central en una
cistena con menor fondo de
AQP1 crea un nuevo sitio para
la inhibicin de la conductancia
inica por el mercurio,
indicando que el poro central
es la va de conduccin de
iones. AQP1 mediada por
conductancia catinica ha sido
implicado en influir en las tasas
de transporte de fluido neto en
cultivos primarios de plexo
coroideo. El punto principal de
la incertidumbre en el campo
es la variabilidad en la amplitud
de la respuesta entre diferentes
modelos experimentales. A la
luz de los recientes hallazgos,
parece probable que las
diferencias entre los
preparados resultan de las
diferencias en las vas de
regulacin intracelular de AQP1
que regulan la disponibilidad de
canales inicos. La fosforilacin
de la tirosina Y253 en el
dominio carboxilo terminal,
confirmado por Western Blot,
podra ser uno de los
interruptores master en la
capacidad de respuesta de
AQP1 canales inicos con
cGMP. Treonina y la actividad
serina quinasa tambin regula
AQP1 actividad de canal inico
(Zhang et al., 2007).

1.4. Drosophila Big Brain
Drosophila grande del cerebro
(BIB) expresado en ovocitos es


10
un canal de catin monovalente
reversible activada por la
sealizacin de la tirosina
quinasa (Fig. 2), sin ninguna
actividad de canal de agua
apreciable. Las mutaciones de
prdida de funcin de BIB
resulta un exceso de los
precursores neuronales en el
sistema nervioso embrionario y
una reduccin en el nmero de
clulas de la epidermis,
clasificndolo como uno de los
genes neurognicos, adems
de Notch y Delta y otros. Sin
embargo, su mecanismo de
accin en la determinacin del
destino de la clula sigue
siendo desconocido. BIB se
sugiri a ser una protena de
canal que participa en la seal
de inhibicin lateral controlar el
destino de las clulas
precursoras, y tambin ha sido
propuesto para desempear un
papel estructural en la
agregacin de clulas sobre la
base de ensayos de BIB
transfectadas clulas L.
Yanochko y sus colegas
mostraron que el canal BIB
expresa en ovocitos media una
monovalente conductancia de
canal catinico no selectivo que
es modulada por agentes
farmacolgicos que alteran
endgenos tirosina quinasa
vas de sealizacin en los
ovocitos, y la protena BIB
analizada por Western Blot
muestra la fosforilacin de
tirosina en el dominio carboxilo
terminal. Despolarizacin de
membrana en teora, podra
estar implicado en la funcin
neurognica de BIB en el
desarrollo temprano.

1.5. Acuaporina 6
AQP6 de mamfero expresado
en ovocitos muestra una
conductancia de un solo canal
intermedio (49 pS en 100 mM
de NaCl) inducida por el
tratamiento con 10 mM de
HgCl2. AQP6 en ratas se
encuentra en vesculas
intracelulares en epitelios
renales. Al tener pH cido
(<5,5), la permeabilidad del
agua y el anin de los ovocitos
que expresan AQP6 se


11
incrementa. Mutacin dirigida al
sitio de lys 72 a Glu en el lado
interno del poro dentro de la
subunidad alter la selectividad
del catin a anin sin perjudicar
la activacin pH dependiente.
La alta permeabilidad al nitrato
se redujo por mutacin dirigida
al sitio de revestimiento del
revestimiento de Thr a Ile 63.
La permeabilidad del anin de
AQP6 fue eliminado por la
mutacin de asn 60 a Gly (que
se encuentra en el punto de la
segunda y quinta dominios
transmembrana M2 y M5
cruzado), mientras que se
increment la pemeabilidad
basal al agua osmtica. El
grupo de investigacin que
presenta AQP6 como un canal
de iones ha desestimado las
conductancias inicas de AQP1
como raro y aberrante. Sin
embargo, es interesante
observar que las similitudes en
los niveles relativos de agua y
actividades del canal de iones
entre AQP1-y AQP6 expresado
en ovocitos, as como
propiedades similares de
corrientes inicas medidas por
fijacin de voltaje, tales como la
amplitud de corriente, la
cintica y baja sensibilidad a la
tensin , y la importancia del
bucle B, M2 y M5 estructuras
para la funcin del canal de
iones, todos sugieren que un
tema comn se extiende a
travs de mltiples clases de
canales inicos AQP. Otros
acuaporinas adems los
resumidos anteriormente
pueden ser encontrados en el
trabajo futuro para tener
actividades de los canales
inicos, en espera de la
identificacin de las posibles
vas de sealizacin que
podran regir la activacin.

2. Bases moleculares de los
canales inicos Acuaporinas,
compuertas y conductancia

2.1. El Poro central inico
El poro central podra no ser
la nica va permeable a iones
para las clases de
acuaporinas conductoras de
iones AQP (Fig. 1). Por


12
ejemplo, en AQP6, residuos
de aminocidos que afectan a
las propiedades de los
canales inicos mutados se
encuentran en el bucle B, un
enlazador intracelular entre el
segundo y tercer dominio
transmembrana M2 y M3. El
bucle B forma parte de la
mitad intracelular del poro
dentro de la subunidad que se
asocia tpicamente con la
funcin de canal de agua en
otros AQPs. Por lo tanto, los
poros dentro de la subunidad
podran ser las vas de
conduccin inica en AQP6,
en contraste con el modelo de
poro central propuesto para
AQP1. Del mismo modo, la
gran conductancia inica
mediadas por BIB se ve
afectada por la mutacin de
un residuo conservado Glu 71
en el primer dominio
transmembrana M1, que es
un sitio que sobre la base de
estructuras cristalinas de otras
AQPs es ms probable que
afecte el poro dentro de la
subunidad que al poro central.
La mutacin de glu 71 al asn
(E71N) en BIB la funcin del
canal inico se suprime,
mientras que la mutacin
equivalente en AQP1 E17N
no impeda que la actividad
del canal inico, pero bloque
l funcin de AQP1 como canal
de agua. La magnitud del
efecto de cada del BIB
correlacionado con la relacin
de mutante de ARNc tipo
salvaje se inyecta en los
ovocitos de Xenopus. La
coexpresin de AQP1 tipo
salvaje y E17N disminuy
significativamente la
permeabilidad al agua
osmtica, en comparacin con
AQP1 tipo salvaje, sin crear
un efecto negativo dominante
en la funcin del canal de
agua de la AQP1. La
sensibilidad diferencial de BIB
y AQP1 a la mutacin de la
glutamato M1 sugiere que las
vas de permeacin de iones
podran implicar el poro
central o los poros dentro de
la subunidad, en funcin del
tipo de canal.


13

2.2. Funcin del carboxilo
terminal como dominio
modulador:
El dominio carboxilo terminal
se ha sugerido para modular
la actividad del canal de iones
de acuaporina en AQP1 y
BIB. En AQP1, un patrn de
aminocidos en el dominio
carboxilo terminal parece
imitar algunos residuos clave
que se han asociado con
selectividad de unin GMPc a
las cGMP fosfodiesterasas. La
Mutagnesis dirigida al sitio
de estos residuos en AQP1
disminuy la magnitud de la
conductancia inica activada
por GMPc. La fosforilacin de
una tirosina carboxilo terminal
(Tyr 253, humana AQP1)
mejora la disponibilidad de
AQP1 a ser cerrada como
canales inicos en respuesta
a cGMP. Los agentes
farmacolgicos que inducen la
desfosforilacin de tirosina
previenen la activacin de los
canales, mientras que los
agentes que aumentan el
estado fosforilado de tirosina
promueven a la activacin de
los canales. La mutacin del
sitio de fosforilacin de la
tirosina a cistena (Y253C)
impidi la activacin de
canales de iones, pero la
adicin covalente de un
agente alquilotiosulfonado
cargado negativamente (de
sodio (2-sulfonatoethyl)
methanotiosulfonado;
(MTSES) para el lado
intracelular de AQP1 Y253C
rescat la respuesta de
conductancia de GMPc-
activado. El efecto MTSES se
invirti por el agente reductor
ditiotreitol. Estos resultados
apoyan la propuesta de que la
fosforilacin de la tirosina
Y253 en el dominio carboxilo
terminal, confirmado por
Western blot, acta como un
interruptor principal que regula
la capacidad de respuesta de
canales inicos de AQP1 de
cGMP. La fosforilacin de la
tirosina de BIB en el dominio
carboxilo terminal por el
contrario se ha demostrado


14
que modulan negativamente
la actividad del canal de
iones, lo que resulta en una
disminucin de la amplitud de
la conductancia inica
activada en canales BIB
expresados en oocitos de
Xenopus.

