MACAM-MACAM TEKNIK IMUNOASSAY

UJI PRESIPITASI

Teknik imunopresipitasi merupakan salah satu cara yang banyak dipakai untuk mengukur
kadar antigen atau antibody. Antibody yang direaksikan dengan antigen spesifik
membentuk kompleks yang tidak larut (presipitat) yang dapat diukur dengan berbagai cara.
Reaksi presipitasi dapat dilangsungkan dalam media cair maupun media semisolid (gel).
Dalam menerapkan teknik ini perlu dipertimbangkan beberapa keterbatasan. Hal yang
paling menentukan adalah spesifitas antiserum yang digunakan , dan larutan standar yang
stabil dengan kadar yang pasti. Di samping itu, reaksi imunopresipitasi dipengaruhi oleh
berbagai factor, diataranya aviditas antibody. Aviditas antibody menentukan derajat
stabilitas kompleks antigen-antibodi pada tempat pengikatan (antigen binding site).
Kompleks yang terbentuk cenderung berdisosiasi bila antibody mempunyai aviditas yang
lemah, sebaliknya makin tinggi aviditas antibody makin stabil kompleks antigen-antibodi
yang terbentuk. Selain itu, masih ada factor factor yang lain yang berpengaruh misalnya
suhu, pH, dan molaritas larutan yang dipakai dan yang tidak boleh diabaikan adalah
perbandingan antara konsentrasi antigen dengan antibody.
Beberapa jenis reaktan menghasilkan imunopresipitasi yang optimal baik pada suhu 0
0
C
maupun 37
0
C, sedangkan pH yang dianggap paling baik adalah pH yang netral, yaitu
antara 6-7,5. Pakar lain menyatakan pH sebaiknya tidak kurang dari 6 dan tidak lebih dari
8,6. Pada pH kurang dari 6 dan lebih dari 8,6 kompleks antigen-antibodi mudah
berdisosiasi sehingga tidak terjadi presipitasi. Larutan yang dipakai sebaiknya larutan
dengan molaritas 0,15 M. larutan dengan molaritas 0,15 M mencegah terjadinya
presipitasi.
ZE sempit Ag bersifat mudah larut
ZE lebar Ag bersifat tdk mudah larut, BM besar, & multikomponen Ag
Konsentrasi Ag berlebih Komplek Ag-Ab yg terbentuk larut kembali disebut
postzone effect
Konsentrasi Ab berlebih Komplek Ag-Ab yg terbentuk tetap larut disebut prozone
effect
Faktor yg mempengaruhi :
Aviditas Ab stabilitas komplek Ag-Ab
Suhu (optimal 0-37
o
C)
pH (netral = 6-7,5), pH < 6 ; >7,5 mudah disosiasi
Molaritas (molaritas < 0,15 M) ; >0,15 M men-cegah presipitasi



.
Terdapat beberapa cara pengujian pada metode presipitasi, yakni:

A. Uji Cincin
Uji cincin adalah uji presipitin yang paling sederhana. Kedalam sebuah tabung
bermulut kecil diletakkan larutan antigen diatas larutan serum yang mengandung antibodi.
Kedua larutan tersebut akan berdifusi sampai keduanya mencapai konsentrasi optimum
untuk terjadinya presipitasi, pada titik tersebut muncullah suatu zona rapat atau cincin
endapan diantara kedua larutan tersebut.

B. Metode Difusi Agar
Ketepatan yang lebih tinggi dan pemisahan komponen di dalam campuran antigen
dan antibodi dapat diperoleh dengan cara membiarkan reaktan-reaktan tersebut berdifusi
bersama-sama dalam di dalam suatu gel agar.
#Metode difusi tunggal.
Dalam metode difusi tunggal yang dirancang Oudin, antigen ditaruh diatas gel agar
yang mengandung antiserum di dalam suatu tabung reaksi bermulut sempit. Setelah
dibiarkan selama beberapa jam atau beberapa hari, antigen itu merembes ke dalam gel
membentuk pita-pita endapan pada berbagai taraf, bergantung kepada jumlah dan macam
antigen-antibodi yang ada. Karena presipitasi terjadi ketika antigen menembus gel, maka
cincin endapan mula-mula muncul di dekat puncak gel dan nampaknya bergerak perlahan ke
arah bawah. Efek semacam ini mungkin sesungguhnya disebabkan karena adanya
peningkatan jumlah antigen yang menyebabkan endapan itu melarut (karena reaksi antigen-
antibodi itu dapat balik). Presipitasi terbentuk kembali pada posisi yang lebih kebawah
dalam tabung tersebut, yaitu pada tempat konsentrasi antigen yang optimum. Faktor-faktor
yang menentukan taraf untuk terjadinya reaksi ialah ukuran molekul dan konsentrasi nisbi
reaktan.
#Metode difusi ganda.
Oakley dan Fulthorpe memodifikasi teknik Oudin dalam metode difusi tunggal
dengan cara menaruh antiserum di dalam agar di dasar tabung reaksi dan melapisinya
dengan gel agar lalu diatasnya ditaruh larutan antigen. Kedua reaktan itu berdifusi kearah
masing-masing di dalam agar dan presipitasi terjadi pada titik terdapatnya konsentrasi
optimum. Ini adalah difusi ganda satu dimensi.
Metode difusi ganda dua dimensi yang dirancang oleh Ouchterlony mempunyai
keuntungan dibandingkan dengan metode sebelumnya, bahwa berbagai antigen dan
antiserum dapat dibandingkan secara langsung. Dalam uji ini, reaktan merembes dari sumur-
sumur yang berisi antiserum dan antigen homolog dalam konsentrasi optimum. Bila pita
endapan yang dibentuk kedua antigen dan antibodi itu melebur pada titik pertemuannya,
maka berarti kedua antigen itu sama. Bila bersilangan, artinya kedua antigen itu berbeda.


