Anda di halaman 1dari 12

MACAM-MACAM MEDIA KULTUR JARINGAN

Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.


Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan
secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat
besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang
dihasilkannya. Oleh karena itu, macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan
sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya
sesuai dengan nama penemunya. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen
bahan kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap
persenyawaan.
Media yang digunakan biasanya berupa garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu
diperlukan juga bahan tambahan seperti agar-agar, gula, arang aktif, bahan organik dan lain-
lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenis maupun jumlahnya.
Medium yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Medium
yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf agar
tidak terjadi kontaminasi dari bakteri maupun cendawan. Komposisi media yang digunakan
dalam kultur jaringan dapat berbeda jenis dan konsentrasinya. Perbedaan komposisi media
dapat mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan
secara invitro.
Formulasi media kultur jaringan pertama kali dibuat berdasarkan komposisi larutan yang
digunakan untuk hidroponik, khususnya komposisi unsur-unsur makronya. Unsur-unsur hara
diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik. Koposisis media dan perkembangan
formulasinya didasarkan pada jenis jaringan, organ dan tanaman yang digunakan serta
pendekatan dari masing-masing peneliti. Beberapa jenis sensitif terhadap konsentrasi
senyawa makro tinggi atau membutuhkan zat pengatur tertentu untuk pertumbuhannya. Pada
periode tahun 1930an, formulasi media terutama ditujukan untuk menumbuhkan akar, tuber
dan kambium. Media untuk penumbuhan akar yang dikembangkan oleh White 1934, pertama
White menggunakan media yang berisi garam anorganik, yeast ekstrak dan sucrose, tetapi
kemudian yeast ekstrak digantikan dengan 3 macam vitamin B, yaitu pyridoxine, thiamine
dan nicotinic acid.

Media Kultur Jaringan

Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan
secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat
besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang
dihasilkannya. Oleh karena itu, macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan
sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya
sesuai dengan nama penemunya.
Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir
sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan. Media dasar
yang sering digunakan dalam kultur jaringan Anthurium sendiri adalah media MS dan
modifikasinya ( Pierik et al.,1974; Pierik dan Steegmans, 1976;Kunisaki, 1980; Kuenhle et
al., 1992; Chen et al; Hamidah et al., 1997; Teng, 1997;2 ; Rachmawati, 2005), media Nitsch
dan modifikasinya (Geir, 1986, 1987, 1988).

A. Komposisi Media Tanam Kultur Jaringan
Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari hormon
(zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam tanah yang
dikelompokkan ke dalam unsur makro, unsur mikro. Hasil yang lebih baik akan dapat kita
peroleh bila, kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan hormon, bahan
pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula maupun sukrosa, air destilata (akuades),
dan bahan organik tambahan (Gunawan, 1992).
Zat pengatur tumbuh adalah persenyawaan organik selain dari nutrient yang dalam
jumlah yang sedikit (1mM) dapat merangsang, menghambat, atau mengubah pola
pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Moore, 1979 dalam Gunawan, 1992). Zat
pengatur tumbuh (ZPT) dalam kultur jaringan diperlukan untuk mengendalikan dan mengatur
pertumbuhan kultur tanaman. Zat ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam
kultur sel, jaringan, dan organ. Jenis dan konsentrasi ZPT tergantung pada tujuan dan tahap
pengkulturan. Secara umum, zat pengatur tumbuh yang digunakan dalam kultur jaringan ada
tiga kelompok besar, yaitu auksin, sitokinin, dan giberelin.
Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk merangsang pertumbuhan
kalus, akar, suspensi sel dan organ (Gunawan, 1992) Contoh hormon kelompok auksin adalah
2,4 Dikloro Fenoksiasetat (2,4-D), Indol Acetid Acid (IAA), Naftalen Acetid Acid (NAA),
atau Indol Buterik Asetat (IBA). Golongan sitokinin berperan untuk menstimulus
pembelahan sel dan merangsang pertumbuhan tunas pucuk. Menurut Gunawan (1992),
golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin
yang biasa digunakan dalam kultur jaringan adalah kinetin, ziatin, benzilaminopurine (BAP).
Dan giberelin untuk diferensiasi atau perbanyakan fungsi sel, terutama pembentukan kalus.
Hormon kelompok giberelin adalah GA3, GA2, dan GA1.
Penggunaan hormon tersebut harus tepat dalam perhitungan dosis pemakaian, karena
jika terlalu banyak maupun terlalu sedikit dari dosis yang diperlukan justru akan menghambat
bahkan berdampak negatif terhadap tanaman kultur. Karena interaksi antar hormon dalam
suatu media sangat berpengaruh dalam diferensiasi sel.
Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman yang dikulturkan secara in-vitro pada
dasarnya sama dengan kebutuhan hara tanaman yang ditumbuhakan di tanah. Unsur-unsur
hara yang dibutuhkan tanaman di lapangan merupakan kebutuhan pokok yang harus tersedia
dalam media kultur jaringan. Antara lain adalah unsur hara makro dan unsur hara mikro.
Unsur-unsur hara tersebut diberikan dalam bentuk garam-garam mineral. Komposisi media
dan perkembangannya didasarkan pada pendekatan masing-masing peneliti (Gunawan,
1992).

