Istilah-istilah yang umum digunakan dalam kultur

jaringan adalah:

Bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan untuk
inisiasi suatu kultur disebut eksplan.
Pemindahan kultur ke media lain baik media yang sama
ataupun yang lain disebut subkultur.
Setiap masa inkubasi disebut passage. Passage pertama
adalah subkultur pertama dari jaringan yang terbentuk dari
eksplan awal.
Bahan yang diambil pada setiap subkultur disebut sebagai
inokulum. Eksplan harus diusahakan supaya dalam
keadaan aseptic melalui prosedur sterilisasi dengan
berbagai bahan kimia. Dari eksplan yang aseptic kemudian
diperoleh kultur yang asenik yaitu kultur dengan hanya satu
macam organisme yang diinginkan.
Eksplan yang ditanam pada media tumbuh yang tepat
dapat beregenerasi melalui proses yang disebut
organogenesis atau
embriogenesis.

Organogenesis artinya proses terbentuknya organ-organ seperti pucuk dan
akar. Pucuk yang terbentuk pada tempat yang bukan berasal dari jaringan
asal yang biasa, disebut pucuk adventif. Contohnya, pucuk yang
terbentuk dari kalus, pucuk yang terbentuk dari hipokoyil, dari kotiledon
atau akar.
Embriogenesis adalah proses terbentuknya embrio somatic. Embrio
somatic adalah embrio yang bukan berasal dari zigot, tetapi dari sel biasa
dari tubuh tanaman. Bila embrio terbentuk langsung dari anther atau
mikrospora, prosesnya disebut androgenesis. Proses pembentukan embrio
dari ovari yang belummengalami fertilisasi, disebut gynogenesis.
Tanaman lengkap hasil regenerasi dalam kultur jaringan disebut plantlet.
Plantlet sebelum dipindah ke lapangan dan diperlakukan sebagai bibit harus
mengalami masa adaptasi dari kultur heterotropik menjadi autotropik. Masa
adaptasi plantlet disebut aklimatisasi.
Pucuk-pucuk yang terbentuk dari jaringan kalus terutama yang sudah
mengalami subkultur dapat bervariasi. Variasi ini disebut variasi
somaklonal. Penyebabnya belum diketahui secara pasti, ada kemungkinan
variasi ini sudah ada dalam eksplan asal karena kromosom mosaik dalam
sel-sel somatic; tau terjadi akibat lingkungan dalam kultur. Salah satu
variasi yang terjadi adalah aneuploid: jumlah kromosom 2n-1 atau
2n+1.
Media kultur jaringan tanaman
Apa perlunya?
Apa yang dilakukan oleh tanaman
pada KJT?
Sel-sel tanaman Dediferensiasi
Pembelahan sel tanaman Sel-sel
tanaman adalah diploid
Mitosis kromosom menduplikasikan
diri dan membentuk klon
Meiosis Proses pembentukan sel
sex, 2n memisahkan diri dan menjadi
gamet 1n
MEDIUM KULTUR
Keberhasilan dalam teknologi serta
penggunaan metode in vitro terutama
disebabkan pengetahuan tentang
kebutuhan hara sel dan jaringan.
komponen utama penyusun media
kultur.
Garam mineral Hara
Makro: C,H,O,
N,S,P,K,Ca,Mg &
mikro :Fe,Mn,B,Zn,
Cu,Mo,Cl dan Co.
Sumber karbon:
glukosa 2-4% dan
sukrosa (terbaik)
Vitamin : Tiamin,
piridoksin,as.nikotinat
dan mio-inositol.
Pengatur tumbuh:
untuk menginduksi
pembelahan sel
Auksin : IAA,NAA &
2,4-Diklrofenoksi-
asetat(2,4-D).
Sitokinin : kinetin,
benziladenin(BA), 6-
benzilaminopurin
(BAP).
Pelengkap organik:
dapat merangsang laju
pertumbuhan sel.
GARAM-GARAM MINERAL
Unsur hara makro & mikro diberikan dalam
bentuk Garam anorganik pada media.
Larutan garam makro konsentrasi rendah
lebih baik drpd media dengan konsentrasi
tinggi.
Perbaikan pada penambahan garam
mineral NO3 & K Menunjang pertumbuhan
kalus,pertumbuhan pucuk dan
embriogenesis pada banyak tanaman.
SUMBER KARBON
Sukrosa dalam media dihidrolisa jadi
monosakarida selama masa kultur.
Dalam kultr kalus dan puck 2-4 %
optimum, sdgkan kultur embrio dapat
mencapai 12%
Selain sumber energi, gula berfungsi
sebagai tekanan osmotik dalam
media
VITAMIN
Thiamine(B1) yang paling sering dan
penting digunakan. Piridoksin ( B 6 ) ,
as.nikotianat untuk kultur akar.
Mio-inositol (vit.tanaman) untuk mem
perbaiki pertumbuhan &morfogenesis
Vit.E juga dapat merangsang
pembentukan kalus dalam kultur emb
rio jagung.