# Imunodiffusi
Tes imunodifusi didasarkan pada pembentukkan imunokompleks yang berdasarkan
berat molekul yang tinggi, presipitat dan bentuk garis presipitasi dapat diamati secara
makroskopik. Metode ini untuk mendapatkan hasil diperoleh kurang lebih satu minggu
itupun hanya hasil kualitatif. Teknik imunodifusi dapat dilakukan pada cawan petri yang
mengandung agar gelatin 1% dalam suasana buffer posfat atau tris buffer. Sumur-sumur
dibuat menggunakan perforator, untuk menempatkan antigen di sumur dan serum-serum
diletakkan mengeliligi antigen. Antigen dan antibodi dalam serum akan berdifusi dalam agar
dan ketika bertemu akan membentuk garis agak kabur yang akan terlihat pada cahaya
langsung dan dengan latar belakang gelap. Kontrol positif (standar serum) harus disertakan
untuk panduan pembacaan hasil positif dan interpretasi. Teknik imunodifusi selain untuk
serum juga dapat digunakan untuk LCS dan urine. Teknik imunodifusi biasa digunakan pula
untuk deteksi antibodi terhadap jamur pathogen : Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides,
Paracoccidioides, dan beberapa jamur opportunistic yang pemeriksaannya memerlukan
waktu sekurang-kurangnya 48 jam bahkan lebih untuk mengembangkan pembentukan pita .
#Imunodifusi ganda.
Yang masih banyak dipakai adalah imunodifusi ganda menurut Ouchterlony. Teknik ini
menggunakan lapisan agar sebagai media yang memisahkan antigen dari antibodi. Pada
lapisan agar tersebut dibuat sumur-sumur, kemudian ke dalam dua sumur yang berhadapan
masing -masing dimasukkan antigen
dan antibodi. Setelah itu antigen dan antibodi dibiarkan mendifusi kedalam lapisan agar dan
ditempat dimana keduanya bertemu dan mencapai keseimbangan akan terbentuk kompleks
antigen -antibodi berupa gads presipitasi.
Teknik ini dapat dipakai untuk menetapkan antigen atau antibodi secara semikuantitatif,
yaitu dengan melakukan beberapa pengenceran dan melaporkan pengenceran tertinggi yang
masih dapat membentuk presipitasi.
# Elektroimunodifusi.
Prinsip cara elektroimunodifusi ini sama dengan cara Ouchterlony, hanya saja di sini
difusi dipercepat dengan meletakkan kedua reaktan di antara medan listrik. Juga di sini
presipitasi kompleks antigen-antibodi terjadi pada titik keseimbangan kedua reaktan.