1. Unsur Hara Makro
adalah hara yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah yang banyak. Hara makro
tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium (Ca), Sulfur (S),
Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Kegunaan unsur hara makro tersebut dalam kultur jaringan
menurut Qosim, 2006 dalam Sukarasa, 2007 adalah sebagai berikut:
1) Nitrogen (N)
Diberikan dalam bentuk NH4NO3, NH2PO4,NH2SO4.Berfungsi untuk membentuk
protein, lemak, dan berbagai senyawa organik lain, morfogenesis (pertumbuhan akar dan
tunas), pertumbuhan dan pembentukan embrio, pembentukan embrio zigotik dan
pertumbuhan vegetatif.
2) Fosfor (P)
diberikan dalam bentuk KH2PO4.Berfungsi untuk metabolisme energi, sebagai
stabilitor membran sel, pengaturan metabolisme tanaman, pengaturan produksi pati/amilum,
pembentukan karbohidrat, sangat penting dalam transfer energi, protein, dan sintesis asam
amino serta konstribusi terhadap struktur dan asam nukleat.
3 Kalium (K)
diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O.Berfungsi untuk pemanjangan sel tanaman,
memperkuat tubuh tanaman, memperlancar metabolisme dan penyerapan makanan, ion
kalsium ditransfer secara cepat menyebrangi membran sel dan mengatur pH dan tekanan
osmotik di antara se
4) Kalsium (Ca)
diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O.Berfungsi untuk merangsang bulu-bulu akar,
penggandaan atau perbanyakan sel dan akar, pembentukan tabung polen, dinding dan
membran sel lebih kuat, tahan terhadap serangan patogen, mengeraskan batang,
memproduksi cadangan makanan.
5) Sulfur (S)
Unsur S merupakan unsur yang penting untuk pembentukan beberapa jenis protein,
seperti asam amino dan vitamin B1. Unsur S juga berperan penting dalam pembentukan bitil-
bintil akar.
6) Magnesium (Mg)
diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2O.Berfungsi untuk meningkatkan kandungan
fosfat, pembentukan protein.
7) Besi (Fe)
diberikan dalam bentuk Fe2(SO4)3;FeSO4.7H2O.Berfungsi sebagai penyangga
(chelatin agent) yang sangat penting untuk menyangga kestabilan pH media selama
digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.Pada tanaman, Fe berfungsi untuk
pernapasan dan pembentukan hijau daun.

2. Unsur Hara Mikro
Adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Unsur hara mikro ini
merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses metabolisme dan proses
fisioligi lainnya (Gunawan, 1992). Unsur hara mikro tersebut diantaranya adalah :
a. Klor (Cl), diberikan dalam bentu KI.
b. Mangan (Mn), diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O.
c. Tembaga (Cu), diberikan dalam bentuk CuSO4.5H2O.
d. Kobal (CO), diberikan dalam bentuk CoCl2.6H2O.
e. Molibdenun (Mo), diberikan dalam bentuk NaMoO4.2H2O.
f. Seng (Zn), diberikan dalam bentuk ZnSO4.4H2O.
g. Boron (B), diberikan dalam bentuk H3BO3.

