Anda di halaman 1dari 10

I.

TUJUAN
1. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.
2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti
manual pengoperasian HPLC.
3. Untuk mengetahui penerapan HPLC dalam analisis senyawa capsaicin
pada cemilan pedas.

II. PRINSIP
Pemisahan komponen-komponen sampel dengan cara melewatkan sampel
pada suatu kolom, yang selanjutnya dilakukan pengukuran kadar masing-masing
komponen-komponen tersebut dengan suatu detektor. Pada dasarnya detektor
membandingkan respon dari komponen sampel dengan respon dari larutan standar.

III. TEORI DASAR
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau kromatografi cair
kinerja tinggi menggunakancairan sebagai fasa gerak dan fasa diamnya. Kromatografi
didasarkan atas distribusi partisi sampel (komponen) diantara fasa gerak dan fasa
diam. Fasa gerak yaitu fasa yang bergerak dengan arah yang telah ditentukan. Fasa
gerak bergerak melalui fasa diam. Sedangkanfasa diam adalah fasa yang secara tetap
tidak bergerak (Hendayana, 2006).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal
digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai
3-5 m (1m = 10
-6
m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai
20.000 Kpa ( 200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut
(Underwood, Day. 2002 : 553).
Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja
telah memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah
menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai
kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan
perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu
sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan(Underwood, Day. 2002 : 553).
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :
a) Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun
disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel
silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana
memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan
panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom
akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa
non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat
melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya
maka sistem ini disebut HPLC fase normal.
b) Fase Balik HPLC
Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi
menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini,
akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam
campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara
rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-
molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat
bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak
lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Prinsip kerja instumentasi HPLC
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah
campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap
komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan
HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC
jenis fasa terbalik adalah RMe
2
SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8.
Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi),
misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan
dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu
retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya
terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan
menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada
kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu
tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa
anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi
(beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat
tinggi seperti polimer(Hendayana, 2006).

Cara kerja instumentasi HPLC
Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom
kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran
fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap
fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar
dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa
diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang
keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram(Hendayana, 2006).

Komponen-komponen instrumentasi HPLC
1. Fasa Gerak
Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Dalam
HPLC fasa gerak selain berfungsi untuk membawa komponen-komponen campuran
menuju ke detektor, selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena
itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan proses
pemisahan. Persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak sebagai
berikut:
a) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis
b) Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram
c) Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom
d) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
e) Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi)
yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien
diguakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika
sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal, fasa gerak yang paling sering digunakan
adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang
umum dibanding fase terbalik.

2. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan
campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama
dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom
ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan
fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman.
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan,
misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama
untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter dalam
berkisar 4,510 mm.
Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya
sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan
diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari
ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu:
menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa gerak
dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.
Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a) Kolom analitik
b) Kolom preparatif

3. Pompa
Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui
kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode
ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar
mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar
zat cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang
bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan
sebagai berikut :
a) Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi
b) Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
c) Bahan tahan korosi
d) Keluaran bebas pulse

4. Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)
kromatografi adalah penyuntik loop. Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh
dicabut sebelum pegangan (handle) penyuntik diputar dari posisi load (pengisap) ke
posisi inject (suntik). Karena sampel akan mengalir ke saluran pembuangan.
Beberapa teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai
berikut :
a) Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe
yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi stringe ini
sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
b) Injeksi Stop Flow
Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung kembali
kolom maka pelarut dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan kedalam fasa
gerak perlu dua langkah : sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dan
posisi load. Cuplikan masih berada dalam loop ; kran diputar untuk mengubah
posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan kedalam
kolom (kran cuplikan).
c) Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan.
Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu:
sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan
masih berada dalam loop; kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi
injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.

5. Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap
golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka
terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang
digunakan dalam KCKT adalah
a) Detektor Universal
Detektor Ultra Violet Visible (Sinar Tampak)
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa
organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga
panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan
yang diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena
sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di
analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang
pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang
panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm.
Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis
apapun, termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah
perubahan indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini
bersifat tidak merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10
-6

g) dan umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak
dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi
dan dalam analisis karbohidrat.
b) Detektor Selektif
Detektor Fluoresensi
Didasarkan kepada prinsip bahwa molekul-molekul tertentu dapat menyerap
energi pada panjang gelombang yang lebih pendek membentuk suatu keadaan
tereksitasi dan kemudian secara hampi bersamaan turun kembali ke keadaan dasar
(ground state) dengan memancarkan energi pada panjang gelombang yang lebih
panjang.

Detektor Konduktivitas Listrik
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik
(konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan
untuk mendeteksi solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa
organik maupun anorganik. Adapun persyaratan detektor yaitu: cukup sensitif,
stabilitas, dan keterulangan tinggi, tidak erusak cuplikan, respon linier terhadap solut,
reliabilitas tinggi dan mudah digunakan.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
a) Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibel
b) Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
sangat kecil
c) Stabil dalam pengoperasiannya
d) Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita
e) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas
f) Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak

6. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen
dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif
dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (r
t
) analit atau sampel
dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan
didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar
kalibrasi(Hendayana, 2006).

IV. KESIMPULAN
1. Cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif dapat dipahami.
2. Preparasi sampel dapat dilakukan dengan tepat dan akurat, serta
pengoperasian manual HPLC dapat diikuti.
3. Senyawa capsaicin pada cemilan pedas dapat dianalisis dengan
menggunakan instrumen HPLC dengan kemungkinan waktu retensi yang
merupakan senyawa kimia dalam sampel yaitu 1.642, 1.942, 3.067, 4.558,
dan 8.817 menit untuk sampel stik; 4.792 menit untuk keripik mie; dan
1.925, 2.192, 3.117, 4.608, dan 8.958 menit untuk keripik ikan.




DAFTAR PUSTAKA

Day, R.A., A.L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.
Hendayana, Sumar. (2006) .KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan
Elektroforensis Modern.Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.
Muchena, J.K. 2009. Studies of Capsaicinoids Contents of Locally Grown and
Commercial Chilies Using Reversed-Phase High Performance Liquid
Chromatography. Tersedia di
http://dc.etsu.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=3152&context=etd [diakses
tanggal 21 November 2013]