2.3. El papel del bucle D como
un dominio de compuerta

El bucle D entre el cuarto y el
quinto dominio
transmembrana M4 y M5 se
ha relacionado con la
compuerta inica de
conductancia en AQP1. El
bucle equivalente en AQPs de
plantas es esencial para la
actividad de canal de agua de
puerta en respuesta a factores
de estrs ambienta. El bucle
D, en la rata AQP4 se ha
propuesto como objetivo para
la regulacin de la actividad
del canal de agua por la
fosforilacin de la Ser 180. La
alineacin de la secuencia de
aminocidos de las regiones
del bucle D de los canales de
iones, conocidos acuaporina
AQPS 0, 1, 6, BIB y nodulina,
muestran el dominio est
altamente conservada para
una clase dada de canales
expresadas en diversas
especies, pero la patrones
dentro de cada una de las
diferentes clases de
acuaporina son nica y
distintiva de los de otras
clases de canales de AQP
(Fig. 3). El alto grado de
conservacin de secuencias
de aminocidos en los
dominios de bucle D en una
clase de canales a partir de
una variedad de organismos
implica una ventaja adaptativa
es conferida por la regin del
bucle D que implica papeles
funcionales especficos de la
clase. El Buce D ha sido
implicado en acuaporinas
vegetales y animales como
importante en la compuerta de
funciones de canal por varios
factores tales como la unin
de ligandos intracelulares,
fosforilacin, y el pH. En
AQP1, las mutaciones en


15
bucle D que interfieren con la
activacin de canales de
iones tienen relativamente
poco efecto sobre la actividad
del canal de agua, lo que
sugiere que la funcin del
canal inico en AQP1 ha sido
seleccionada positivamente y
es probable que sea
fisiolgicamente relevante.

Figura 3. Secuencia de aminocidos del dominio bucle D y adyacentes 50 y 30 regiones conocidos de
acompaamiento de las acuaporinas como canales inicos. Regiones Loop D para personas AQP0,
AQP1, AQP6, soja NOD26 y Drosophila BIB se determinaron por el software de prediccin estructural y
mediante el examen de las estructuras cristalinas. Loop D (subrayado, negrita) y los residuos que
flanquean transmembrana de cada corte de acuaporinas fueron extrados de GenBank y alineados
utilizando ClustalW (v1.83). Los asteriscos (_) muestran los residuos que son idnticos en todas las
secuencias alineadas, dos puntos (:) muestran sustituciones conservadas y puntos (.) Muestran
sustituciones semi-conservadas. Colores (on-line nica versin figura) representan las propiedades
fisicoqumicas de cada residuo, bsica (magenta), cidos (azul), pequea hidrofbica (rojo) y los
grupos hidroxilo, sulfhidrilo o amina (verde). Adhesin nmeros aparecen a la derecha de cada
secuencia parcial. (Para la interpretacin de las referencias al color en esta figura de leyenda, se remite
al lector a la versin web de este artculo.)


16

3. Papel fisiolgico de los canales
inicos de acuaporinas

3.1. Papel inesperado de
canales de acuaporinas
AQP1 se expresa en el
epitelio de barrera en la que
es esencial el mantenimiento
del equilibrio homeosttico del
fluido, y su papel en facilitar el
flujo de agua en estos tejidos
es evidente. En el plexo
coroideo en los ventrculos
cerebrales, AQP1 permite la
produccin de lquido
cefalorraqudeo. En el tbulo
proximal renal y la rama
descendente delgada del asa
de Henle, AQP1 permite la
reabsorcin de lquidos. En el
ojo, la expresin de AQP1 en
epitelio ciliar es importante
para la produccin de humor
acuoso, y su expresin en el


17
epitelio pigmentario de la
retina se piensa que es
importante para la eliminacin
de lquido desde el espacio
subretiniano. Sin embargo,
AQP1 tambin estn
localizados en clulas en las
que la necesidad de tener
altas tasas de flujo de agua
transmembrana no es
fcilmente evidente. Los
efectos funcionales de AQP1
en estos casos permanecen
abiertos a la especulacin.
Los ejemplos incluyen:
derivados de la cresta neural
como las neuronas entricas y
en los ganglios de la raz
dorsal, clulas endoteliales
vasculares de la perifrica
(pero no central) vasculatura;
las clulas rojas de la sangre;
malla trabecular en el canal
de flujo de fluido del ojo;
astrocitos reactivos y
glioblastomas; cncer de
mama; fotorreceptores de la
retina, clulas pancreticas,
msculo cardiaco, y otros
tejidos. Algunas funciones
posibles incluyen la
transduccin de seales
(potencialmente en asociacin
con otros canales de iones,
receptores y transportadores);
aumento de la elasticidad
mecnica en los tejidos
expuestos a cambios
repentinos en la presin;
neuritas o clula excrecencia
proceso; regulacin del
volumen orgnulo, y
regulacin del volumen
celular, por ejemplo, para
permitir la migracin a travs
de los espacios extracelulares
restringidos.

3.2. Nuevas estrategias de
investigacin

Comprender el espectro
completo de los roles
funcionales y las vas
reguladoras es esencial para
la determinacin de la gama
de funciones fisiolgicas que
los canales tales como AQP1,
as como su valor potencial
como dianas para
tratamientos teraputicos.
Herramientas para sondear el


18
diferencial de iones y las
actividades de los canales de
agua de AQPs estn
comenzando a emerger de los
proyectos en curso de
descubrimiento de frmacos y
de los anlisis moleculares de
compuert y dominios
reguladores. Por ejemplo, con
la informacin ahora
disponible, es posible en
cultivos de clulas para
evaluar el papel de la
actividad de canal inico
mediada por AQP1 sin la
actividad del canal de agua,
mediante la transfeccin de
clulas con un constructo
mutante de AQP1 en glu17,
en la que se sustituye con asn
(E17N, humana AQP1 ). Con
esta construccin, la
respuesta de conductancia
inica GMPc inducida
permanece intacta, pero
AQP1 ya no muestra ninguna
osmtica apreciable. A la
inversa, para evaluar el papel
de AQP1 flujos de agua y sin
la capacidad para la
activacin de cGMP de la
conductancia catinica, una
estrategia sera para
transfectar clulas con el
constructo mutante AQP1
doble en la que arg 159 y arg
160 estn sustituidos con
alaninas (R159A, R160A;
AQP1 humana), una
construccin en el canal de
agua, pero la actividad de
canal inico no permanece
intacto. Para estos enfoques,
las clulas elegidas para la
transfeccin,
presumiblemente, deben estar
libres, ya que ninguno de los
mutantes deficientes
funcionalmente selectivos
descritos anteriormente ejerce
un efecto negativo dominante.
En una condicin dominante
negativo, la expresin del
mutante no funcional tambin
podra disminuir la actividad
de la de tipo salvaje debido a
la co-ensamblaje de las
subunidades en el multmero
canal. Ser valioso en los
estudios en curso para
continuar a la pantalla nuevas