3. Usur Tambahan Lainya
Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman adalah
thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan
vitamin yang esensial dalam kultur jaringan tanaman karena thiamine mempengaruhi
pertumbuhan dan perkembangan sel. Vitamin C, seperti asam sitrat dan asam askorbat,
kadang-kadang digunakan sebagai antioksidan untuk mencegah atau mengurangi pencoklatan
atau penghitaman eksplan.
Mio-Inositol atau meso-insitol sering digunakan sebagai salah satu komponen media
yang penting, karena terbukti bersinergis dengan zat pengaturtumbuh merangsang
pertumbuhan jaringan yang dikulturkan (Yusnita, 2004).
Dalam media kultur jaringan, asam amino merupakan sumber nitrogen organik.
Namun sumber N organik ini jarang ditambahkan dalam media kultur jaringan, karena
sumber sumber nitrogen utamanya sudah tersedia dari NO3- dan NH4+. Asam amino yang
sering digunakan adalah glisin, lysin dan threonine. Penambahan glisin dalam media dengan
konsentrasi tertentu dapat melengkapi vitamin sebagai sumber bahan organik (Yusnita,
2004).
Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya bagian
tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju fotosintesis yang
rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan karbohidart yang cukup
sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan (1992), sukrosa adalah sumber
karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa. Namun jika
tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula
pasir cukup memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber
energi, gula juga berfungsi sebagai tekanan osmotik media.
Eksplan yang dikulturkan harus selalu bersinggungan atau terkena dengan medianya.
Bahan pemadat media yang paling banyak digunakan adalah agar-agar. Agar-agar adalah
campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam analisa unsur,
diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na (Debergh,
1982 dalam Gunawan, 1992). Keuntungan dari pemakaian agar-agar adalah :
1. Agar-agar membeku pada suhu 45 C dan mencair pada suhu 100 sehingga dalam
kisaran suhu kultur, agar-agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil.
2. Tidak dicerna oleh enzim tanaman.
3. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaa penyusun media.
Selain agar-agar, bahan pemadat media yang semakin banyak disukai adalah Gelrite
TM (buatan Kelco). Gelrite adalah gellam gum, suatu hetero-polisakarida yang dihasilkan
bakteri Pseudomonas elodea, terdiri dari molekul-molekul K-glukuronat, rhamnosa, dan
selobiosa. Sebagai bahan pemadat media gelrite memiliki sifat-sifat yang menguntungkan
sebagai berikut :
1) Gelnya lebih jernih.
2) Untuk memadatkan media dibutuhkan lebih sedikit daripada agar, sekitar 1,5 -3g/l
3) Lebih murni dan konsisten dalam kualitas.
Untuk mencapai kekerasan gel tertentu, pemakaian gelrite lebih rendah dari agar-agar,
pada umumnya 2gr/l media. Namun kekerasan gel dari gelrite sangat dipengaruhi oleh
kehadiran garam-garam seperti NaCl, KCl, MgCl2.6H2O dan CaCl2. Garam NaCl dan KCl
menurunkan kekerasan gel, tetapi MgCl2 dan CaCl2 meningkatkan kekerasan gel (Gunawan,
1992; 57 ).
Salah satu kelemahan Gelrite adalah cenderung menaikkan kelembaban nisbi (RH)
dalam kultur, sehingga sering menyebabkan terjadinya verifikasi. Gelrite jarang digunakan
untuk produksi planlet secara komersial terutama di Indonesia karena harganya mahal
(Yusnita, 2003).
Kultur yang kurang berhasil, kadang-kadang disebabkan oleh pemakaian air yang
kurang murni (Wetherel, 1976). Tidak boleh sembarang air dapat digunakan untuk membuat
media kultur. Contohnya air sumur atau air ledeng, dalam air tersebut mengandung banyak
kontaminan, bahan inorganik, organik, atau mikroorganisme. Air yang digunakan untuk
membuat media harus benar-benar berkualitas tinggi, karena air maliputi lebih adari 95%
komponen media. Terhambatnya pertumbuhan tanaman yang dikulturkan dapat disebabkan
oleh rendahnya kualitas air yang digunakan. Untuk menghindari hal tersebut, maka sebaiknya
digunakan air yang telah dimurnikan atau yang sering kita sebut air destilata (akuades) atau
air destilata ganda (akuabides). Dengan alasan ini, sebaiknya sebuah laboratorium kultur
jaringan layaknya mempunyai alat penyulingan air (water destilator) atau setidaknya alat
pembuat air bebas ion (deionizer). Cara kerja destilator dalam menghasilkan air destilata
adalah dengan cara mengubah air menjadi uap air, kemudian mengkondensasikan uap air
tersebut. Maka, jadilah air destilata yang tidak lagi berisi mineral atau senyawa organik
(Yusnita, 2004).
Keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan derajat keasaman atau kebasaan larutan
dalam air. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai
toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0 6,0 (Daisy, 1994).
Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus. pH tesebut harus diatur
sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma.
Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan beberapa fisiologi sel, juga harus
mempertimbangkan faktor-faktor:
1) Kelarutan dari garam-garam penyusun media.
2) Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam garam lain.
3) Efisiensi pembekuan agar-agar.
Menurut Gamborg dan Shyluk, 1981 dalam Gunawan, 1992, sel-sel tanaman
membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,55,8. Pengaturan pH, biasa dilakukan
dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL pada waktu
semua komponen sudah dicampurkan (Gunawan, 1992).
Beberapa formulasi media yang sudah umum digunakan dalam banyak pekerjaan kultur
jaringan antara lain adalah media White, Murashige & Skoog (MS), Gamborg et al. (B5),
Gautheret, Schenk & Hilderbrandt (SH), Nitch & Nitch, Lloyd & McCown (WPM) dll.
Media MS, SH dan B5 merupakan media yang kaya garam-garam makro.