#Imunoelektroforesis
Imunoelektroforesis
merupakan gabungan antara
teknik pemisahan fraksi-fraksi
protein dengan cara
elektroforesis dan teknik
imunodifusi ganda. Setelah
fraksi-fraksi protein dipisahkan
satu dari yang lain dengan elektroforesis, ke dalam parit yang dibuat sejajar dengan garis
migrasi fraksi-fraksi protein, dimasukkan antiserum, kemudian dibiarkan berdifusi. Setiap
fraksi protein akan beraksi dengan masing-masing antibodi spesifik yang terdapat di dalam
antiserum, sehingga masing-masing fraksi kemudian dapat diidentifikasikan secara terpisah.
Cara ini selain dapat dipakai menetapkan adanya antigen tertentu, juga dapat dipakai untuk
menunjukkan kelainan pada salah satu fraksi, misalnya kelainan imunoglobulin yang disebut
gamopati monoklonal atau paraprotein.9"0 Pada keadaan normal atau pada gamopati
polildonal garis presipitasi berbentuk lengkung merata, sedangkan paraprotein atau
gamopati monoklonal menunjukkan kelainan dalam bentuk garis presipitasi seperti
scooping, bulging atau bifurkasi.
#Imunodifusi radial
Prinsip imunodifusi radial menurut Mancini,' adalah menggunakan lapisan agar yang
telah mengandung antibodi monospesifik kemudian ke dalam sumur-sumur yang dibuat pada
agar tersebut dimasukkan serum yang akan diperiksa. Setelah serum dibiarkan berdifusi, maka
presipitasi kompleks antigen-antibodi yang terjadi tampak sebagai suatu cincin di sekitar sumur.
Cara ini adalah cara kuantitatif; besarnya cincin merupakan parameter untuk kadar antigen yang
ada dalam serum dan dapat ditentukan dengan menggunakan kurve standar. Aplikasi klinik yang
terpenting dari cara ini adalah penetapan imunoglobulin di dalam serum.
#"Rocket elektroimunodifusi".
Cara ini dikembangk:an oleh Laurell dan menupakan variasi cara imunodifusi radial.
Juga di sini digunakan lapisan agar yang telah mengandung antibodi, kemudian ke dalam sumur
sumur yang dibuat pada agar tersebut dimasukkan serum yang ingin diperiksa atau larutan
standar. Difusi dipercepat dengan meletakkan lempeng agar ini di antara medan listrik, sehingga
presipitasi kompleks antigen-antibodi tampak sebagai kerucut. Tinggi kerucut dapat diukur dan
merupakan parameter untuk kadar antigen dalam serum.
#Imunonefelometri.
Dalam dekade terakhir telah dikembangkan suatu cara yang menggunakan alat yang
dapat mengukur cahaya yang dihamburkan oleh molekul-molekul kompleks antigen-antibodi.
Dengan menggunakan sinar laser sebagai sumber cahaya yang mempunyai energi yang lebih
kuat daripada lampu halogen biasa, sensitifitas tes dapat ditingkatkan.

# VDRL (Veneral Disease Research Laboratory test)
Merupakan metode yang menggunakan prinsip presipitasi dengan bentuk produk
akhir presipitin berkumpul terlihat secara makroskopis dan mikroskopis. Pasien yang
terinfeksi treponema, pada umumnya Treponema. pallidum, penyebab shypilis membentuk
antibodi seperti protein dinamakan reagin yang akan berikatan dengan antigen cardiolipin-
lecithin-coated cholesterol partikel, menyebabkan partikel berflokulasi. Karena reagin bukan
merupakan antibodi langsung yang spesifik terhadap antigen T. pallidum, tes ini kurang
spesifik tetapi baik digunakan untuk skrining tes. VDRL merupakan satu-satunya tes yang
paling berguna untuk mendeteksi cairan LCS pasien tersangka Neuroshypilis, meskipun
kemungkinan terjadi positif palsu. Pelaksanaan tes VDRL memerlukan ketelitian, alat gelas
yang bersih, dan harus memperhatikan rincian secara tepat, termasuk kontrol kualitas rutin.
Sebagai tambahan, reagen yang akan digunakan harus disiapkan baru setiap pelaksanaan tes,
serum pasien harus diinaktivasi dengan pemanasan selama 30 menit pada 56C sebelum tes,
dan hasilnya dibaca menggunakan mikroskop.
# Counterimmunoelectrophoresis
Jenis tes lain yang menggunakan prinsip presipitasi dan penggunaannya secara luas
digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam jumlah sedikit. Kelebihan tes ini menggunakan
muatan listrik yang dialirkan pada antigen-antibodi yang dites pada sistem buffer tertentu.
Karena antigen dan antibodi dipertemukan satu sama lainnya dengan bantuan arus listrik
pada suatu matriks semisolid untuk bermigrasi sehingga metode ini disebut
Counterimmunoelectrophoresis (CIE). CIE merupakan modifikasi metode Ouchterlony yang
dipercepat migrasi antigen antibodinya oleh adanya aliran listrik. Dengan pengecualian
bakteri Streptococcus pneumonia serotype 7 dan 14, antigen bakteri akan bermuatan negatif
pada suasana sedikit basa, sedangkan antibodi bersifat netral. Sifat antigen bakteri inilah
yang digunakan pada prinsip metode CIE, dimana larutan yang mengandung antibodi dan
larutan sampel diletakkan pada lubang sumur agarosa yang diletakkan pada permukaan
kaca. Kertas atau fiber bersumbu digunakan untuk menjembatani dua agarosa yang
bersebrangan untuk dilalui buffer yang sedikit alkali. Ketika dialiri arus listrik maka akan
terjadi migrasi dari Antigen yang bermuatan negatif akan bermigrasi ke elektoda positif.
Antibodi yang bermuatan netral akan terbawa oleh elektroda negatif . pada perbatasan antara
sumur akan terbentuk zona ekuivalen, dan komplek antigen-antibodi membentuk garis
presipitasi yang nampak, proses migrasi ini memerlukan waktu satu jam. Banyak antigen
yang dapat diperiksa oleh metode CIE, mendeteksi hampir 0,01 sampai 0,05 mg/ml antigen
yang setara dengan 103 organisme/ml larutan. Perlu disertai control pada setiap pengerjaan,
CIE merupakan metode yang berdasarkan reaksi presipitasi yang cukup mahal, sehingga
tidak banyak digunakan lagi dalam imunodiagnostik.