19
construcciones de mutantes
de una capacidad para reducir
o eliminar ya sea agua o
actividad de los canales de
iones a travs de una accin
negativa dominante, lo que
podra abrir posibilidades para
evaluar las contribuciones
diferenciales de agua y las
actividades de los canales
inicos en clulas que
expresan de AQP1 tipo
salvaje. El mecanismo
dominante negativo es un
fenmeno que se ha utilizado
con ventaja por ejemplo en los
estudios de las funciones
fisiolgicas de los canales
dependientes de voltaje y
para la definicin de las
etiologas de enfermedades
heredadas ion canalopatas.
La identificacin de un grupo
diverso de bloqueadores
farmacolgicos selectivos de
canales de AQP podra
realizarse en la prxima
dcada. Mientras Cd
2+
ha sido
til como una herramienta
experimental para el bloqueo
de AQP1 canales inicos (sin
afectar a los canales de agua
paralelos), problemas con la
toxicidad, as como una falta
de especificidad para los
canales de AQP limitar su
valor como una sonda para
contribuciones fisiolgicas de
AQP1 canales inicos in vivo.
Los datos preliminares de una
biblioteca de derivados de
bumetanida sintticos que se
ha encontrado para mostrar
actividad farmacolgica AQP
ofrece promesa de que al
menos uno de los agentes es
un bloqueador eficaz de la
GMPc dependiente de
conductancia inica de AQP1
a concentracin micromolar ,
y no tiene ningn efecto sobre
la actividad del canal de agua
AQP1 a dosis de hasta 100
micromolar (Yool y Campbell,
datos no publicados). Otros
agentes arilsulfonamida estn
desarrollando mantenga
independientemente promesa
para la creacin de una matriz
de compuestos de bloqueo
para AQPs. Un bloqueador
selectivo agudo de la


20
conductancia inica ser una
herramienta de gran alcance
para hacer frente a la
relevancia de traslacin del
doble de agua y la funcin del
canal de iones de AQP1. Una
vez que el papel funcional de
las vas duales se entiende,
es concebible que los AQP1
selectivos bloqueadores de
los canales de iones podran
tener aplicaciones
teraputicas en medicina que
nunca han sido previstos
cuando se ve como AQP1''
nada ms que un canal de
agua''. Exploraciones
similares de las capacidades
multifuncionales de otros
acuaporinas multifuncionales
ofrecen emocionantes retos y
oportunidades para la
investigacin y los avances de
la traduccin.

Aquaporin 2: Desde el descubrimiento de la estructura molecular
y las implicaciones mdicas

1. Introduccin:

Acuaporinas 2 (AQP2) es un canal
de agua regulado por vasopresina
que determina la permeabilidad al
agua del conducto colector del
rin. En los animales terrestres,
incluidos los seres humanos, la
prevencin de la prdida de agua
es obligatoria para la supervivencia
en condiciones secas del medio.
Para reducir al mnimo la prdida
de agua a travs de la orina, la
orina debe ser altamente
concentrado; un ejemplo tpico es
que un roedor desierto concentra la
orina tan alto como 5.000 mOsm /
kg H2O. En consecuencia, los
mecanismos de concentracin de
la orina haban despertado el
inters de los investigadores y se
han realizado muchos estudios.
Smith y colaboradores propusieron
que la vasopresina reduce el flujo


21
de la orina mediante el aumento de
la permeabilidad de la nefrona
distal al agua, estimulando as la
reabsorcin de agua desde el
lumen hacia el intersticio, lo que
resulta en una mayor concentracin
de la orina. En la dcada de 1960,
sobre la base de estudios sobre la
piel de anfibios y vejiga urinaria
sapo (tejidos modelo de nefronas
renales distales), el concepto de
canales de agua de la regulacin
por vasopresina fue ampliamente
aceptada. Estudios posteriores de
congelacin utilizando microscopa
electrnica indicaron la presencia
de partculas intramembrana
(presumiblemente protenas de los
canales de agua) en la membrana
apical de la vejiga urinaria de sapo
y demostraron que estas partculas
de agregado de respuesta a la
vasopresina.

2. Descubrimiento de la AQP2,
canal de agua regulado por
vasopresina
Para identificar las molculas de
agua de los canales, estudios
bioqumicos tales como
marcadores de la porcin exterior
de protenas de la membrana con
reactivos especficos. Y una
estrategia de clonacin con
ovocitos de expresin heterloga
fueron empleados. Sin embargo, la
verdadera identificacin molecular
no se produjo hasta el
descubrimiento casual de una
molcula de canal de agua de los
glbulos rojas de la sangre.
Durante los estudios de protenas
de la membrana en las clulas
rojas de la sangre, que reconocen
la presencia de gran cantidad de
una protena de 28 kDa de funcin
desconocida. Purificacin y
secuenciacin de aminocidos
parcial condujo al aislamiento de un
ADNc para una protena integral de
membrana de 28 kDa, que. La
aparicin de la permeabilidad al
agua en oocitos inyectados con
ARNm in vitro con transcripcin de
CHIP28 era el momento en que se
produjo la identificacin molecular
de un canal de agua. Con base en
esta clonacin y el hecho de que
CHIP28 no est presente conducto
colector del rin, se inici una
bsqueda de homlogos de
CHIP28 utilizando una estrategia


22
de clonacin basada en PCR
aplicado a mdula renal ARNm. El
estudio dio como resultado con
xito en el aislamiento de un
ensayo funcional de ADNc y
posteriormente la versin completa
en los ovocitos dentro de 5 meses,
la confirmacin de su localizacin
inmunohistoqumica con
anticuerpos generados
recientemente en otros 4 meses, y
la publicacin final dentro de 1 ao
en febrero de 1993 (fig. 4) Este
canal de agua recientemente
identificado es 42% idntica en la
secuencia de aminocidos a
CHIP28, localizada exclusivamente
en la regin apical y subapical de
los conductos colectores del rin,
y fue nombrado WCH-CD (canal de
agua del conducto colector). Ms
tarde, un nuevo nombre
sistemtico, acuaporina 2 (AQP2)
fue asignado a este canal del rin
de reabsorcin de agua del
conducto y el nombre AQP1 fue
asignado a CHIP28 (Agre et al,
1993.). Curiosamente, al mismo
tiempo, otros dos clones fueron
aislados en nuestro laboratorio, uno
es un canal de agua expresado en
la membrana basolateral de
conducto colector y se llama AQP3.
Y el otro es un canal de cloruro
expresado en la rama ascendente
delgada del asa de Henle y se
nombra CLC-K1. Tanto ms tarde,
se mostr a ser crticamente
involucradas en la concentracin
de la orina. Por lo tanto, la mdula
renal era como una isla del tesoro
para la clonacin de molculas que
contribuyen a la concentracin de
la orina. Fue fortuna que nos
aislamos AQP2 primera que AQP3.
En el momento que AQP2 se clon,
se demostr que la regulacin de
AQP2 por vasopresina era escasa.
Estudios posteriores de muchos
investigadores como nos lo
demostraron. Tras la estimulacin
vasopresina, el trfico de AQP2 a
la membrana apical de las
vesculas intracelulares de
almacenamiento se demostr con
la microscopa inmunoelectrnica..
Ms importante an, la
acumulacin de AQP2 marcada en
partculas intramembranosas se
demostr en congelacin rplicas
de clulas LLC-PK1 AQP2-
experssing (Sun et al., 2002). Se


23
cree que tal estructura de las
partculas para representar
molculas canal de agua
vasopresina regulados en vejiga
urinaria de sapo, rin de roedores
y conducto colector. Por lo tanto,
AQP2 se ha demostrado que es un
canal de agua de la regulacin de
vasopresina.

