Anexo 1

Extrao de DNA com a combinao de vrios protocolos.

Extraction buffer (EB): 2% CTAB
100 mM Tris-HCl, pH 8.0
1,4 M NaCl
20 mM EDTA, pH 8.0
Outros reagentes: 10% SDS, RNase 10mg/mL, Chl:IAA (24:1), 7,5 M NH4OAc, isopronanol,
TE-2 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)
Ligar banho a 65 C


1. Num tubo de 2 m,L com 300 L de EB, macerar ~20 mg (silica dry leaf)
2. Adicionar + 300 L EB, agitar
3. Addicionar 50 L SDS 10%
4. Vortex 5-10
5. Adicionar 10 L RNase 10mg/mL
6. Colocar a 60-65 C 30 (agitar ocasional/)
7. Adicionar 0.48 mL Chl:IAA (24:1)
8. Vortex 5-10
9. Centrifugar 13000 rpm 1
10. Transferir fase aquosa para novo tubo (tubo 1.5 mL)
11. Centrifugar 13000 rpm 1
12. Sobrenadante + 0.3 vol NH4OAc 7.5 M (tubo 1.5 mL)
13. Colocar 10 a 20 C ou gelo 40
14. Centrifugar 13000 rpm 5
15. Sobrenadante + = vol. Isopropanol ice-cold (tubo 1.5 mL)
16. Agitar suavemente
17. Centrifugar 13000 rpm 5
18. Lavar pellet 1 mL 70%EtOH
19. Centrifugar 13000 rpm 2
20. Deixar secar ao ar e adicionar 50 L TE-2
21. Deixar a dissolver O/N a 4C