UJI AGLUTINASI
Teknik ini merupakan metoda klasik dalam penetapan antibody atau antigen
Ag bentuk partikel direaksikan dengan Ab spesifik membentuk Aglutinasi
Reaksi 2 tahap :
o Ab dgn salah satu antigen binding site (Fab) bereaksi dgn Ag
o Fab yg lainnya berikatan dgn Ag lain yg sudah berikatan dgn Ab gumpalan
(lattice)
Faktor yang mempengaruhi: Muatan listrik protein,molaritas medium,vaksositas
media,dan fenomena prozone
Jumlah antigen & antibodi hrs seimbang
Penerapannya:
o Widal,
o gol darah
o tes kehamilan
Macam-macam Aglutinasi
a. Aglutinasi Direk
Untuk menetapkan Ab terhadap Ag yang berupa partikel atau sel
contoh pemerksaan: reaksi Widal(deteksi antibodi terhadap S.tiphy),penyakit
hemolitik, tes rheumatoid faktor (IgM dan IgG), tes syphilis dan tes kehamilan.
Interpretasi:
Gumpalan Positif
Tidak ada gumpalan Negatif
b. Aglutinasi Indirek
Untuk menetapkan antibodi terhadap Ag yang larut dengan melekatkan dengan
antigen ini terlebih dahulu pada suatu partikel yang di sebut carrier.
Partikel yang digunakan dalam teknik ini adalah lateks, eritrosit, karbon dan lain-
lain
Faktor yang mempengaruh: afinitas konjugat antigen terhadap carrier, waktu
inkubasi dengan serum penderita dan interaksi yang terjadi pada lingkungan
mikro (pH dan konsentrasi protein).
Contoh pemeriksaan: tes streptococcus grup A,Treponema pallidum,hormon
tiroid,dan deteksi anti-Hbs
Interpretasi:
Tidak ada gumpalan positif
Ada Gumpalan Negatif
c. Hambatan aglutinasi (Aglutination Inhibition)
Modifikasi teknik aglutinasi untuk mendeteksi antigen yang larut
Cara kerja:
1. serum atau cairan yang akan diperiksa direaksikan terlebih dahulu dengan
antibodi spesifik.
2. direaksikan dengan Ag yang dilekatkan pada suatu partikel.
3. Dilihat ada tidaknya aglutinasi
Interpretasi:
1. Ag yang ada pada serum atau cairan yang diperiksa, mengikat Ab spesifik
sehingga Ab tidak mampu lagi bereaksi dengan Ag pada permukaan
partikel Uji positif(+)/tidak terjadi aglutinasi
2. Apabila dalam serum atau cairan yang diperiksa tidak tedapat Ag, maka
antibodi yang bebas dapat bereaksi dengan Ag melekat pada permukaan
partikel Uji negatif(-)/terjadi aglutinasi
Contoh Pemeriksaan: uji kehamilan,penetapan FDP,mendeteks berbagai virus
seperti rubella, influenza ,parainfluenza, dan mumps

d. Aglutinasi Pasif Terbalik
Untuk menyatakan Ag yang larut dalam serum atau partikel lain.
Ab spesifik terhadap Ag bersangkutan dilekatkan pada permukaan carrier,baik
eritrosit maupun partikel lain.
e. fiksasi komplemen

Reaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yang
tidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.
Melekat pada permukaan sel pathogen dan berperan dalam penghancuran dengan
aktifitas lisis sistem komplemen
Tahap :
1. Pengikatan sejumlah komplemen oleh kompleks Ag Ab
2. Penghancuran Eritrosit yg telah dilapisi hemolisin(sebagai indicator) oleh
komplemen yang tersisa
Contoh pemeriksaan :
- Sifilis
- Jamur (Blastomyces, Coccicioides, & Histoplasma)
- Virus Herpes
- Virus Rubella
- Tripanosoma
- Schistisoma
Direct Aglutinasi Indirect Aglutinasi




Fiksasi Komplement Hambatan Aglutinasi



Aglutinasi Pasif terbalik



3. Fiksasi komplemen





TES FIKSASI KOMPLEMEN
Tes fiksasi komplemen
merupakan teknik imunologi
yang digunakan untuk
menentukan antigen spesifik atau
antibody apabila ada dalam
serum pasien. Reaksi fiksasi
komplemen dapat
menentukan kadar antibodi yang
rendah yang tidak dapat
dideteksi dengan cara uji
presipitasi ataupun aglutinasi.