ZAT PENGATUR TUMBUH
AUKSIN dgunakan
untuk merangsang
pertumbuhan kalus
Level dlm eksplan
tergntung dr bgian dan
jenis tanaman
Alamiah:indole acetic
acid (IAA)
2,4-
dichlorophenoxyacetic
acid (2,4D)
naphthaleneaceic acid
(NAA)

Pengaruhnya terha
dap pertumbuhan
jaringan melalui 2 cara
yi :
Menginduksi sekre si
ion H keluar sel mellui
dinding sel
Mempengaruhi
metabolisme RNA
yang berarti meta
bolisme protein


ZAT PENGATUR TUMBUH
SITOKININ turunan
adenin.
Sangat penting dlm
pembelahan sel dan
morfogenesis.
Kinetin diisolasi dr
DNA ikan Herring yg
diautoklaf dalm larutan
asam oleh Prof.Skoog
dr WI merangsang
pembelahan sel &
diffrensiasi sel.
Gliberilin kadang mem
bantu morfogenesis
Sitokinin yg biasa
digunakan : Kinetin,
Zeatin, ZiP,BAP & BA
(benzyladenine ).
-auxin - Roots
-cytokinin - Shoots
-gibberellin Cell Enlargement
-abscisic acid Plant stress hormone
-ethylene BAD!

BAHAN PEMADAT MEDIA
Paling banyak digunakan
adalah agar agar
mengandung Ca,Mg,K
dan Na.
Keuntungan pemakaian
agar-agar :
1.membeku pd suhu 45 C
dan cair pd suhu 100 C.
2.Tidak dicerna oleh enzim
tanaman.
3.Tdk bereaksi dgn
penyusun media yang
lain.
Kons agar : 0,1-1,0%
Konsentrasi agar yang
terlalu tinggi dapat
mengurangi difusi
persenyawaan dari dan
ke arah eksplan shg
pengambilannya kurang
sedangkan zat pengham
bat dari eksplan tetap
berkumpul disekitar
eksplan.
PELENGKAP ORGANIK
Air kelapa dapat
digunakan untuk
mempertahankan
pertumbuhan.
Auksin tertentu & air
kelapa dapat bersifat
sinergis.
Kandungannya:
as.amino, as.orgnk
as.nukleat,purin,
gula,gula alkohol dan
zat pengatur tumbuhn
Zat pengatur tumbuh
yi :Zeatin, N-N-Difenil
urea & 9--D ribo
furanosil zeatin.
Casein Hidrolisat sbg
as.amino yang murah
Digunakan dlm media
yg tdk mengandung
ion amonium
Digunakan 200mg/l
dpt memperbaiki
pertumbuhan kalus.
PELENGKAP ORGANIK
Ekstrak Ragi
digunakan pd awal
sejarah KJT oleh White
dan Robbins
As.amino,peptida,
vitamin untuk per
tumbuhan kultur akar
Kons.0,5-2 g/l
Jus Tomat, ekstrak
Pisang dan kentang
merupakan sumber
gula, vit dan zat
pengatur tumbuh.
Penggunaannya
dihindarkan karna tdk
spesifik & hasil yg
diperoleh kadng tidak
dapat diulangi kembali
ARANG AKTIF
Arang yang sudah
dipanaskan dengan
uap atau udara panas,
bersifat adsorp si
sangat kuat.
Dapat ditambahkan
kedalam media pd
berbagai tahap
perkembangan kul tur.
Dpt ditambahkan pd
media inisiasi,
m.regenerasi, dan
m.perakaran.
Pengaruh arang aktif :
1.mengadsorpsi senyaw
toksik yg terdpt dlm
media;Seny.Fenolik
2.mengadsopsi zat
pengatur tumbuh shg
mencegah pertumbhan
liar & membantu embri
ogenesis.
3.merangsang perakarn
dgn mengurangi tingkt
cahaya yg sampai ke
bagian eksplan yg
terdpt dalam media.
pH MEDIA
Harus diatur agar
tdk mengganggu
fngsi membran sel
dan pH sitoplasma
Selain memperhati
kan kepentingan
fisiologi sel jugahrs
memperhatikan:
1.Kelarutan dr garam
garam penyusun
2.pengambilan dr zat
pengatur tumbuh.
3. Efisiensi pembeku
an agar.
Sel tanaman mem
butuhkan pH yang
sedikit asam 5,5
5,8.
Penambahan asam
amino sbg buffer
organik
BEBERAPA KOMPOSISI MEDIA