3. Acuaporina 2 humana:
Implicaciones clnicas futuras y las
aplicaciones requieren clonacin de
AQP2 humana. Poco despus de la
clonacin de AQP2 ADNc de rata
como se describe anteriormente,
comenzamos el aislamiento de un
homlogo humano de AQP2. El
ADNc aislado codifica una protena
de 271 amino cidos con un 91%
de identidad a la rata AQP2 que se
localiza en clulas de los conductos
colectores humanos. El gen que
codifica AQP2 humana (NCBI
Gene ID: 359) tambin fue aislado,
y su organizacin estructural y la
localizacin cromosmica se
analizaron. El gen AQP2 es una
parte relativamente pequea de
genes que se distribuye ms de 5
kilobases (kbs) y compuesto por
cuatro exones. Su localizacin
cromosmica se mapea en el
cromosoma 12q13 donde otros
AQPs (AQP0, 5, 6) estn
estrechamente colocalizados. Si
AQP2 es el canal de agua de la
regulada por vasopresina de los
conductos colectores, se puede
esperar que las mutaciones en el
gen AQP2 causaran una
enfermedad hereditaria humana, la
diabetes inspida nefrognica
(NDI), en la que los pacientes no
pueden concentrar la orina,
encontraron un heterocigoto
compuesto de dos mutaciones en
el gen AQP2 de un paciente
masculino NDI, confirmando que
AQP2 es el canal de agua regulada
por vasopresina. Ms importante
an, esto proporcion la primera
evidencia directa de que la protena
AQP hecho funciona como canal
de agua en los organismos vivos.
Desde este informe, ms de 43
mutaciones se han reportado para
ambas formas recesivas y
dominantes de NDI. El hecho de
que AQP2, AQP5 y AQP6 clster
en un rango muy estrecho (27 kb)


24
del cromosoma 12q13 (Ma et al.,
1997) es digno de mencin y una
gran delecin de un segmento de
este gen predice sntomas de la
enfermedad adicionales que no
sean simples NDI. Estos pacientes
no se han reportado, pero debemos
tener cuidado de no pasar por alto.

4. Estructura y funcin de la AQP2

La protena MIP de la membrana
del cristalino, que ahora se conoce
como AQP0, es el miembro de la
familia AQP canal prototpico, y su
topologa de la membrana abarca g
dominios transmembrana de alfa-
hlices conectados por cinco
bucles. La misma topologa se
confirm para AQP1 por estudios
bioqumicos, inmunomarcacin y
funcional, que conduce a la
estructura de modelo de reloj de
arena de las protenas AQP en el
que bucle citoplsmico B y bucle
Fig 4. El aumento de la
osmtica de HBB-CH
(AQP2) ARN inyectado
ovocitos de Xenopus.
Tiempo dependiente de
aumento de volumen de
los ovocitos inyectados
con ARN WCH-CD o
agua (control) fue
monitorizada a
intervalos de 20 s y
tambin se examinaron
los efectos de HgCl2 (a)
Microfotografas reales
de ovocitos examinados
en el orden de izquierda
a derecha y de arriba a
abajo (b) adaptado


25
extracelular E se proyecta de
nuevo en la bicapa de la membrana
y se conectan entre s para formar
una nica va acuosa estrecha a
travs de cada molcula de AQP.
Anlisis de la estructura de cristal
posterior mostr claramente que
AQP1 forma una estructura
tetramrica, y cada molcula tiene
un poro de transporte de agua
central en el que la secuencia Asn-
Pro-Ala (NPA) residen cerca de la
parte ms estrecha del poro, una
observacin que confirma
bsicamente el modelo de reloj de
arena. AQP2 es la protena de 29-
kDa, con mayor masa molecular
adicional en 35-50 kDa que
corresponde a N-glicosilada en la
asparagina 124. Nuestro estudio en
el sistema de expresin de oocitos
indic que la misma topologa de
membrana y regiones de mercurio
sensibles se conservan en AQP2
como en AQP1, pero mostr que el
relativamente hidrfilos (bucles C y
D) participan en la formacin del
poro acuoso, un hallazgo que es
diferente del modelo de reloj de
arena en el que los bucles B y E
son importantes. Se realiz el
aislamiento a gran escala de la
protena recombinante humana
AQP2, y la estructura de homo-
tetramrica de AQP2, al igual que
otros AQPs, se confirm. Un
estudio adicional utilizando la
misma estrategia de expresin dio
dos capas bidimensionales de
cristales de AQP2, y el anlisis de
estos cristales con microscopio
electrnico mostr la estructura
bsica de AQP2 a 4,5 . La
caracterstica general del
monmero AQP2 se asemeja a la
de AQP1, lo que indica que la
estructura de AQP2 es consistente
con el modelo de reloj de arena.
Sin embargo, se observ una
nueva funcin, es decir, la
presencia de una capa de
densidades intercaladas entre
hojas de cristal de una sola capa, lo
que se interpret como la N-y C-
terminales de AQP2. No est claro
si esta capa se puede atribuir a la
estructura de doble capa de las
muestras o si es especfico para
AQP2 y juega un papel especfico
(Schenk et al., 2005). Claramente,
es necesario el anlisis de ms alta
resolucin de la estructura de


26
AQP2 y dicha informacin ser
proporcionar pistas importantes
para el desarrollo de inhibidores
especficos de esta clnicamente
importante canal de agua.
La familia AQP se dividi en
subgrupos ahora en gran medida
en tres grupos basados en
funciones de canal y las
secuencias primarias de
aminocidos. El subgrupo
acuaporina incluye AQPs
selectivos de agua, tales como
AQP0, 1, 2, 4, 5, 6, y 8. El
subgrupo aquaglyceroporin
incluye molculas que son
permeables a solutos pequeos
neutros tales como el glicerol, la
urea, y el agua, tales como AQP3,
7, 9, y 10. AQP11 y AQP12
constituyen otro subgrupo
superaquaporin y la homologa de
secuencia de estos AQPs a otros
AQPs es menos de 20% e incluyen
motivos NPA desviados. El primer
motivo NPA se sustituye por NPC
en AQP11 y por TNP en AQP12,
pero el segundo motivo NPA se
conserva. AQP2 pertenece al
subgrupo de acuaporina. Estudios
funcionales han demostrado que la
permeabilidad al agua de AQP2 es
muy alta, en el mismo rango que
AQP1. La conductancia de iones
de ovocitos que expresan AQP2-es
casi insignificante, lo que impide
una posible penetracin de
protones a travs de AQP2. Esta
caracterstica es importante en los
conductos colectores del rin,
porque los conductos colectores
debe mantener una gradiente de
protones empinada en
circunstancias normales. Por
ejemplo, pH de la orina se
mantiene en 4,5 por la maana, lo
que significa un gradiente de
concentracin de protones 1.000
veces. Del mismo modo,
permeabilidades de AQP2 a
glicerol y urea son insignificantes,
lo que sugiere que es un AQP2,
transportador especfico de agua
altamente selectivo.