Metode ini sangat umum digunakan untuk membedakan dan menemukan penyebab
infeksi. Pada umumnya digunakan untuk pemeriksaan mikroorganisme yang sulit di identifikasi
melalui metode pembiakan. Akan tetapi metode ini telah tergantikan oleh metode serological
lainnya dalam dignosa klinik seperti ELISA dan metoda identifikasi patogen yang didasarkan
pada DNA khususnya polymerase chain reaction (PCR).
Pada teknik fiksasi komplemen, komplemen digunakan ketika antigen bereaksi dengan
antibodi. Komplemen dapat ditemukan pada serum babi Guinea. Ketika sel darah merah
ditambahkan dengan anti-red-cell-antibody, sel darah merah akan lisis ketika ditambahkan
komplemen (hasil tes negatif). Apabila dalam serum mengandung antibodi maka complemen
akan menfiksasi ikatan antigen dan antibodi sehingga ketika ditambahkan anti-red-cell antibodi
tidak menghasilkan hemolisis sehingga tes menunjukkan hasil positif.

Aplikasi Fiksasi Komplemen, Misalnya pada deteksi :
1. Adenovirus
2. Trypanosoma
3. Jamur (Blastomyces, Coccicioides, & Histoplasma)
4. Virus Influenza A & B
5. Parainfluenza 1, 2, & 3
6. Poliovirus 1, 2, & 3
Respiratory Syncitial Virus (RSV)

UJI MUNOFLOURESCENT
Merupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga
menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violet
Mereaksikan antibody dan antigen spesifik dan anti-antibodi yang dilabel dengan
Fluoresence Isothiocyanat (FITC) sehingga terpancar sinar warna hijau atau label dengan
Rodhamin menghasilkan warna merah
Fluorescent Antibody Technique (FAT) untuk penggunaan didalam mikrobiologi telah
diperlihatkan pertama kali oleh Coons, at all pada tahun 1942 dan mulai diperkenalkan
sejak tahun 1962 dalam bidang pemeriksaan parasitologi dengan memakai tekhnik
indirect fluorescent antibody test
Jenis sampel: serum, cairan ludah, cairan otak, cairan mata , urine,mukosa usus, mukosa
mulut, dan dalam jaringan.
Penerapannya : 1. Deteksi Echerchia antibody,
2. Deteksi Fluorescent Treponemal antibody (FTA)
3. Deteksi Legionnella antibody
4. Deteksi Mumps IgM antibody
5. Deteksi Q Fever antibody
6. Deteksi Rocky Mountain Spotted Fever antibody
7. Deteksi Toxoplasma IgG antibody
8. Deteksi Typhus antibody
Jenis-jenis Imunoflourecent:
1. Direct immunoflourescent :
Untuk pemeriksaan antigen
Ab dilabel dengan marker fluorescent Ab secara langsung diberikan pada jaringan yg
diinginkan
Cara Pemeriksaan.
1. Sel pada deck cover glass yang diinfeksi dengan virus difiksasi dengan aceton-20
o
C
selama 15 menit.
2. Cuci dengan PBS dan keringkan pada temperature ruangan sampai kering.
3. Masukan deck cover glass pada PBS yang mengandung 1%FCS dan biarkan 15
menit.
4. Siapkan serum sampel dan encerkan dengan PBS sesuai keperluan.
5. Teteskan 20l serum sampel di atas glass obyek.
6. Taruh deck cover glass di atas sampel dengan bagian sel di bawah dan letakkan
dalam kotak dan kertas yang telah dibasahi dengan air.
7. Inkubasi pada incubator denagan temperatur 37
o
C selama 45 menit.
8. Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 Menit.
9. Siapkan Konjugat fragmen Imunoglobulin dengan pengenceran 1:100l.
10. Teteskan Konjugat 20l di atas glas obyek dan letakkan deck cover glass di atasnya.
11. Inkubasi pada incubator dengan temperatur 37
o
C selama 15 menit
12. Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 menit dan selanjutnya angkat deck cover glass
dan sentuhkan deck cpver glass pada kertas tissue agar airnya berkurang, sehingga
kering tapi basa.
13. Teteskan Glycerin 50% 20l di atas glass obyek dan selanjutnya deck cover glass di
taruh diatasnya dan langsung dilihat hasilnya dengan mikroskop fluorescent pada
pembesaran 40x. catatan preparat ini dapat disimpan pada 4
o
C sampai 2-3 minggu.
2. In-direct immunoflourescent
Untuk mendeteksi antibody terhadap jaringan atau komponen sel tertentu
Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji dengan Ab sekunder yang berlabel
(yang berikatan spesifik dg Ab pertama). Semakin banyak ikatan Ab sekunder sinyal
floresen semakin meningkat
Cara pemeriksaan:
1. Antigen mikroba diletakkan dalam kaca objek dan diberi bahan fiksatif
2. Serum pasien yang telah diencerkan diinkubasi bersama antigen pada kaca
objek, kemudian dicuci
3. Ditambahkan Antibodi berlabel flouresen (konjugat)
4. Kaca objek dicuci hemudian dikeringkan, kemudian dibaca dibawah mikroskop
flouresen
Preparat diamati adanya area terang berfloresensi warna hijau dan dibandingkan dengan
control positif dan negatif. Adanya floresensi hijau menandakan adanya antibodi terhadap
antigen
Direct Flouresence Indirect Flouresence