Components Murashige
-
Skoog
(1962)
White
(1963
Gamborg
(1968)
Nitsch
(1951)
Heller
(1953)
Schenk-
Hildebr
andt
(1972)
Nitsch -
Nitsch
(1967)
Kohlenbach
-
Schmidt
(1975)
Knop
(1865)
(NH
4
)
2
SO
4
- - 134 - - - - - -
MgSO
4
7H
2
O 370 720 500 250 250 400 125 185 250
Na
2
SO
4
- 200 - - - - - - -
KC1 - 65 - 1,500 750 - - - -
CaC1
2
2H
2
O 440 - 150 25 75 200 - 166 -
NaNO
3
- - - - 600 - - - -
KNO
3
1,900 80 3,000 2,000 - 2,500 125 950 250
Ca(NO
3
)
2
4H
2
O
- 300 - - - - 500 - 1,000
NH
4
NO
3
1,650 - - - - - - 720 -
NaH
2
PO
4
H
2
O - 16.5 150 250 125 - - - -
NH
4
H
2
PO
4
- - - - - 300 - - -
KH
2
PO
4
170 - - - _ - 125 68 250
FeSO
4
7H
2
) 27.8 - 27.8 - - 15 27.85 27.85 -
Na
2
EDTA 37.3 - 37.3 - - 20 37.25 37.25 -
MnSO
4
4H
2
O 22.3 7
10(1H
2
O)
3 0.1 10 25 25 -
ZnSO
4
7H
2
O 8.6 3 2 0.5 1 0.1 10 10 -
CuSO
4
5H
2
O 0.025 - 0.025 0.025 0.03 0.2 0.025 0.025 -
H
2
SO
4
- - - 0.5 - - - - -
Fe
2
(SO
4
)
3
- 2.5 - - - - - - -
NiC1
2
6H
2
O - - - - 0.03 - - - -
CoC1
2
6H
2
O 0.025 - 0.025 - - 0.1 0.025 - -
A1C1
3
- - - - 0.03 - - - -
FeC1
3
6H
2
O - - - - 1 - - - -
FeC
6
O
5
H
7
5H
2
O
- - - 10 - - - - -
K1 0.83 0.75 0.75 0.5 0.01 1.0 - - -
H
3
BO
3
6.2 1.5 3 0.5 1 5 10 10 -
Na
2
M
0
O
4
2H
2
O
0.25 - 0.25 0.25 - 0.1 0.25 0.25 -
Sucrose
Glucose
30,000
-
20,00
0
-
20,000
-
50,000
or
36,000
20,000
-
30,000
-
20,000~30
,000
-
10,000
-
-
-
Myo-
Inositol
100 - 100 - - 1,000 100 100 -
Nicotinic
Acid
0.5 0.5 1.0 - - 0.5 5 5 -
Pyridoxine
HC1
0.5 0.1 1.0 - - 0.5 0.5 0.5 -
Thiamine
HC1
0.1-1 0.1 10 1 1 5 0.5 0.5 -
Ca-
Pantothena
te
- 1 - - - - - - -
Biotin - - - - - - 0.05 0.05 -
Glycine 2 3 - - - - 2 2 -
Cysteine
HC1
- 1 - 10 - - - - -
Folic Acid - - - - - - 0.5 0.5 -
Glutamine - - - - - - - 14.7 -
The significant feature of the MS medium is its very high
concentration of nitrate, potassium and ammonia.
The B5 medium established by Gamborg et al. (29) is also
being used by many researchers. The levels of inorganic
nutrients in the B5 medium are lower than in MS medium.
Many other media have been developed and modified and
nutrient compositions of some typical media will be
described in Table.
However, it is not always necessary to test many kinds of
basal media when a callus is induced. It would be better to
use only one or two kinds of basal media in combination of
different kinds and concentrations of phytohormones. The
most suitable medium composition should be optimized
afterwards in order to obtain higher level of products as
well as higher growth rate.
Effects of Different Media on Growth and
Serpentine Production in
Cell Suspension Cultures of Catharanthus roseus
Basal
Medium *
Cell yield
g dwt/1
Serpentine
mg/1
Serpentine Content
% dwt
Blaydes
Gamborg - B5; + 2,4-D: 1
mg/1
Gamborg + 2,4 D: 2 mg/1
Gamborg + NAA : 1.86
mg/1
Gamborg
Heller + IAA:O.175; BA:
1.13 mg/1
Linsmaier and Skoog
Murashige and Skoog
Nitsch and Nitsch
Velicky and Martin
White
7.6
4.6
5.2
7.6
5.1
5.4
9.3
8.9
2.3
5.0
0.8
4.4
0.5
0
1.2
0
6.6
0
10.4
2.0
0
0
0.06
0.01
0
0.02
0
0.12
0
0.12
0.09
0
0
* IAA = Indole-3-acetic acid
NAA = 1-Naphthalene acetic acid
2,4-D = 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid
Kin = Kinetin
BA = Benzyladenine
Media harus menyediakan nutrien yang dibutuhkan untuk:
pertumbuhan sel dan
biosintesis produk.
Pengembangan medium awal harus diawali dengan
menjawab:
1. Apa efek dari perbedaan konsentrasi setiap komponen
medium?
2. Apakah ada nutrien pembatas?
3. Apa efek penggantian setiap komponen dengan sumber
nutrien alternatif?
4. Adakah kombinasi sumber nutrien mayor alternatif yang
mendukung produksi hasil yang tinggi?
Jika belum ada pengetahuan tentang hal tersebut, harus:
penelitian pendahuluan, untuk memanipulasi tipe & level
sumber C dan N yang meningkatkan jumlah produk.
Karena senyawa ini sangat banyak, maka dibuat kelompok senyawa,
gula-gula C-6, C-5, C-4; mono-, di-, & polosakarida; minyak & lemak; asam organic.
Produk yest, pepton, ekstrak daging, biji-bijian & tepung, bahan anorganik, dst.
Harus dipilih berdasarkan ketersediaan, biaya, dan efek-efek yang mungkin timbul pada jalannya proses.