Berikut penjelasan dari masing-masing komposisi media tersebut :
1. Hara Makro
Unsur hara makro. terdiri dari enam unsur utama yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan sel dan jaringan tanaman, yaitu: nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), kalsium
(Ca), magnesium (Mg) dan sulfur (S). Konsentrasi optimum yang dibutuhkan untuk
mencapai pertumbuhan maksimum bervariasi diantara jenis tanaman.
Media kultur harus mengandung sedikitnya 25-60 mM nitrogen anorganik untuk
pertumbuhan sel tanaman. Sel-sel tanaman mungkin dapat tumbuh pada sumber N dari nitrat
saja, tetapi diketahui bahwa pertumbuhan yang lebih baik adalah apabila mengandung nitrat
dan amonium. Nitrat yang disediakan umumnya berkisar 25-40 mM, konsentrasi amonium
berkisar antara 2-20 mM. Akan tetapi untuk beberapa spesies tanaman konsentrasi amonium
> 8 mM akan menghambat pertumbuhan sel. Sel-sel dapat tumbuh dalam media kultur yang
hanya mengandung amonium sebagai sumber nitrogen jika satu atau lebih terdapat asam-
asam yang terlibat dalam siklus TCA (seperti sitrat, suksinat, atau malat) juga terdapat dalam
media pada konsentrasi sekitar 10 mM. Apabila nitrat dan amonium sebagai sumber nitrogen
digunakan bersama dalam media maka ion-ion amonium akan digunakan lebih cepat
dibandingkan dengan ion-ion nitrat. Kalium dibutuhkan untuk pertumbuhan sel bagi sebagian
besar spesies tanaman.
Umumnya media mengandung kalium (dalam bentuk nitrat atau klorida) pada
konsentrasi 20-30 mM. Konsentrasi optimum untuk unsur P, Mg, S dan Ca berkisar antara 1-
3 mM. Konsentasi yang lebih tinggi dari hara-hara tersebut mungkin diperlukan jika terjadi
defisiensi dari hara yang lain.

