39

BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik. Subjek pada
kelompok kontrol dan kelompok perlakuan ditentukan secara random. Sebanyak 25
ekor mencit putih (Mus musculus) jantan dewasa berumur 2-3 bulan yang dipilih
secara random yang dibagi menjadi 5 kelompok, dengan pengulangan sebanyak 5
kali, akan digunakan sebagai subjek penelitian.

3.2. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan di Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner
(BPPV) Bandar Lampung sedangkan pembuatan preparat dan pengamatannya akan
dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. H. Abdoel Moeloek.
Waktu penelitian akan dilakukan pada bulan Januari 2013 sampai Februari 2013
selama 28 hari.

3.3. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan rancangan Post
Test Only Controlled Group Design, yaitu jenis penelitian yang melakukan
pengamatan terhadap kelompok kontrol dan perlakuan setelah diberi suatu
tindakan. Dalam rancangan ini subjek dibagi menjadi 5 kelompok secara random.
Perlakuan pemberian etanol saja diberikan kepada satu kelompok, 3 kelompok
40




lain diberi perlakuan pemberian ekstrak buah delima dengan dosis yang berbeda
dengan diinduksi etanol, dan perlakuan lain sebagai kontrol. Setelah waktu yang
ditentukan, semua kelompok diobservasi dan dilakukan pengukuran terhadap efek
yang diteliti.

K ( - )
K ( + )
P 1
P 2
P 3
Gambar 3.1 : Rancangan penelitian
Keterangan:
K(-) adalah Kelompok kontrol negatif: mencit tanpa diberi perlakuan pemberian
etanol dan tanpa pemberian ekstrak buah delima merah
K(+) adalah kelompok kontrol positif: mencit dengan perlakuan pemberian etanol
50 % 0,014 ml/grBB/hari dan tanpa pemberian ekstrak buah delima merah selama
14 hari.
P1 adalah kelompok perlakuan 1: mencit dengan perlakuan pemberian ekstrak
buah delima merah dosis I per oral 0,07 mg/grBB/hari lalu setelah 1,5 jam,
dilakukan pemberian etanol 50% 0,014 ml/grBB/hari selama 14 hari.
P2 adalah kelompok perlakuan 2: mencit dengan perlakuan pemberian ekstrak
buah delima merah dosis II per oral 0,21 mg/grBB/hari lalu setelah 1,5 jam,
dilakukan pemberian etanol 50% 0,014 ml/grBB/hari selama 14 hari
Sampel
mencit 25
ekor
41




P3 adalah kelompok perlakuan 3: mencit dengan perlakuan pemberian ekstrak
buah delima merah dosis III per oral 0,63 mg/grBB/hari lalu setelah 1,5 jam,
dilakukan pemberian etanol 50% 0,014 ml/grBB/hari selama 14 hari.
3.4. Subjek penelitian
1. Populasi
Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih (Mus
musculus Linn) jantan dewasa berumur 2-3 bulan dengan berat 20-25 gr
2. Sampel
Sampel penelitian yang digunakan sebanyak 25 ekor mencit putih (Mus
musculus Linn) jantan berusia 2-3 bulan dengan berat badan 20-25 gr yang
dipilih secara acak dan dibagi dalam 5 kelompok dengan pengulangan
sebanyak 5 kali, sesuai dengan rumus Federer
Menurut Federer, rumus penentuan sampel untuk uji eksperimental adalah :
(t-1)(n-1) 15
Dimana t merupakan jumlah kelompok percobaan dan n merupakan jumlah
pengulangan atau jumlah sampel tiap kelompok. Penelitian ini akan
menggunakan 5 kelompok perlakuan sehingga perhitungan sampel menjadi
:


42




(5-1)(n-1) 15
4(n-1) 15
4n 15 +4
n 4,75
5
Jadi sampel yang digunakan tiap kelompok percobaan sebanyak 5 ekor
dan jumlah kelompok yang akan digunakan adalah 5 kelompok sehingga
penelitian ini akan menggunakan 25 ekor mencit putih dari populasi yang
ada.
3. Cara pengambilan sampel
Sampel penelitian diambil secara acak (random) dari populasi dengan
kriteria sebagai berikut:
Kriteria inklusi :
a. Sehat (tidak tampak penampakan rambut kusam, rontok, dan aktif)
b. Memiliki berat badan sekitar 20-25 gram
c. Berjenis kelamin jantan
d. Berusia sekitar 2-3 bulan
Kriteria eksklusi :
a. Terdapat penurunan berat badan lebih dari 10% setelah masa
adaptasi di laboratorium
b. Mati selama masa pemberian perlakuan