RADIOIMMUNOASSAY



Prinsip dasar :
Didasarkan pada reaksi antara antibodiDidasarkan pada reaksi antara antibodi(dalam
konsentrasi terbatas) dengan(dalam konsentrasi terbatas) denganberbagai konsentrasi
antigenberbagai konsentrasi antigen.
Kegunaan:
* Digunakan untuk menemukan antigen
* Digunakan untuk menemukan antigen tunggal/antibodi dalam cairan biologis
tunggal/antibodi dalam cairan biologis
*Tehnik pemeriksaan untuk menentukanantibodi/antigen dengan reagen yangantibodi/antigen
dengan reagen yang bertanda zat radioaktif.

Ab + Ag berlabel + radioisotope


ikatan Ab-Ag berlabel-radioisotop


Jumlah Ag berlabel yg terikat pd Ab diukur dggamma counter
Terdapat dua cara pemeriksaan RIA:
A. Reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase )/Kompetitif
1. Antibodi diimobilisasi (ditempelkan) pada suatu fase padat misalnya
dinding tabung plastic
2. Sampel pasien Ag ditambahkan bersama dengan sejumlah tertentu Ag
berlabel radioaktif yang akan berinteraksi dengan antibodi yang timbul.
3. Ag-Ag berlabel-Ab bereaksi kompetitf dan membentuk kompleks Ag-Ab-
Ag berlabel
4. Pemisahan kompleks Ag-Ab-Ag berlabel dengan mengendapkannya
secara kimiawi menggunakan ammonium sulfat,asam
trichlorasetat/polietilen glikol,maupun mereaksikannya dengan antibody
kedua atau filtrasi dengan gel
B. Reaksi pada zat padat atau partikel (solid phase)/Non Kompetitif/Sandwich
1. Melekatkan Ag atau Ab pada suatu partikel
2. Mereaksikannya dengan specimen(Ag) yang akan di uji.
3. Ditambahkan Ab berlabel
4. Terbentuk kompleks Ab-Ag-Ab berlabel,lalu dipisahkan dan diukur
radioaktivitasnya
5. Banyaknya Ab berlabel yang terikat pada kompleks merupakan kadar Ag
dalam spesimen
Keuntungan : Sensitivitas dan presisi yang tinggi ,Mudah dikerjakan, Pekerjaannya lebih
cepat dan tidak memerlukan sampel yang besar.
Kerugian : Reagen kurang stabil, Memerlukan proteksi terhadap bahan radioaktif
(radioactive hazardous)
Contoh pemriksaan : HBsAg,anti HBs,macam-macam hormone,macam-macam pertanda
ganas,dan IgE spesifik




ENZYME IMMUNOASSAY (EIA)/ ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang
terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen
dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis,
patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah
antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik
dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini
terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah
oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan
panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya
fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan
solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui
penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang
spesifik untuk antigen yang sama, disebut sandwich ELISA). Setelah antigen diimobilisasi,
antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi
dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder
yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci
dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak
terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalamplate ditambahkan substrat enzimatik untuk
memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik
ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA
- ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, (seperti
dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen.
- Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen
potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur.
- ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada
berbagai kelas obat.
- Kegunaan lain dari ELISA meliputi:
1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.
2. deteksi rotavirus dalam tinja.
3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.
4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

Tipe-tipe ELISA
Ada beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Indirect ELISA
2. Sandwich ELISA
3. Competitive ELISA

1. Indirect ELISA














Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi
antibodi dalam serum adalah:
a) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan
plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan
menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari
suatu sampel yang akan diuji.
b) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA)
atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal
sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain
ke plate.
c) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum
dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang
digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi
karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen
standar.
d) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan
dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan
lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
e) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan
dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat
spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
f) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
g) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
h) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang
tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama
dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga
setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga
konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain
saat pengikatan pada permukaan lubang.