5. Funcin fisiolgica de AQP2 en
el cuerpo:

AQP2 es un actor clave en la
concentracin de la orina. En
respuesta a la hiperosmolaridad de


27
suero, la vasopresina se libera de
la glndula pituitaria a la circulacin
sistmica. La vasopresina se une a
su receptor de tipo 2 (V2R) que se
encuentra en la membrana
basolateral de las clulas
principales del conducto colector, y
la unin desencadena el trfico de
AQP2 entre la membrana apical y
vesculas intracelulares provoca un
aumento de AQP2 en la membrana
apical que permite que se eleve la
permeabilidad de la membrana al
agua. Adems de este papel
fisiolgico bien establecido de
AQP2 en el rin, otras
posibilidades fuera el rin han
sido implicados.

a) Localization of AQP2 in the
body
Como era de esperar como un
canal de agua de la
vasopresina-regulado, AQP2 se
demostr inicialmente que se
expresa exclusivamente en el
rin, pero ms tarde, estudios
detallados mostraron que la
protena de AQP2 se expresa
en el odo interno y de los
rganos reproductivos
masculinos. Se describen ms
detalles de esta expresin extra-
renal de AQP2. En el rin,
AQP2 se localiza en la
membrana apical y subapical de
vesculas de clulas principales
del tubo colector interior y
medular. El trfico intracelular
de AQP2 entre estos dos
compartimentos determina la
permeabilidad al agua de la
membrana apical. AQP2
tambin se observa en las
clulas de los tbulos de
conexin a lo largo del
segmento de soporte donde se
concentra el lquido luminal
tubular diluido a los niveles iso-
osmolar por reabsorcin de
agua libre, lo que representa
una cantidad considerable de la
reabsorcin de agua. Otra pieza
importante de la maquinaria de
concentracin de la orina, V2R,
tambin est presente en este
segmento de la nefrona, lo que
sugiere que la reabsorcin de
agua aqu es tambin regulado
vasopresina. La tincin positiva
dbil para AQP2 se observa de
vez en cuando a lo largo de la


28
membrana basolateral de
clulas de los conductos
colectores, lo que implica un
papel como un transportador de
agua a travs de esta
membrana, donde tambin se
observa una expresin
abundante de AQP3 y AQP4
(en la porcin terminal del
conducto colector). En
condiciones patolgicas
humanas, la expresin de AQP2
se observ en las clulas
epiteliales renales con quistes
provenientes de enfermedades
renales poliqusticas autosmica
dominante y en el conducto de
Bellin coni tumores que se cree
que surgen de los conductos
colectores.

b) Un jugador clave en la
concentracin de la orina

Como se describi
anteriormente, la identificacin
de los pacientes con
mutaciones en el gen del NDI
en AQP2 demuestra el papel
indispensable para AQP2 como
un elemento clave en el
mecanismo de concentracin de
la orina. Hasta la fecha, ninguna
mutacin gentica que no sean
los de los genes de AQP2 o
V2R se ha informado en
pacientes con NDI, lo que
confirma la importancia
fundamental de estas dos
protenas de membrana que se
encuentra opuesta a la
membrana apical y basolateral
de las clulas principales del
tbulo colector. Por el contrario,
las molculas y las cascadas de
sealizacin que conectan estas
dos molculas clave (AQP2 y
V2R) no son de importancia
crtica en la formacin de orina
concentrada, o ms
probablemente, la conexin
tiene muchos sistemas de copia
de seguridad para compensar la
ausencia de una molcula. Sin
embargo, las mutaciones en los
genes nuevos se deben buscar
en pacientes NDI en los que las
mutaciones de genes no se
encuentran ya sea en genes
AQP2 o V2R. Funciones
fisiolgicas esenciales para
AQP2 en el cuerpo se han


29
examinado en ratones de genes
especficos. El total AQP2 de
ratones que murieron dentro de
2 semanas despus del
nacimiento debido a
discapacidad grave capacidad
de concentracin de orina y
muestra hidronefrosis causada
por la enorme cantidad de orina.
Curiosamente, AQP2 en ratones
condicionales en el que AQP2
se elimina selectivamente en el
conducto colector, pero no en el
tbulo de conexin podran
sobrevivir a la edad adulta, pero
mostr una capacidad de
concentracin de la orina
notablemente reducida con
pequeas respuestas a 3 h-
privacin de agua en relacin
con el volumen de orina y la
osmolalidad. Estos resultados
demuestran que AQP2 en el
conducto colector es esencial
para la regulacin del balance
de agua en el cuerpo y no se
pueden compensar por otros
mecanismos y que AQP2 en el
segmento de conexin
contribuye a la concentracin de
la orina en cierta medida.

c) Funcin de la AQP2 fuera del
rin

AQP2 se expresa en el odo
interno y de los rganos
reproductivos masculinos, lo
que implica posibles funciones
en estos rganos. En el odo
interno, AQP2 se encuentra en
las estructuras de membrana
que bordean el saco
endoplsmico en ratas y seres
humanos, lo que sugiere que
AQP2 juega un papel activo en
la homeostasis de la endolinfa.
Por otra parte, tambin se
observ expresin de V2R en
los mismos tejidos. La
consecuencia inmediata de tal
localizacin puede ser que
AQP2 es involucrado en la
patognesis de la enfermedad
de Meniere, que se caracteriza
por episodios de vrtigo,
prdida auditiva fluctuante, y el
tinnitus. El estudio inicial
buscando mutaciones
genticas en el gen AQP2 en
pacientes de Meniere fall,
pero un estudio reciente


30
observ el aumento de la
expresin de AQP2 ARNm y
protenas en el saco
endoplsmico de las personas
con enfermedad de Meniere.
Niveles circulantes elevados de
vasopresina pueden estimular
el sistema V2R-AQP2,
causando internalizacin
endosomal apical AQP2
membrana y el desbordamiento
del lquido endoplsmico, que
crea hidropesa del odo
interno, un hallazgo patolgico
tpico de la enfermedad de
Meniere. Nuevos estudios
deben llevarse a cabo para
este nuevo y potencialmente
importante implicacin clnica
de AQP2. En este sentido, no
hay anomalas en las funciones
del odo interno (audicin y la
sensacin equilibrio) han sido
reportados en pacientes con
deficiencia de NDI AQP2.
Estudios adicionales, ms
exigentes todava pueden
revelar anormalidades
menores. AQP2 inmunotincin
muestra la expresin en las
clulas principales de la
porcin distal del conducto
deferente de la rata. Los
conductos deferentes se
derivan del conducto de Wolff
durante la embriognesis y es
parte del sistema de conductos
excretores responsable del
transporte, el almacenamiento
y la maduracin de los
espermatozoides. Por lo tanto,
AQP2 puede estar implicado en
la fertilidad masculina normal.
Distribucin ms amplia de
AQP2 en el tracto reproductivo
incluyendo la rete testis,
conductos eferentes y
epiddimo se observa en el
perro. Al igual que en el odo
interno, las anomalas clnicas
de fertilidad masculina no han
sido notificados o examinados
con un inters especial en los
pacientes NDI AQP2 nulo, y los
futuros estudios minuciosos se
esperan.
6. Regulacin de la AQP2
La regulacin de la permeabilidad
al agua de las clulas de los
conductos de colectores es
obligatoria para el mantenimiento


31
adecuado de equilibrio de agua en
el cuerpo. La mayor parte de este
ajuste est mediada por el trfico
de AQP2 entre la membrana de la
superficie celular luminal y las
vesculas de almacenamiento
subapicales intracelulares. Este
campo de investigacin es el
objetivo de intensos estudios,
porque las regulaciones dinmicas
de AQP2 sirven como un buen
sistema modelo para otras
molculas de la membrana
plasmtica de la superficie celular
cuya localizacin est regulada por
mecanismos de trfico.