Rancangan penelitian:
1. Satu factor pada satu waktu
Tradisional
Tidak dapat mengidentifikasi factor yang penting
Tidak ada interaksi tiap factor
2. Faktorial penuh
Data komprehensif tentang efek & interaksi setiap faktor
Makan waktu & biaya, misal untuk meneliti 4 faktor membutuhkan 256 treatmen
Tidak dapat ditentukan mana factor yang efeknya kecil atau tidak berefek terhadap produk
3. Faktorial sebagian
Oleh Plackett & Burmann
Setiap komponen media diuji dengan dua level yang berbeda; missal medium kontrol (yang sudah ada)
mengandung glukosa 2%, maka diujikan glukosa 1% dan 4%. Dengan metodestandar-orde maka
medium yang komponennya tujuh setidaknya harus dilakukan 8 kali treatmen.
4. Array testing
Meneliti pasangan factor, masing-masing pada tiga level yang berbeda (biasanya level kontrol, 2 x
kontrol, dan 0,5 x kontrol). Misal pasangan factor:
level sumber C vs level sumber N
tipe sumber N vs level sumber C

Preparation of Media
For example, MS medium is prepared as follows:
a. MS-Micronutrient stock solution (store in freezer)
Ingredient mg/100 ml
H3BO3 620
MnSO4 4H2O 2230
ZnSO4 7H2O 860
Na2MoO4 2H2O 25
CuSO4 5H2O 2.5
CoCl2 6H2O 2.5
b. Vitamins (store in freezer)
Vitamins mg/100 ml
Nicotinic acid 100
Thiamine HCl 1,000
Pyridoxine HCl 100
Myo-Inositol 10,000
c. Calcium chloride
CaCl2 2H2O 15 g/100 ml
d. Potassium iodide (store in amber bottle in refrigerator)
KI 75 mg/100 ml
e. 2,4-D (2.2 mM)
Dissolve 50 mg 2,4-D in 2 to 5 ml ethanol, heat slightly and gradually dilute to 100 ml with water.
(Store in refrigerator).
f. NAA (2.8 mM)
Prepare the same as 2,4-D above.
g. Kinetin (1 mM)
Dissolve 21.5 mg of kinetin in a small volume of 0.5 N HCl by heating slightly and gradually diluting to
100 ml with distilled water. (Store in refrigerator) Similar procedures can be used for other cytokinins.
A certain volume of each stock solution is mixed and
an appropriate carbon source is added to the mixture.
After pH is adjusted to around 5.5 with 0.2 N K0H or
0.2 N HCl, distilled or deionized water is added to the
mixture up to the certain volume required. Agar (0.6
to 1.0% wt/vol) is added for a solid medium.
The medium thus prepared is distributed into vessels
such as Erlenmyer flasks (for example, 50 ml of the
medium in a 300 ml volume Erlenmyer flask) and
sterilized by using an autoclave at 120 C for 15
minutes. The sterilization conditions should be varied
based on the volume of the medium and the size of
the vessel.