Anda di halaman 1dari 4

Ambil darah (WBC) dari vena 3 mL, masukkan dalam tabung reaksi yang sudah berisi sedikit EDTA,

kocok hingga homogen untuk mencegah penggumpalan. Simpan dalam lemari es (bukan freezer)
atau termos berisi es batu.
ISOLASI DNA
Gunakan/siapkan 2 tabung untuk 1 sampel
1) Masukan 450 l cell lysis solution ke dalam tabung microcentrifuge steril
2) Tambahkan 150 l darah dan tabung diputar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenesi
& Inkubasi campuran di atas selama 10 menit dalam suhu ruang dengan steerer
3) Sentrifugasi 13.000 rpm selama 1 menit, buang supernatant (dituangkan saja keluar)
4) Tambahkan 150 l nuclei lysis solution ke pellet. Pipet larut 5-6 kali untuk melisiskan
sel darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental,inkubasi campuran
tersebut pada suhu 37 C sampai 2-3 menit (butiran tersebut hilang).
5) Tambahkan 0,75 l RNase solution dan campurkan dengan cara membolak
balik tabung, inkubasi campuran pada suhu 37 C selama 15 menit
6) Tambahkan 50 l protein precipitation solution dan vortex selama 20 detik
Sentrifugasi 13.000 rpm 3 menit .
7) Pindahkan supernatant kedalam tabung microcentrifuge bersih (diruangkan saja ke
dala) yang sudah berisi 500 l 2-propanol/isopropanol. Bolak balik tabung secara
perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA).
8) Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit. Akan
terlihat pellet putih.Buang supernatant (dituangkan saja keluar)
9) Cuci pellet dengan 200 l alcohol 70% dingin.
10) Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm 2-3 menit, buang supernatant
(dituangkan + mengunakan mikropipet untuk sisanya)
11) kering anginkan pellet DNA pada suhu ruang 5-10 menit
12) Larutan DNA dengan 50 l rehydration solution, sempurnakan rehidrasi dengan
vortex hingga larut atau inkubasi 65 C selama 1 jam (bervariasi, yang penting DNA
larut dan tak terlihat benangnya)
13) Simpan DNA pada suhu -20 C.


PCR
1. Siapkan tabung PCR 0,2 mL untuk setiap sampel dimasukkan dalam pemegang (holder) mini
sentrifuge, posisikan pada pecahan es batu halus, agar suhu terjaga dingin.
2. Masukkan ke setiap tabung 1,25 l Primer Forward secara benar tepat di dasar tabung
(tidak perlu mengganti pipet untuk setiap pengisian tabung)
3. Masukkan ke setiap tabung 6,25 l GoTaq Green Master Mix secara benar tepat di
atas Primer Forward (tidak perlu mengganti pipet untuk setiap pengisian tabung)
4. Masukkan ke setiap tabung 2 l sampel DNA secara benar tepat di atas GoTaq Green
Master Mix (harus mengganti pipet untuk setiap pengisian tabung/sampel)
5. Masukkan ke setiap tabung 16,5 l campuran Buffer pH 8+MgCl2+Water+Primer
Reverse secara benar tepat di atas sampel DNA (harus mengganti pipet untuk setiap
pengisian tabung/sampel)
6. Siapkan mesin PCR serta laptop yang sudah membuka software (pilih menu salt
rendah 40 x cycle pada window yang muncul, cari di bawah)
7. Segera tanpa membuang waktu, masukkan sample pada PCR 36-well serta pasang
pengaman tutup tabung dan tempatkan kembali ke dalam wadah pecahan es batu
(yakinkan campuran PCR menyatu dan berada didasar tabung, bila tidak maka
ketuk-ketuk kecil, jangan disentrifus)
8. Segera tanpa membuang waktu masukkan PCR 36-wel yang sudah berisi sampel ke
dalam mesin PCR dan jalankan PCR (beri nama sampel sesuai pengisian sampel DNA)