2. Hara Mikro
Unsur hara mikro yang paling dibutuhkan untuk petumbuhan sel dan jaringan
tanaman mencakup besi (Fe), mangan (Mn), seng (Zn), boron (B), terusi (Cu) dan
molibdenum (Mo). Besi dan seng yang digunakan dalam pembuatan media harus dalam
bentuk yang ter chelate. Besi adalah yang paling kritis diantara semua hara mikro. Besi
sitrat dan tartrat dapat digunakan untuk media kultur, tetapi senyawa ini sulit untuk larutdan
biasanya akan terpresipitasi setelah media dibuat. Masalah ini dipecahkan oleh Murashige &
Skoog dengan men chelate besi dengan menggunakan asam etilen diamintetraasetik
(EDTA).
Kobal (Co) dan iodin (I) juga dapat ditambahkan dalam media tetapi kebutuhan yang
jelas untuk pertumbuhan sel belum diketahui. Natrium (Na) dan klorida (Cl) juga digunakan
pada beberapa media tetapi tidak begitu penting untuk pertumbuhan sel. Konsentrasi Cu dan
Co yang biasanya ditambahkan pada media sekitar 0.1 M, Fe dan Mo 1 M, I 5M, Zn 5-30
M, Mn 20-90 M, dan B 25-100 M.

3. Karbon dan Sumber Energi
Sumber karbohidrat yang biasanya digunakan dalam media kultur adalah sukrosa.
Glukosa dan fruktosa dalam beberapa hal dapat digunakan sebagai pengganti sukrosa, dimana
glukosa mempunyai efektivitas yang sama dengan sukrosa dibanding dengan fruktosa.
Karbohidrat lain yang pernah dicobakan adalah laktosa, galaktosa, rafinosa, maltosa dan pati,
tetapi semua karbohidrat tersebut umumnya mempunyai hasil yang kurang baik dibandingkan
sukrosa atau fruktosa. Konsentrasi sukrosa normal dalam media kultur berkisar antara 2 dan
3%.
Karbohidrat harus tersedia dalam media kultur karena sangat sedikit sel dari jenis
tanaman yang diisolasi dapat bersifat autotropik, yaitu kemampuan menyediakan kebutuhan
karbohidrat sendiri melalui asimilasi CO2 selama proses fotosintesa. Sukrosa dalam media
kultur secara cepat akan diurai menjadi fruktosa dan glukosa. Glukosa adalah yang pertama
digunakan oleh sel, diikuti oleh fruktosa. Saat media disterilisasi dengan autoclave, sebagian
sukrosa akan mengalami hidrolisa. Apabila sukrosa yang diautoklap ada bersama komponen
media lain maka proses hidrolisa akan lebih besar. Kultur dari beberapa spesies tanaman akan
tumbuh baik pada media yang sukrosanya diautoklap dibandingkan dengan media yang
sukrosanya disterilisasi dengan filter. Hal ini dimungkinkan akan menguntungkan sel-sel
karena tersedianya glukosa dan fruktosa.

4. Vitamin
Pada beberapa media kultur juga sering ditambahkan vitamin-vitamin seperti biotin,
asam folat, asam askorbat, asam panthotenat, vitamin E (tokoperol), riboflavin, dan asam p-
aminobenzoik. Meskipun vitamin-vitamin tersebut bukan merupakan faktor pembatas
pertumbuhan, tetapi sering memberikan keberhasilan dalam kultur sel dan jaringan tanaman.
Biasanya penambahan vitamin-vitamin tersebut ke dalam media dilakukan apabila
konsentrasi thiamin dianggap dibawah taraf yang diinginkan atau apabila jumlah populasi
sel-sel yang tumbuh masih rendah.


5. Asam Amino dan Sumber Nitrogen Lainnya
Sumber nitrogen organik yang paling banyak digunakan dalam media kultur adalah
asam amino campuran (casein hidrolisat), L-glutamin, L-asparagin, dan adenin. Casein
hidrolisat umumnya digunakan pada konsentrasi antara 0.05-0.1%. Asam amino biasanya
ditambahkan pada media terdiri dari beberapa macam, karena sering diperoleh bahwa
penambahan satu jenis asam amino saja justru dapat menghambat pertumbuhan sel. Contoh
penambahan asam amino dalam media untuk meningkatkan pertumbuhan sel adalah glisin 2
mg/L, glutamin hingga 8mM, asparagin 100 mg/L, arginin dan sistein 10 mg/L, dan tirosin
100 mg/L. Adenin sulfat juga sering ditambahkan pada media kultur yang fungsinya dapat
menstimulir pertumbuhan sel dan meningkatkan pembentukan tunas.