6.1. Sntesis de la Protena
Privacin de agua durante un
cierto tiempo (24 h o ms)
origina una mayor
permeabilidad al agua de los
tbulos colectores, lo que
maximiza la capacidad de
concentracin de la orina, una
respuesta conocida como'
regulacin a largo plazo''.
Esta respuesta se debe
principalmente a un aumento
de la abundancia de protena
AQP2 producida por la
transcripcin del gen
estimulado AQP2, que est
mediada por la cascada de
sealizacin de vasopresina-
V2R. Un elemento de
respuesta a AMPc est
presente en la regin 50 del
gen AQP2 y regula la
transcripcin del gen.
Conductos colectores
medulares estn rodeados por
hipertonicidad intersticial, que
puede ser otro factor
determinante de la
transcripcin AQP2. La
hipertonicidad afecta a la
transcripcin de muchos
genes a travs de la
interaccin entre el
potenciador de la tonicidad
sensible (TONO) y su factor
de transcripcin TonEBP.
TONO est presente en el
gen AQP2, lo que sugiere que
la relacin TONO/TonEBP
contribuye a la transcripcin
de AQP2. En ratones que
muestran atrofia de la mdula
renal y la expresin de AQP2
es claramente regulado hacia


32
abajo, lo que confirma el
papel de Tono/ToneEBP en la
transcripcin de AQP2.
Adems, los elementos AP1 y
GATA se encuentran en la
regin promotora del gen de
AQP2 y pueden contribuir a la
transcripcin de genes.
Muchos otros reguladores
transcripcionales y
reguladores transcripcionales
elementos de enlace que
participan en la transcripcin
del gen de AQP2 se buscaron
sistemticamente y localizarse
en un estudio reciente,
proporcionando una mayor
comprensin de la
transcripcin del gen de
AQP2.
6.2. Fosforilacin
En la primaria secuencia de
aminocidos de AQP2, hay un
sitio de fosforilacin de la
protena quinasa A en la
serina 256, lo que implica su
papel en el trfico de AQP2.
Esta especulacin fue hecho
confirmado por las
observaciones en clulas
cultivadas. Al menos tres de
los cuatro monmeros en la
AQP2 debe ser fosforilada en
la serina 256 para realizar la
localizacin en la superficie
celular, lo que indica la
importancia de la fosforilacin
en este sitio. Adems, la
contribucin a la fosforilacin
de AQP2 quinasas distintas
de PKA, tales como la
protena quinasa C y la
protena quinasa G para el
trfico adecuado AQP2. Se
encontraron tres nuevos
lugares de fosforilacin de
serina, en la serina 261, 264 y
269 adems de la conocida
serina 256 en el extremo C-
terminal de AQP2. Estudios
posteriores han demostrado
que la vasopresina aumenta
la fosforilacin en la serina
264, y la serina-264
fosforilada en AQP2 se
transloca a la membrana
plasmtica de manera similar
a serina AQP2 256-
fosforilada. Por otro lado, la
vasopresina disminuye los
niveles de fosforilacin en la


33
serina 261, y la localizacin
de la serina-261 fosforilada en
AQP2 es diferente de la de
serina-256 fosforilada, lo que
sugiere papeles distintos para
estos residuos en el trfico de
AQP2. Sin embargo, otro
informe mostr ningn efecto
de la fosforilacin de la serina
261 en el trfico de AQP2. La
cuantificacin de la
fosforilacin en cada sitio de
fosforilacin muestra que la
fosforilacin en la serina 269
es sensible a la vasopresina
con el aumento de expresin
de AQP2 fosforilada en la
membrana apical. El nivel
bsico de fosforilacin de la
serina 256 es
constitutivamente alta y no es
sensible a la vasopresina, lo
que sugiere la importancia de
la fosforilacin de la serina
269 en el plasma de retencin
de membrana de AQP2. Sin
embargo, la fosforilacin de la
serina 264 y serina 269
depende de antes de la
fosforilacin de la serina 256,
y que la fosforilacin de la
serina 261 depende en parte
de la fosforilacin de la serina
264 y serina 269. Por el
contrario, la fosforilacin de la
serina 256 no es dependiente
del estado de cualquiera de
los otros sitios de
fosforilacin, lo que sugiere
que la serina 256 es el sitio de
fosforilacin ms importante
de AQP2. Como resultado, la
vasopresina de la seal altera
los estados de fosforilacin de
estos residuos, lo que
determina la
asociacin/disociacin de
AQP2 con sus protenas de
unin. Estos eventos
secuenciales pueden ser de
importancia crtica para AQP2
trata.
6.3. Complejo de la protena
vinculante y el la
translocacin

Varios casos de pacientes
NDI AQP2-desertado
muestran un patrn de
herencia dominante.
Curiosamente, las mutaciones
encontradas en estos casos


34
estn ubicados en la cola C-
terminal de AQP2, y estudios
de expresin heterlogos
muestran que las protenas de
AQP2 mutados estn
correctamente encaminadas a
la membrana basolateral en
lugar del destino correcto, la
membrana apical. Esta
observacin llev a la
especulacin de que hay
protenas de unin C-terminal
que regulan el trfico y el
destino de AQP2. Aislado de
protena activadora de
GTPasa Spa-1 (SPA-1) como
una pareja de unin del
extremo C-terminal de AQP2,
que coincide con el motivo
ligando PDZ, y mostraron que
la unin de SPA-1 a AQP2 es
necesaria para el trfico de
AQP2. SPA-1 puede inhibir la
protena activadora de
GTPasa Rap1, lo que
desencadena la actina F
desmontaje, y puede
mantener la movilidad basal
de AQP2. Otro estudio con
cromatografa de
inmunoafinidad usando una
columna acoplado
covalentemente con el
anticuerpo anti-AQP2 se
realiz para aislar protenas
de unin a AQP2- Debido a
que la mayora de las
protenas identificadas tienen
capacidad de unin a actina,
se especula que estas
protenas pueden asociar
indirectamente con AQP2 a
travs de actina, y estas
protenas crear complejos de
protenas que interactan con
AQP2. Un patrn de
interacciones que compiten
entre AQP2 y G-actina o
tropomiosina se ha
demostrado para dirigir el
trfico de AQP2 a la
membrana apical por
despolimerizacin de la
barrera de la actina F por
debajo de la membrana
apical.
Se identificaron ms de 180
protenas, incluyendo GTPasa
Rab miembros de la familia,
las protenas SNARE,
marcadores de la red trans-
Golgi, las protenas motoras y


35
otros. La actina tambin se
incluye en esta lista, lo que
sugiere que en las muestras
recuperadas, se incluyeron las
protenas que se unen
directamente a AQP2. Por lo
tanto, esta lista identifica a un
grupo de protenas que
interactan con AQP2 a
travs de, la vinculacin
directa unin indirecta, o
colocalizacin en las mismas
vesculas, y algunos de ellos
forman un complejo de
protenas para la regulacin
dinmica de AQP2.
6.4. Endocitosis y degradacin
La cantidad de AQP2 en la
membrana plasmtica es el
resultado de un equilibrio
entre continuar endocitosis y
exocitosis (Brown et al.,
2008). Durante el proceso de
endocitosis AQP2 se acumula
en depresiones revestidas de
clatrina y se interioriza a
travs. La cantidad de AQP2
en la membrana apical se
puede aumentar mediante la
inhibicin de la endocitosis
mediada por clatrina, lo que
implica que la inhibicin de la
endocitosis es otra manera de
aumentar la permeabilidad al
agua de los conductos
colectores. La protena de
choque trmico, HSC70, es
importante para la prdida de
la envoltura vescular
revestidas de clatrina, se une
al extremo C-terminal de
AQP2 no fosforilada y es
necesaria para la endocitosis
AQP2 (Lu et al., 2007).
Despus de la endocitosis,
AQP2 se recupera a
endosomas temprano EEA1-
positivo a travs de un
mecanismo de IP3K
dependiente y luego se
transfiere a las vesculas de
almacenamiento Rab11-
positivos. Las vesculas de
almacenamiento Rab11-
positivos son especficos
AQP2 y pueden no incluir
otras protenas de transporte
de membrana. AQP2 en el
almacenamiento de vesculas
vuelve a aparecer en la
membrana apical a la