2. Sandwich ELISA














Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
a) Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap
b) Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
c) Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
d) Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
e) Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
f) Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan
dengan antibodi primer
g) Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
h) Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia
i) Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel
yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa
lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein
serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas
antigen yang terimobilisasi.
Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

3. Competitive ELISA

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas
sebelumnya, yaitu:
a) Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel,
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada
permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder
ini berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/
fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal
yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

















4. Beberapa dan Portable ELISA (M & P ELISA) (ELISA Reverse dimakalah yang
diterbitkan)

Sebuah teknik baru (EP 1 499 894 B1 di EPO Buletin 25.02.209 N. 2009/09; USPTO
7510687 di USPTO Buletin 2009/03/31; ZL 03.810.029,0 di SIPO RRC Buletin
2009/08/04) menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang dengan
8-12 ogives menonjol. Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi sampel
dikumpulkan dan langkah-langkah berikut (cuci, inkubasi dalam conjugate dan inkubasi
dalam chromogenous) dilakukan oleh mencelupkan ogives di microwells standar
microplates pra-diisi dengan reagen.

Kerugian ELISA:
Reaksi enzim lebih kompleks dari pada label isotop
Masih dipengaruhi faktor environment (plasma constituents)

Keuntungan ELISA:
Mudah dikerjakan
Relatif murah, simultan dgn pemeriksaan yg lain
Bahaya radioaktif (-)




IMMUNOBLOTING
Teknik western blot, atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan untuk
menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot menggunakan gel elektroforesis
untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida. Protein tersebut akan
ditransfer ke nitroselulosa atau PVDF dan diberi antibody spesifik untuk identifikasi
protein target
Ditemukan oleh George stark pada Universitas Stanford. Nama western blot diberikan
pada teknik tersebut oleh Neal Burnette and Sushant Bhat, merupakan nama yang
dimiripkan dengan teknik deteksi DNA southern blot yang ditemukan Edwin southern
dan Northern blot yang digunakan deteksi RNA.
Penerapannya : Untuk konfirmasi serum HIV
Tahapnya :
2.1 Persiapan Sampel
Sampel bisa diambil dari kultur sel maupun bagian dari jaringan.
Untuk jaringan yang solid bperlu dilakukan penghancuran menggunakna
blender atau homogenizer.
Detergen, garam dan buffer juga bisa digunakan untuk melisiskan
membrane sel.
Protease dan phospatase inhibitor diberikan untuk mencegah terjadinya
pemecahan jaringan dengan enzimnya sendiri.
Persiapan jaringan biasanya dilakukan apda suhu dingin untuk mencegah
degradasi protein. Untuk memisahkan komponen sel dengan organel,
dilakukan sentrifugasi.
Protein dari sampel diseparasi mengunakan elektoforesis SDS page
berdasarkan isoelektrik poin, berat molekul, kelistrikan atau kombinasinya
SDS PAGE akan mempertahankan polipeptida dalam bentuk denaturasi
setelah dibersihkan dari struktur sekunder dan tersier sehingga protein
dapat dipisah berdasarkan berat molekul.

Gambar 1. Langkah dalam persiapan sampel western blot


2.2 Transfer
Untuk membuat protein dari SDS page bisa dideteksi oleh antibody,
protein tersebut perlu ditransfer dari gel ke membrane nitroselulosa atau
polyindylidene difluoride (PVDF).
Membrane tersbut diletakkan di atas gel dan ditambahkan buffer. Protein
akan masuk pada membrane dan siap dideteksi dengan western blot
Untuk mengecek keseragaman dari transfer protein dari gel ke membrane
dapat dicek dengan pewarnaan commasie brilliant blue dan ponceau S

Gambar 2. Langkah dalam SDS PAGE
2.3 Blocking
Blocking dilakukan untuk mencegah antibody sekunder bereaksi dengan
protein non spesifik yang masuk pada sampel.
Blocking biasanya menggunakan BSA atau susu skim tanpa lemak pada
TBS.
pemberian Tween 20 atau Tritonn X-100 dapat memperjelas hasil final
dari western blot mengurangi false positif
2.4 Deteksi Dua Langkah
Pada saat deteksi membran dengan antibody, untuk deteksi dua langkah
dilakukan persiapan antibody primer yang dibentuk dari produksi mandiri.
Antibody primer dengan antigen yang di inginkan diberikan sesuai dengan
sampelnya. Antibody primer yang digunakan pada sampel ini ialah
antibody poliklonal terhadap protein Shigella 49kDa.
Solusi antibody dan membran dapat disimpan setelah itu diberikan
antibody sekunder yang berikatan dengan antibody primer. Sehingga
dengan bantuan horseradish peroxidase akan terjadi luminasi sesuai
dengan jumlah protein.