6. Bahan Organik Komplek
Arang aktif (activated charcoal) juga sering digunakan pada media kultur. Beberapa
hasil penelitian menunjukkan pengaruh yang menguntungkan dan juiga dapat merugikan.
Pada kultur beberapa tanaman seperti anggrek, bawang, wortel dan tomat dapat menstimulir
pertumbuhan dan diferensiasi, tetapi pada kultur tanaman tembakau, kedelai dan teh justru
akan menghambat pertumbuhan. Pengaruh arang aktif umumnya diarahkan pada salah satu
dari tiga hal berikut: penyerapan senyawa-senyawa penghambat, penyerapan zat pengatur
tumbuh atau menggelapkan warna media. Penghambatan pumbuhan karena kehadiran arang
aktif umumnya karena arang aktif dapat menyerap ZPT. NAA, kinetin, BAP, IAA dan 2iP
semuanya dapat terikat oleh artang aktif.
IAA dan 2iP merupakan ZPT yang paling cepat terikat oleh arang aktif. Arang aktif
dapat menstimulasi pertumbuhan sel umumnya karena kemampuan arang aktif mengikat
senyawa fenol yang bersifat toksik yang diproduksi biakan selama dalam kultur.
Konswentrasi aArang aktif yang ditambahkan kedalam media kultur umumnya sebanyak 0.5-
3%.

7. Bahan Pemadat dan Penyangga Biakan
Media kultur jaringan tanaman dapat dibuat padat atau semi padat, yaitu dengan
penambahan bahan pemadat berupa agar. Dibandingkan bahan pemadat lain, agar
mempunyai beberapa keuntungan, yaitu (i) saat dicampur dengan air, agar akan terbentuk bila
dilelehkan pada suhu 60
o
-100
o
C dan memadat pada suhu 45
o
C; (ii) gel agar bersifat stabil
pada suhu inkubasi; (iii) agar gel tidak bereaksi dengan komponen dalam media dan tidak
dicerna oleh ensim tanaman. Kualitas fisik agar dalam media kultur tergantung pada
konsentrasi dan merek agar yang diguinakan serta pH media. Konsentrasi agar yang
digunakan dalam media kultur berkisar antara 0.5-1%, dengan catatan pH media sesuai
dengan aturan. Penggunaan arang aktif (0.8-1%) dapat mempengaruhi kepadatan agaryang
terbentuk.
Kemurnian agar yang digunakan dalam media kultur juga merupakan faktor yang
penting. Agar yang mengandung garam-garam Ca, Mg, K dan Na dapat mempengaruhi
ketersediaan hara dalam media. Oleh karena itu penggunaan agar yang murni sangat
diperlukan terutama untuk tujuan percobaan. Untuk memurnikan agar dapat dilakukan
dengan cara mencuci dengan air destilasi selama 24 jam kemudian dibilas dengan ethanol dan
dikeringkan pada suhu 60
o
C selama 24 jam.
Bahan pemadat lain yang pernah dicobakan adalah gelatin pada konsentrasi 10%, akan tetapi
terdapat kesulitan karen gelatin meleleh pada suhu 25
o
C. Methosel dan alginat juga pernah
dicobakan sebagai bahan pemadat media, tetapi kedua bahan tersebut sulit penanganannya
serta harganya cukup mahal. Bahan lain yang dapat digunakan adalah agarose (konsentrasi
0.35-0.7%), dimana jenis agar ini banyak digunakan pada pekerjaan teknik kultur protoplas.
Saat ini bahan pemadat yang banyak digunakan adalah agar sintetik yaitu Phytagel (produk
Sigma Chemical) dan Gelrite (produk Kelco Corp.). Agar jenis ini hanya digunakan 2-2.5 g/L
dan menghasilkan gel yang bening yang cocok untuk mendeteksi ada tidaknya kontaminan.
Gel agar juga berfungsi sebagai penopang agar biakan atau eksplan yang ditanam
dalam media tetap pada tempatnya (tidak bergerak atau berpindah). Metoda lain yang dapat
digunakan untuk penopang atau penyangga biakan adalah jembatan kerta filter (filter paper
bridges), sumbu kertas filter (filter paper wick), busa poliuretran, celophane berlubang dan
poliester. Apakah eksplan akan tumbuih lebih baik pada media agar atau dengan penyangga,
tergantung dari spesies tanaman yang dikulturkan.