36
estimulacin vasopresina. La
ubiquitinacin funciona como
una seal para la endocitosis
y la degradacin posterior por
el cuerpo multivesicular (MVB)
o proteasoma. La
ubiquitinacin en la lisina 270
de AQP2 es importante para
la endocitosis y la
degradacin de AQP2.
Algunos AQP2 transferido a
MVB se excreta en la orina en
forma de exosomas. La
cuantificacin de AQP2 en la
orina y rin que muestra ms
o menos 3% de AQP2 total en
el rin se excreta en la orina
todos los das, lo que indica
que esta ruta no es probable
que la principal va para la
degradacin de AQP2.
6.5. La actividad del canal de
cada molcula de AQP2

Ha habido cierta controversia
sobre si la fosforilacin de
AQP2 regula la permeabilidad
al agua de la molcula AQP2
individual. Kuwahara et al.
(1995) demostraron en
oocitos de Xenopus que la
PKA fosforila AQP2 en la
serina 256 y aumenta la
osmtica (Pf) de ovocitos sin
un aumento significativo en la
cantidad de protena en la
superficie del voocito. Sin
embargo, este resultado no
fue apoyada por otro estudio
utilizando un mtodo similar
en el que los valores de Pf
corregidos de la membrana
plasmtica frente a la
abundancia de protenas AQP
no fueron diferentes entre los
AQP2 de tipo salvaje, AQP2
no fosforilada y la fosforilacin
que imita AQP2. Sin embargo,
la participacin de otras
protenas tales como
fosfatasas endgenas no se
puede excluir. Esta cuestin
fue estudiada recientemente
de nuevo con un sistema puro
que lleva a cabo la expresin
a gran escala de AQP2
humana recombinante,
reconstituido en
proteoliposomas, y se midi
su Pf. Los resultados
mostraron que la Pf de


37
proteoliposomas se mejor
aproximadamente 2 veces por
fosforilacin en la serina 256.
Esta observacin indica que
actividad de canal de agua de
la AQP2 est directamente
regulada por su fosforilacin.
El mecanismo implicado no
est claro, pero una posible
explicacin es el canal gating.
Cada vez hay ms evidencia
de que las acuaporinas estan
cerrada. Anlisis de la
estructura cristalina de rayos
X de la acuaporina de
espinacas SoPIP2; 1 sugiere
que en la conformacin
cerrada, el bucle D tapa los
poros de este canal desde el
citoplasma, impidiendo el
paso del agua. En la
conformacin abierta, loop D
se desplaza, lo que permite el
paso de molculas de agua.
En este contexto, la presencia
de una capa de densidades
intercaladas entre hojas de
cristal de una sola capa de
AQP2 es digna de mencin.
Esta estructura fue
interpretada a ser N-y C-
terminales de AQP2, lo que
sugiere que la N-y / o C-
terminales de AQP2 funciona
como la puerta del canal. Un
anlisis ms detallado de la
estructura de AQP2 protena
en una resolucin ms alta
est claramente necesaria
para comprender los detalles
moleculares de la funcin de
los canales individuales de
agua.

Las acuaporinas en el descubrimiento de frmacos y la farmacoterapia

1. Introduccin
Durante el lapso de unos pocos
aos, el consenso en relacin con
el trfico fisiolgico agua ha pasado
de ser un transporte de masa no
facilitada a travs de la membrana
plasmtica a la circulacin del agua
a travs de canales especializados.
Este cambio de perspectiva
comenz en serio durante los


38
finales de los aos 1980 con el
trabajo pionero de la Georghe
Benga y grupos Peter Agre en la
protena integral ahora reconocido
como acuaporinas 1 (AQP1) y fue
aceptado en gran medida despus
de la identificacin formal de AQP1
en 1992. La explosin subsiguiente
de acuaporinas (AQP)
investigacin relacionada demostr
la existencia de estas protenas en
prcticamente todos los
organismos. Con su universalidad,
el transporte de agua fisiolgica y
otros solutos neutros realizados por
las protenas AQP ahora puede ser
pensado como un parmetro
modificable para el descubrimiento
de frmacos y farmacoterapia. La
familia de acuaporina es una gran
coleccin de protenas integrales
de membrana que permiten el
movimiento del agua y otros
solutos pequeos, neutros a travs
de membranas biolgicas. Las
acuaporinas pertenecen a la
superfamilia de protenas mayor
intrnseca (MIP), y se han
identificado en casi todos los
organismos, incluyendo
vertebrados, invertebrados, plantas
y organismos unicelulares, la
filogenia de los cuales ha sido
discutido ampliamente. Esta familia
de protenas se divide
generalmente en dos grupos,
canales de agua especficas
(acuaporinas ortodoxos), y el agua
y los facilitadores de soluto neutros
(GlpF, aquaglyceroporin), sin
embargo, estudios recientes han
sugerido que incluso los miembros
del primer grupo pueden ser
permeables a una variedad de
sustratos, incluyendo gases y los
iones. AQPs de mamferos constan
de 13 miembros homlogos con
diversos grados de similitud.
Estudios de permeacin, lleva a
cabo principalmente utilizando el
sistema de expresin de oocitos de
Xenopus, revelaron que AQP0, 1,
2, 4, 5 y 8 son AQPs ortodoxas,
mientras AQP 3, 7, 9 y 10 se
pueden clasificar como
acuagliceroporinas. La
especificidad de sustrato de las
AQPs identificados ms
recientemente, AQP11 y AQP12 no
han sido claramente identificados.
Los alineamientos de secuencias
para las 13 isoenzimas acuaporina


39
humanos se muestran en la figura.
5. Estructura general AQP es muy
conservada entre las distintas
clases y las isoformas entre
especies, a pesar de las diferencias
significativas en las similitudes de

Fig. 5. Secuencia de protenas de las 13 acuaporinas humanas. Secuencias de protenas individuales
de larga duracin, humano AQP0-12 (gi: 6912506, 267412, 728874, 2497938, 2506859, 1703358,
212276421, 3121761, 47117819, 317373323, 47117905, 47115841, 47115836, respectivamente)
fueron descargados de la base de datos de protenas PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) y


40
fueron alineados utilizando CLC principal Workbench (Ver. 6.5, CLC bio, Aarhus, Dinamarca).
Alineaciones con> 50% de conservacin se muestran con fondos cada vez ms oscuros. El logotipo
representa la secuencia de los aminocidos dentro de una alineacin de la columna determinada, con
la altura de letra proporcional a su nivel de conservacin.