43




3.5. Variabel Penelitian
1. Variabel Independen
Variabel independen adalah dosis pemberian ekstrak buah delima merah pada
mencit putih jantan yang diinduksi etanol
2. Variabel dependen
Variabel dependen adalah gambaran histopatologi kerusakan hepar mencit
putih jantan
3.6. Definisi Operasional
1. Antioksidan pada buah delima merah
Antioksidan adalah zat yang memiliki mekanisme protektif untuk mencegah
pembentukan ROS atau untuk mendetoksifikasi ROS agar tidak terjadi stres
oksidatif. Pada buah delima antioksidan yang terkandung diantaranya adalah
Antosionin, flavoniod, polifenol, tanin.
2. Kerusakan hepar
Kerusakan hepar adalah terjadi perubahan abnormal pada gambaran histologis
sel-sel hepar. Kerusakan yang diamati berupa kerusakan sel hepar dan
degenerasi lemak yang terjadi pada hepatosit. Kriteria penelitiannya adalah :
36
0 = tidak ada kerusakan sel hepar
1 = <10% sel hepar mengalami kerusakan
2 = 10%-25% sel hepar mengalami kerusakan
3 = 26%-50% sel hepar mengalami kerusakan
4 = >50%-100% sel hepar mengalami kerusakan
44




3. Etanol sebagai oksidan
Etanol (etil alkohol/C2H5OH) adalah alkohol primer yang berwujud cairan
jernih, tidak berwarna, mudah menguap, dan mudah terbakar, yang dibentuk dari
peragian karbohidrat oleh mikroba atau melalui sintesis dari etilen. Konsumsi
etanol terus menerus menyebabkan etanol sebagai oksidan atau perusak dalam
tubuh, karena etanol dalam tubuh menjadi radikal bebas dan menyebabkan
terjadinya reactive oxygen spesies (ROS) yang menimbulkan stres oksidatif.

3.7. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat penelitian
Alat penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah :
1) Timbangan Mettler Toledo untuk menimbang mencit
2) Spuit oral 1cc untuk mencekoki etanol 50 % dan ekstrak buah delima
pada mencit
3) Gunting minor set untuk membedah perut mencit
4) Kapas dan alkohol
5) Alat untuk pembuatan preparat histopatologi lambung yaitu mikrotom,
cover glass, dan object glass.
6) Miksroskop
7) Kandang mencit



45




2. Bahan Penelitian
Etanol 50%, ekstrak buah delima merah dengan dosis 0,07 ml/grBB, 0,21
ml/grBB, dan 0,63 ml/grBB, mencit putih jantan, pelet ayam sebagai pakan
mencit.
Bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan sediaan histopatologi lambung
mencit meliputi: larutan formalin 10% , alkohol 80%, alkohol 95%, alkohol
absolut, etanol, xylol, paraffin, aquadest, pewarna preparat Hematoksilin dan
Eosin.
3.8. Prosedur Penelitian
1. Pemeliharaan mencit percobaan
Mencit dipelihara dalam ruangan yang berventilasi cukup, dikandangkan secara
individual. Suhu ruangan berkisar 28 32
0
C. Makanan dan minuman diberikan
dalam bentuk pelet, setiap 2 kali seminggu dilakukan pembersihan kandang.
Selama penelitian dilakukan mencit tidak ada yang mati. Untuk mengantisipasi
bila ada yang mati maka tiap-tiap kelompok perlakuan jumlah sampel ditambah
kurang lebih 10%.
2. Persiapan mencit
Mencit diadaptasikan selama tujuh hari di Laboratorium.. Sesudah adaptasi,
keesokan harinya dilakukan penimbangan untuk menentukan dosis dan
dilakukan perlakuan.
3. Prodesur pemberian dosis etanol
Dosis etanol yang akan digunakan dalam penelitian ini berdasarkan penelitian
sebelumnya mengenai pemberian etanol pada tikus. Dosis etanol yang diberikan
46




pada tikus berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh ROC and S. Karger AG
(2002) yaitu 10 ml/KgBB. Faktor konversi tikus putih dengan berat 200 g ke
mencit dengan berat badan 20 g adalah 0,14.