8. Zat Pengatur Tumbuh
Terdapat empat klas zat pengatur tumbuh (ZPT) yang penting dalam kultur
jaringan tanaman, yaitu: auksin, sitokinin, giberelin dan asam absisik. Skoog dan Miller
adalah yang pertama melaporkan bahwa perbandingan auksin dan sitokinin menentukan jenis
dan berapa besar proses organogenesis dalam kultur jaringan
tanaman. Auksin dan sitokinin yang ditambahkan kedalam media kultur mempunyai tujuan
untuk mendapatkan morfogenesis, meskipun perbandingannya untuk mendapatkan induksi
akar dan tunas bervariasi baik ditingkat genus, spesies bahkan kultivar.
Sitokinin yang ditrambahkan dalam media kultur umumnya ditujukan untuk
menstimulasi pembelahan sel, menginduksi pembentukan tunas dan proliferasi tunas aksiler,
dan untuk menghambat pembentukan akar. Mekanisme kerja sitokinin tidak secara pasti
diketahui, namun demikian beberapa senyawa yang mempunyai aktivitas
mirip sitokinin diketahui terlibat dalam transfer-RNA (t-RNA).Sitokinin juga menunjukkan
dapat mengaktivasi sintesa RNA dan menstimulasi aktivitas protein danenzim pada jaringan
tertentu.

B. Nama- Nama Media Dasar Kultur Jaringan
Menurut George dan Sherington (1984) ada media dasar yang pada umumnya diberi
nama sesuai dengan nama penemunya, antara lain:
1) Medium dasar Murashige dan Skoog (MS), digunakan hamper pada semua macam
tanaman terutama herbaceous. Media ini memiliki konsentrasi garam-garam mineral
yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+.
2) Medium dasar B5 atau Gamborg, digunakan untuk kultur suspense sel kedelai, alfafa
dan legume lain.
3) Medium dasar white, digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium
dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah.
4) Medium Vacint Went (VW), digunakan khusus untuk medium anggrek.
5) Medium dasar Nitsch dan Nitsch, digunakn untuk kultur tepung sari (Pollen) dan
kultur sel.
6) Medium dasar schenk dan Hildebrandt, digunakan untuk tanaman yang berkayu.
7) Medium dasar Woody Plant Medium (WMP), digunakan untuk tanamn yang berkayu.
8) Medium dasar N6, digunakan untuk tanaman serealia terutama padi, dan lain-lain.

C. Perbandingan Komposisi Media Kultur Jaringan
Berikut ini adalah perbandingan komposisi beberapa media kultur jaringan, yaitu
diantaranya:
1. Media Murashige & Skoog (media MS)
Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur, merupakan
perbaikan komposisi media Skoog, Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat
untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur
jaringan jenis tanaman lain Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM
N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat
pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih
tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM.
Unsur makro lainnya konsemtrasinya dinaikkan sedikit. Pada tahun-tahun sesudah penemuan
media MS, dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain
media : 1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro
MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2
PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media
Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur
jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988)
serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.
Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan
1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan
NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya. 3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS
dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk
keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.

2. Media Schenk & Hildebrant (media SH)
Merupakan media yang juga cukup terkenal, untukkultur kalus tanaman monokotil
dan dikotil (Trigiano & Gray, 2000). Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat
mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+,
Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan
dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang
dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5%
buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman
tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.

3. Media WPM (Woody Plant Medium)
Dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan
konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman
berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari
sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias
berperawakan perdu dan pohon-pohon.

4. Media Nitsch & Nitsch
Menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan
jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM,
menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka mengambil kesimpulan, bahwa
NH4+ sangat menunjang pertumbuhan kalus tembakau (Miller et al, (1956 dalam Gunawan
1988).

5. Media Knop
Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya
ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur
akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan
IAA (Dodds and Roberts, 1983)

6. Media White
Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga
matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari
pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S, pada media untuk tumor
bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan
kemudian.
Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media
white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang.