Gambar 2. Langkah dalam Western blot


APLIKASI IMMUNOKROMATOGRAFI (ICA)
Pemeriksaan HbsAg
Immunochromatography test (ICT) HBsAg merupakan uji imunokromatografi yang dapat
mendeteksi antigen yang terdapat pada serum atau plasma. Prinsip dasarnya adalah adanya
pengikatan antara antigen (HBsAG) dengan antibody (anti-HBs) pada daerah test line,
selanjutnya antibody akan berikatan dengan colloidal gold-labeled conjugate. Komplek yang
terbentuk akan bergerak pada membran nitroselulosa.
Pemeriksaan Plano / HCG
HCG sebagai antigen, akan berikatan dengan anti HCG. Gaya kapilaritas membawa senyawa
ikatan HCG dan anti HCG-1 menuju daerah T. Di daerah T, anti HCG-2 akan berikatan dengan
HCG yang telah berikatan dengan anti HCG-1 namun pada epitop yang berbeda. Terbentuklah
kompleks anti HCG-1, HCG, dan anti HCG-2. Enzim menjadi aktif dan daerah T berwarna
merah. Selanjutnya, sisa anti HCG-1 yang belum berikatan dengan HCG akan menuju daerah C
dan berikatan dengan anti-anti HCG-1. Kompleks ini akan mengaktifkan enzin sehingga daerah
T berwarna merah

Pemeriksaan Narkoba
Pada strip mengandung konjungat drugs IgG anti narkoba, dimana subtrat urin yang
mengandung drugs (AMP/THC/MOR) akan bereaksi dengan konjungat dimana hasil (+) ditandai
dengan terbentuknya garis merah pada test, (-) pada control.

Pemeriksaan Dengue
Pada bagian kertas terdapat reagen pelacak berupa antibody yang telah dilabel oleh zat warna
(colloidal gold) yang akan berikatan dengan analit, selanjutnya ikatan ini akan ditangkap oleh
reagen (antigen/ antibody spesifik) pada garis yang dalam keadaan terikat sehingga akan
menghasilkan reaksi reagen pelacak-label zat warna-analit-reagen pelacak. Zat warna yang
terperangkap pada garis tes (T) akan menghasilkan warna, menandakan bahwa hasil pemeriksaan
positif. Kelebihan reagen pelacak akan bereaksi dengan antigen/antibody atau anti-antibodi pada
garis control, sehingga selalu menghasilkan warna pada garis control.

Pemeriksaan TB
Pemeriksaan Mycotec TB
xp
(Recombinant) metode imunokromatografi assay adalah
menggunakan konjugat dengan gold colloidal particle yang akan bergerak menuju area tes yang
telah dilapisi dengan beberapa antigen TB recombinan yakni 38 kD, 16 kD dan 6 kD Early
Secrefed Antigen Target (ESAT-6) begitu sampel pasien diteteskan ke dalam sumur sampel. Jika
sampel pasien yang diperiksa mengandung antibodi terhadap TB, maka akan terbentuk garis
berwarna merah muda atau ungu pada area tes (T). Sisa dari kompleks yang tidak berikatan
dengan antibodi TB tersebut akan terus bergerak ke arah area kontrol (C) sehingga terbentuk
garis berwarna merah muda atau ungu di area kontrol. Hal tersebut menandakan bahwa tes
bereaksi dengan baik.

Pemeriksaan HIV
Imunokromaografi dimana membran dilapisi oleh antogen HIV rekombinan pada garis
tes.Pada saat serum diteteskan pada salah satu ruang membran,sampel akan bereaksi dengan
partikel yang telah dilapisi dengan protein A yang terdapat pada bantalan specimen.Selanjutnya
campuran akan bergerak secara kromatografi ke ujung membran dan beraksi dengan antigen HIV
rekombinan yang terdapat pada garis tes.Jika serum/plasma mengandung antibodi HIV-1/HIV-2
maka akan timbul garis warna pada garis tes
Pemeriksaan HCV
Antigen HCV bergerak melalui membran immunofiltrasi. Sampel dan reagen bergerak
kemembran dan diserap masuk kedalam pada Sampel pasien bergerak ke membran, antibodi
HCV dari serum / plasma, terikat pada antigen pergerakan. Pada tahap pencucian protein serum
atau plasma yang tidak terikat dikeluarkan.Pada tahap selanjutnya, konjungat protein A
ditambahkan yang akan mengikat bagian FC dari antibodi FC dari antibodi HCV untuk
memberikan warna dot pada area tes (T1/T2). Pada area control (c) terdapat dot kontrol
kualitas yang berfungsi pada permukaan, reagen dan aplikasi prosedur yang benar.