Jadi, setiap mencit diberikan etanol 50% sebanyak 0,014 ml/grBB selama 14
hari 1,5 jam setelah pemberian ekstrak buah delima merah. Pemberian etanol
1,5 jam setelah pemberian ekstrak buah delima merah agar lambung mencit telah
kosong sehingga mempercepat absorbsi etanol.
4. Dosis ekstrak buah delima
Dosis ekstrak buah delima merah ditentukan berdasarkan hasil konversi dari
tikus putih ke mencit.
Dosis I ekstrak buah delima merah
Dosis yang digunakan pada tikus adalah 150 mg/KgBB, faktor konversi dari
tikus putih ke mencit adalah 0,14.




Dosis ekstrak etanol buah delima merah 0,21 merupakan dosis ekstrak buah
delima merah kedua. Dosis ekstrak buah delima merah pertama dan ketiga
Dosis untuk mencit = 2 ml x 0,14 / 20 g mencit
= 0,28 / 20 g mencit
= 0,014 ml/grBB

Dosis mencit = 30 mg x 0,14 /20 g mencit
= 4,2 mg / 20 g mencit
= 0,21 mg/grBB
47




ditentukan berdasarkan standar pengobatan herbal ASEAN, yaitu dosis paling
rendah adalah 1/3 kali dosis dan dosis paling tinggi adalah 3 kali dosis.
3

Untuk kelompok perlakuan I : 1/3 x 0,21 mg/grBB = 0,07 mg/grBB
Untuk kelompok perlakuan II : 0,21 mg/grBB
Untuk kelompok perlakuan III: 3 x 0,21 mg/grBB = 0,63 mg/grBB

5. Cara kerja
a. Mencit sebanyak 25 ekor, dikelompokkan dalam 5 kelompok. Kelompok
I sebagai kontrol normal (negatif), dimana hanya akan diberi air ad
libitum. Kelompok II sebagai kontrol patologis (positif), dimana akan
diberikan etanol 50% 0,014 ml/grBB. Kelompok III adalah kelompok
perlakuan dengan pemberian etanol 50% 0,014 ml/grBB ditambah
ekstrak buah delima dosis 0,07 mg /grBB, kelompok IV dengan dosis
ekstrak buah delima sebanyak 0,21 mg/grBB, dan kelompok V dengan
dosis ekstrak buah delima sebanyak 0,63 mg/grBB, dimana ekstrak buah
delima dan etanol 50% tersebut akan diberikan sebanyak 1 kali/hari.
Masing-masing diberikan secara per oral selama 14 hari. Selama satu
minggu setiap kelompok mencit diadaptasikan sebelum diberi perlakuan.
b. Mengukur berat badan mencit sebelum perlakuan
c. Mencekoki mencit dengan ekstrak buah delima merah dan etanol 50%
selama 14 hari.Mencit tetap diberi makan dan minum ad libitum
48




d. Setelah 14 hari, pemberian larutan ekstrak buah delima merah dan
pemberian etanol 50% diberhentikan.
e. Lima mencit jantan dari tiap kelompok perlakuan kemudian dinarkosis
dengan kloroform.
f. Lalu dilakukan laparotomi, diambil hepar mencit untuk dibuat sediaan
mikroskopis. Pembuatan sediaan mikroskopis dilakukan dengan metode
paraffin dan pewarnaan Hematoksilin Eosin.
Hematoksilin memiliki sifat pewarna basa, yaitu memulas unsur jaringan
yang basofilik, sedangkan eosin memulas unsur jaringan yang bersifat
asidofilik. Kombinasi ini yang paling banyak digunakan.
16

g. Sampel hepar ini lalu difiksasi dengan formalin 10%. Selanjutnya,
sampel ini dikirim ke laboratorium untuk pembuatan sediaaan
mikroskopis jaringan hepar.
6. Prosedur Pembuatan Preparat Histopatologi
Adapun prosedur pembuatan preparat histopatologi, yaitu :
37
a. Fiksasi
Larutkan fiksasi yang digunakan adalah fosfat buffer formalin,
formulanya sebagai berikut:
Formalin 10 cc
Acid sodium phosphate monohydrate 0,4 gr
Anhydrous disodium phosphate 0,65 gr
Aquades sampai 100cc