7. Media Knudson dan media Vacin and Went
Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di
kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat.
S Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM
NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+
ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm

8. Media B5(Gamborg)
Dalam metode kultur in vitro dikenal beberapa macam jenis media dasar diantaranya
mediaMurashige dan Skoog (MS) dan Gamborg (B5). Media B5 dikembangkan
oleh Gamborg et al. pada tahun 1968 untuk kultur suspensi kedelai. Pertama kali
dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih
rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan
untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi
seluruh bagian tanaman. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain.
Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, menggunakan konsentrasi NH4+
yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel
kedelai. Tetapi peneliti lain melaporkan bahwa konsentrasi NH4+ yang tinggi sampai 20 mM
berpengaruh baik dalam kultur jaringan seperti pada kultur kalus tembakau Konsentrasi fosfat
yang diberikan pada media tersebut adalah 1mM , Ca+ antara 1-4 mM, dan Mg antara 0,5-4
mM lebih mengutamakan kandungan ammonium dibandingkan media MS.
Meskipun media B5 pada awalnya digunakan untuk menginduksi kalus atau
diutamakan sebagai kultur suspensi, tetapi dapat digunakan pula sebagai media dasar bagi
perbanyakan tanaman pada umumnya. Gamborg (1991) menyatakan bahwa kadar hara
anorganik yang dikandung media dasar Gamborg (B5) umumnya lebih rendah dari pada
media dasar MS. Hal tersebut sering kali lebih baik bagi sel spesies tertentu. Untuk
selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik
sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman

D. TEKNIK KULTUR JARINGAN
Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu:

Metode Padat (Solid Method)
Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan
medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat
tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen
kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat
pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-
agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur
jaringan.
Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit
untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan
kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam.
Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena tempat
area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium.
Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning, untuk
menumbuhkan protoplas setelah diisolasikan, untuk
menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk
menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan).
Metode Cair(Liquid Method)
Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat, karena
untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya
sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Oleh karena itu,
penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb
(prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila
dipindahkan kedalam media padat yang sesuai.
Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak
perlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat
pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein.

Beberapa faktor yang sangat berpengaruh terhadap keberhasilan kultur jaringan adalah
sebagai berikut :
1. Bahan tanaman yang digunakan.
Keberhasilan dalam kultur jaringan sangat ditentukan bahan yang digunakan untuk pertumbuhan
termasuk genotip, umur tanaman dan ukuran dari eksplan dan metode inokulasi yang digunakan.
Tanaman Dikotil umumnya mempunyai daya regenerasi lebih baik dibandingkan dengan tanaman
monokotil dan gymnospermae. Eksplan yang muda dan lunak umumnya lebih baik pertumbuhannya
dibadingkan dengan eksplan yang sudah tua. Sel tanaman yang berukuran kecil (sel atau meristem)
lebih sulit ditumbuhkan dibanding dengan sel pada daun, batang atau pada umbi-umbian.
Pada prinsipnya seluruh bagian tanaman dapat digunakan sebagai eksplan, namun demikian
pertimbangan utama adalah sel-sel yang masih muda, embrional dan memiliki meristematik yang
tinggi.
Berdasarkan eksplan yang digunakan, maka ada berbagai macam kultur :
1. kultur biji
2. kultur meristem
3. kultur embrio
4. kultur sel (kultur suspensi sel)
5. anther atau kultur polen
6. kultur protoplas
7. kultur endosperm (putih lembaga)
8. kultur tunas

2. Medium dan komponen nutrisi yang selektif.
Komposisi medium yang diberikan umumnya berbeda pada masing-masing species, jaringan dan
organ yang dikulturkan serta tujuan dari eksperimen. Selain itu komposisi hormon yang diberikan
sangat penting untuk pertumbuhan tanaman monocotyl maupun dicotyl. Namun demikian medium
awal yang sering digunakan untuk jenis Dicotyledoneae dalam kultur jaringan adalah medium MS
(Murashigie dan Skoog). Alasan digunakan medium ini, karena lebih banyak mengandung nitrat,
amonium dan potasium dibandingkan dengan medium lainnya, sedangkan untuk Monocotyledoneae
digunakan medium Schenk dan Hilderlrandt.