Figura 2. (A) Esquema Generalizado de protenas de la familia AQP ampliado para mostrar la
conectividad. (B) Esquema generalizado de la estructura de la familia de protenas AQP contraer para
mostrar el plegamiento de protenas, gran flecha indica la trayectoria del substrato aproximada. (C)
Esquema de la unidad biolgica AQP, las flechas anchas indican trayectoria del substrato; estrecha la
flecha indica el camino propuesto de gases disueltos a travs del poro central.

secuencia. Todas las protenas de
la familia AQP deben tener seis
hlices que atraviesan la
membrana conectadas por cinco
bucles, y tienen un dominio
intracelular N-y C-terminales, la
figura. 6A. Los bucles B y E tienen
subunidades cortas helicoidales
que penetran en la membrana
plasmtica, y se relacionan entre s
a (NPA) la secuencia Asn-Pro-Ala
altamente conservadas. Los seis
dominios TM, y B y E hlices
forman un bucle de canal de
acuerdo, con las que interactan
NPA repite marcado su punto ms
estrecho, fig. 6B. La protena se
auto-ensambla en una unidad
biolgica tetramrica, donde
adems de los cuatro canales de
sustrato, se forma un poro
tetramrica adicional, la figura. 2C.
Este poro tetramrica se cree que
es responsable de la translocacin
de gases disueltos y especies
inicas. Nuestra comprensin de la
funcin AQP en biofisiologa
humana normal est en continua
expansin. Del mismo modo, los
estudios recientes han demostrado


41
alterar la distribucin AQP humana
y la expresin en situaciones
patolgicas. En consecuencia,
existe un creciente consenso de
que la modulacin de la funcin
AQP ser de utilidad teraputica.
Esta opinin destacar las
funciones AQPs normales y
patolgicas que son propensos a
responder a la intervencin
farmacolgica, as como
moduladores de AQP que pueden
ser tiles para los esfuerzos de
descubrimiento de frmacos.

2. Acuaporinas como blanco de
drogas en el Rin:
El rin es el principal rgano
encargado de regular el equilibrio
de agua fisiolgica, y es donde se
comprende mejor la funcin AQP.
Con un total de ocho AQPs que
tienen una distribucin especfica
en diferentes segmentos de la
nefrona, y tienen papeles distintos
en la reabsorcin de agua, y el
proceso de filtrado de sangre para
generar la orina. El ms
prometedor de los AQPs del rin
como un objetivo para el
descubrimiento de frmacos es
AQP2, que se expresa
principalmente en las clulas
principales de los tbulos
colectores a lo largo de las
membranas apicales, pero tambin
tiene una distribucin a lo largo de
las membranas basolateral de la
mdula renal. Como se ha
demostrado en ratones, AQP2 est
involucrado en el mecanismo de
concentracin urinaria. AQP2
mediada por la reabsorcin de
agua se lleva a cabo en respuesta
a la hormona antidiurtica arginina-
vasopresina (AVP) que conduce a
la disminucin de la produccin de
orina y el aumento de la
osmolaridad de la orina. En la
Diabetes inspida nefrognica (NDI)
a menudo se caracteriza por bajos
niveles expresivos de AQP2 y
correspondientemente alta
produccin de orina diluida.
Tpicamente, el NDI es causada
por perturbaciones en la expresin
o mutaciones en el receptor de la
vasopresina V2 AVP, sin embargo,
tambin se sugiri que las
mutaciones a AQP2 podran estar
implicados en la etiologa de


42
algunas variantes NDI, a pesar de
la produccin de AVP por lo dems
normal y la funcin del receptor V2.
Mientras que la mayora (90%) de
los casos NDI congnitas parece
estar relacionada a AVP o de su
receptor, las mutaciones de AQP2
que causan NDI se caracterizan
tanto recesivas y dominantes. El
tratamiento de NDI por focalizacin
AQP2 indirectamente a travs de
AVP o el receptor V2
probablemente ocasionar una
reduccin del beneficio teraputico,
sin embargo, en algunos casos,
puede ser til para apuntar
directamente AQP2. Adems de
NDI, AQP2 parece estar implicada
en condiciones clnicas asociadas
con la retencin de agua, tales
como la insuficiencia cardaca
congestiva y la cirrosis heptica,
as como durante el embarazo. All,
se observaron aumentos
significativos en AQP2 y su
expresin en la membrana apical
de las clulas principales. AQP2
tambin puede estar implicada en
la patognesis de la hipertensin,
donde se observaron aumentos en
su expresin y orientacin apical en
ratas espontneamente
hipertensas (SHR). En estos casos,
los inhibidores directos AQP2
pueden mostrar beneficio clnico, y
ofrecer una alternativa a la
orientacin de la va del receptor
AVP/V2. Sin embargo, el cuadro
clnico se complica por la posible
participacin de otras isoenzimas
AQP en el rin. Por ejemplo, el
aumento de expresin de AQP1 y
AQP3 tambin se encontr SHR en
los riones, y tal interaccin entre
los diversos AQPs se debe
considerar en los trastornos
humanos tambin. AQP1 es
abundante en las membranas
apical y basolateral de las clulas
epiteliales en el tbulo proximal y y
en la rama descendente delgada
del asa de Henle (DTLH), as como
en el endotelio microvascular de la
medula exterior descendente vasos
rectos (DVR). Los estudios en
ratones AQP1-nulos han
demostrado su probable
implicacin en los trastornos
renales humanos (Verkman, 2002).
AQP1 en ratones nulos tienen una
disminucin significativa de la
osmolaridad de orina como


43
consecuencia de la alteracin de la
absorcin de lquido isotnico
proximal tbulo y un mecanismo de
concentracin contracorriente renal
defectuoso. Sin embargo, los seres
humanos con una mutacin para el
antgeno de grupo sanguneo
Colton (AQP1), lo que conduce a
mutaciones homocigticas en el
gen AQP1 y un nivel de
impedimento de AQP1 en las
clulas rojas de la sangre,
muestran solamente los defectos
de concentracin renal leve incluso
bajo estrs privacin de agua. Por
otra parte, estas personas
generalmente no muestran
sntomas clnicos principales que
se pueden correlacionar
directamente a la disminucin de
AQP1 funcin. Aunque sigue
siendo posible que AQP1 pueda
ser un objetivo para los trastornos
renales, ausencia de indicacin
teraputica ha sido claramente
identificada. Otros AQPs se
expresan en el rin: AQP3 y
AQP4 en las membranas
basolateral; AQP6 en clulas
intercaladas; AQP7 y AQP8 en el
epitelio del tbulo proximal, y
AQP11 en vesculas intracelulares
del tbulo proximal. Sin embargo,
se ha informado poca evidencia
convincente que sugiere su uso
como dianas teraputicas en
trastornos renales. Curiosamente,
no se encontraron AQP11 ratones
KO para desarrollar riones
poliqusticos, y las similitudes entre
los modelos animales y modelos de
enfermedad poliqustica renal
pueden implicar un papel
patognico de AQP11. Esta
relacin puede a su vez sugerir
nuevas terapias para la
enfermedad renal poliqustica.

Conclusiones
Las acuaporinas se pueden
dividir en do subfamilias: el
primer grupo son selectivas
solo para el agua, y el segundo
grupo llamadas
acuagliceroporinas como
transportador de agua y solutos
pequeos sin carga como el
glicerol
AQP0 el principal componente
proteico de las uniones
aisladas del cristalino


44
AQP2 es un actor clave en la
concentracin de la orina. En
respuesta a la
hiperosmolaridad de suero, la
vasopresina se libera de la
glndula pituitaria

Bibliografa
Yool. A, Campbell E. M.
Structure, function and
translational relevance of
aquaporin dual water and ion
channels. Molecular Aspects of
Medicine 33 (2012) 553561
Sasaki S. Aquaporin 2: From its
discovery to molecular structure
and medical implications.
Molecular Aspects of Medicine
33 (2012) 535546
Huber V. J., Tsujita M., Nakada
T. Aquaporins in drug discovery
and pharmacotherapy.
Molecular Aspects of Medicine
33 (2012) 691703

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