ELEKTROFORESIS
1. Siapkan marker dengan mencampur 5 L marker + 1 L lading dye (sentrifus 20 detik)
2. Siapkan PAGE pada chamber dengan possisi kaca melengkung menghadap buffer atas (klem
pakai klem kecil), semprotkan 1 mL buffer dari chamber atas ke dalam setiap kolom masing-
masing 2x semprot hingga setiap kolom terhubung dengan buffer atas dengan genangan
buffer
3. Isikan setiap kolom dengan marker 6 L serta hasil PCR 10 L (pastikan terisi dengan rapi
dan berada di dasar kolom)
4. Jalankan elektroforesis dengan tegan 100 V selama 60 menit (arus 20 mA, 120 watt)


STAINING
1. Buka kaca PAGE hati-hati agar gel tidak robek, lepas gel yang menempel pada 1 sisi kaca
menggunakan stick hitam sedikit demi sedikit dengan setiap pembukaan ditumpukkan ke
atas sehingga semua terlepas dengan posisi gel seperti bergulung.
2. Tempatkan pada wadah staining, isi fixator (asam asetat+methano)l 100 mL, Steering selama
30 menit
3. Buang larutan, cuci dengan aquadest 200 mL steering 10 menit, buang aquadest dan cuci
kembali dengan aquadest baru 200 mL, steering 3 menit
4. Buang Aquadest, masukkan 100 mL perak (AgNO
3
) steering 20-30 menit
5. Buang Perak (AgNO
3
), cuci dengan aquadest 250 mL steering 20 detik.
6. Buang aquadest, masukkan Pengembang (Na
2
CO
3
) 100 mL, goyang-goyang menggunakan
tangan 3-5 menit perlahan-lahan akan tampak pita DNA, masukkan kertas seukuran gel ke
dalam larutan tepat dibawah gel, angkat jika sepenuhnya kertas telah menjadi alas
sepenuhnya bagi gel (hentikan/buang larutan sebelum warna gel semakin gelap, namun
pastikan pita DNA target yaitu alel dan semua marker sudah tampak, targer antara pita 1-4
marker)
7. Ukur secara tepat panjang lintasan dari dasar kolom-garis pita hingga akurasi 0,05 cm (misal
2,85 cm), demikian juga pita tiap marker.
OPTIONAL
1. Masukkan 100 mL Stopper, steering 10 menit
2. Pindahkan Stopper (jangan dibuang, bisa digunakan lagi) tambahkan Completing dan
steering 10 menit (Completing jangan dibuang, bisa dipakai lagi)













REAGEN
I. PRIMER FORWARD & REVERSE 10 M
10 L stock prmier 100 uM + 90 L nuclease free water

II. BUFFER pH 8
0,0242 gr tris
Tambahkan 16 mL aquadest
Sedikit demi sedikit titrasi HCl dengan pengaduk dicelupkan (sebelum dicelup ke buffer,
HCl dipercikkan dengan ayunan tangan) hingga pH 8 pakai pH meter, tambahkan
aquadest 4 mL

III. CAMPURAN BUFFER Ph 8 + MgCl
2
+ WATER + PRIMER REVERSE (untuk 20 reaksi)
250 L BUFFER Ph 8
42,5 L nuclease free water
12,5 L MgCl
2
, 50 mM
25 L primer reverse 10 uM

IV. TBE 10x
Buat EDTA 0,5 M 0,9305 gr EDTA + 0,1 gr NaOH (ditumbuk) tambahkan aquadest
hingga 4 mL (pastikan larut sempurna)
10,8 gr tris
5,5 gr asam borat
4 mL EDTA 0,5 M
(pastikan larut sempurna)