49




b. Dehidrasi
Memakai alkohol dengan yang makin pekat dari alkohol 70 %, 95 %,
hingga akohol absolut.
1. Alkohol 75 % selama 30 menit.
2. Alkohol 95 % selama 30 menit 3 4x.
3. Alkohol 100 % selama 30 menit, diganti selama 4x.
c. Clearing
Memakai xylol I dan xylol II masing masing selama 30 menit.
Impregnasi/embedding
Pembenaman dilakukan dengan paraffin cair 50 60
o
C selama 1 jam 2x.
d. Pengecoran (pembuatan paraffin block)
e. Pengirisan jaringan
Pengirisan jaringan setebal 4-5 mikron.
f. Pewarnaan
Pewarnaan yang dipakai dengan menggunakan hematoksilin eosin,
dengan cara memulas:
1. Memasukkan preparat ke dalam xylol I 3-5 menit.
2. Pindahkan ke xylol II selama 3-5 menit.
3. Masukkan berturut-turut kedalam alkohol 100 %, 95%,
70% masingmasing selama 3 menit.
4. Celupkan aquades sebanyak 7 celup.
5. Masukkan hematoksilin selama 5-10 menit.
6. Air mengalir 5 menit.
50




7. Masukkan ke HCL 1% selama 15-60 menit.
8. Dibilas dengan air.
9. Masukkan ke eosin 1% selama 15-60 menit.
10. Pindahkan berturut-turut ke alkohol 70 %, 95 %, dan 100 %
masing-masing 7 celup.


















51




3.9. Alur penelitian





























Gambar 3.2.Diagram Alur penelitian
25 ekor mencit putih jantan umur
2-3 bulan berat badan 20-25 gr
Mencit diadaptasi selama 1 minggu
Mencit diberi perlakuan selama 14 hari
5 ekor mencit
diberi
aquadest
sebagai kontrol
negatif ( - )
5 ekor mencit
diberi etanol
tanpa diberi
ekstrak buah
delima merah
sebagai
kontrol positif
( + )
5 ekor mencit
diberi ekstrak
delima merah
0,07 mg/grBB
1x/hari
sebagai KP 1
5 ekor mencit
diberi ekstrak
delima merah
0,21 mg/grBB
1x/hari
sebagai KP 2
5 ekor
mencit diberi
ekstrak
delima
merah 0,63
mg/grBB
1x/hari
sebagai KP 3
Setelah 1,5 jam
Beri etanol 0,014
mg/grBB

Beri etanol
0,014 mg/grBB

Beri etanol
0,014 mg/grBB
Setelah 14 hari, tikus dinarkosis dengan kloroform
Dilakukan laparotomi lalu hepar mencit diambil
Sampel hepar dikirim ke Laboratorium untuk pembuatan sediaan histopatologi

Pengamatan sediaan histopatologi dengan mikroskop
Sampel hepar difiksasi dengan formalin 10 %
Interpretasi hasil pengamatan
52




3.10. Analisa Data
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan histopatologi dibawah mikroskop
dilakukan uji analisis statistik menggunakan program SPSS 17.0. Hasil penelitian
dianalisis secara statistik dengan uji normalitas Shapiro Wilk dan homogenitas
Levene. Jika varian data normal serta homogen maka dilanjutkan dengan metode
One Way ANOVA. Hipotesis akan dianggap bermakna bila p < 0,05. Jika pada uji
ANOVA atau Kruskal-Wallis menghasilkan nilai p < 0,05 maka akan dilanjutkan
dengan melakukan analisis post hoc LSD untuk melihat perbedaan antar
kelompok perlakuan.