TBE 5x
Encerkan stock 10x dengan pengenceran 2x

TBE 1x
Encerkan stock 10x dengan pengenceran 10x

V. Acrilamid-bisakrilamid 30%
29 gr acrilamid
1 gr bis-acrilamid
Tambahkan aquadest hingga 100 mL

VI. Ammonium Peroxy Sulfat 10%
2 gr Amonium Peroxy Sulfat
Tambahkan aquadest hingga 20 mL

MEMBUAT PAGE
I. Casting/cetakan
Buat 2 cetakan dengan lempeng kaca segiempat utuh dipinggirnya ditempelkan ketat
karet pada 3 sisi (2 sisi samping, 1 sisi bawah) tahan dengan tangan kiri (jika anda
pengguna tangan kanan/bukan kidal) pada jari jempol dan manis di kedua sisi
samping, tempatkan stick pipih pada kedua sisi samping tepat bersentuhan dengan
karet (bagian yang karetnya menyembul). Tumpukkan lempeng kaca bertekuk dengan
sisi tekuk sebagai atas terhadap lempeng kaca yang sebelumnya telah disusun (bagian
yang tidak tertutup karet adalah atas), pastikan simetris (dengan mengaturnya pada
bidang datar keramik). Klem ketiga sisi (dengan klem besar) yang tertutup karet.
II. Membuat Gel 20 mL untuk 2 gel
4 mL TBE 5x
3,33 mL acrilamid-bisacrilamide 30%
200 L Ammonium Peroxy Sulfat 10%
Tambahkan aquadest hingga 20 mL, pindahkan pada gelas beker
Siapkan secara pasti kedua cetakan (casting) dalam posisi siap diisi, pipet ukur 10 mL
serta campuran di atas.
17 L TEMED dimasukkan dalam campuran aduk segera dan segera ambil dengan pipet
ukur sebanyak 10 mL segera masukkan dalam cetakan pertama, bila ada lebihnya maka
masukkan ke cetakan kedua. Segera Ambil lagi 10 mL sisanya dan masukkan ke cetakan
kedua. Segera kosongkan isi pipet ukur yang tersisa ke beker glass agar tidak tersumbat
nanti. Segera masukkan sisir pencetak kolom hingga batasnya yang menonjol. Pastikan
kembali pipet ukur dibersihkan dengan menghisap air biasa kemudian disemprotkan
minimal 2x pembilasan (SEMUANYA DILAKUKAN DALAM WAKTU SESINGKAT-
SINGKATNYA, KARENA SETELAH PENAMBAHAN TEMED AKAN SEGERA TERJADI
POLIMERISASI MEMBENTUK GEL YANG APABILA TELAT MAKA TAK BISA DIHISAP PIPET
UKUR)
Tunggu 30-45 menit gel akan terbentuk kokoh, cabut sisir, lepaskan ketiga klem dan
karet (yang tersisa adalah gel dan kedua stick pipih didalam kedua lempeng kaca.

LARUTAN STAINING
I. Fiksator 500 mL
250 mL methanol
50 mL Acetat Acid 100%
Tambahkan aquadest hingga 500 mL

II. Staining Perak 500 mL
500 L formaldehyde 37%
0,5 gr AgNO
3

Tambahkan aquadest hingga 500 mL

III. Pengembang Staining
500 L formaldehyde 37%
12,5 gr Na
2
CO
3
(Natrium Carbonat)
0,0010 gr Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O (Na-Thiosulfat pentahydrate)
Tambahkan aquadest hingga 500 mL
Simpan dalam kulkas (bukan freezer), bila hendak digunakan keluarkan agar
seseaui dengan suhu ruang (bila masuk Lab dan berniat menggunakannya
keluarkan saja dari awal agar tidak kelupaan dan seiring waktu berjalan,
larutan siap pakai)

IV. Stopper
10 gr glycine
2,5 gr EDTA
Tambahkan aquadest hingga 500 mL

V. Completing
28,75 mL glycerol 87%
Tambahkan Aquadest hingga 500 mL (akhir Glycerol 5%)