Anda di halaman 1dari 13

1

ABSTRAK
LATAR BELAKANG
Chronic mucocutaneous candidiasis (CMC) ditandai dengan kesensitifan
seseorang terhadap infeksi candida yang mempengaruhi pada kulit, kuku, dan selaput
lendir. Pasien yang mengidap CMC resesif dan autoimunitas memiliki mutasi pada
regulator autoimun AIRE. Penyebab autosomal dominan CMC tidak diketahui.

METODE
Kami mengevaluasi 14 pasien yang berasal dari lima keluarga dengan
autosomal dominan CMC. Kami menginkubasi sel mononuklear darah perifer mereka
dengan kombinasi rangsangan yang berbeda untuk menguji integritas jalur yang
memediasi kekebalan, yang menyebabkan pemilihan 100 gen yang paling mungkin
mengandung kerusakan/ cacat genetik. Kami menggunakan urutan assay array yang
berbasis capture. Diikuti oleh sequencing gengen berikutnya. Untuk
mengidentifikasi adanya mutasi.

HASIL
Sel-sel mononuklear dari pasien yang dievaluasi ditandai dengan produksi
yang buruk dari interferon-, interleukin-17, interleukin-22, menunjukkan bahwa
terdapat kerusakan pada sinyal jalur reseptor interleukin-12 dan interleukin. Kami
mengidentifikasi adanya mutasi missense heterozigot dalam urutan DNA pengkodean
kumparan melingkar (CC) domain sinyal transduser dan aktivator transkripsi 1
(Stat1) pada pasien. Mutasi ini menyebabkan respon yang cacat pada tipe 1 dan tipe
17 sel T helper (Th1 dan Th17). Jalur reseptor interferon- masih utuh pada pasien
ini.



2

KESIMPULAN
Mutasi dalam domain CC Stat1 mendasari autosomal dominan CMC dan
menyebabkan respon kereusakan pada Th1 dan Th17, yang dapat menjelaskan
adanya peningkatan kesensitifan terhadap infeksi fungi. (Didanai oleh organisasi
netherland untuk penelitian ilmiah dan lainnya)






















3

Chronik Mukokutans Kandidiasis (CMC) adalah penyakit imunodefisiensi
yang memiliki karakteristik infeksi pada kulit, kuku dan membrane kutaneus yang
diakibatkan oleh spesies Candida dan dermatopites lainnya. Beberapa tipe dari CMC
adalah, autosomal resesif autoimun polyendocrinopati kandidiasis dengan ektormal
distropi ( APECED), autosomal dominan CMC dengan atau tanpa penyakit tiroid,
autosomal resesif, isolated CMC.
Kerusakan gen pada pasien dengan APECED berada di AIRE autoimun
regulator, dimana AIRE yang memiliki peran penting dalam immunotoleransi.
Kesensitifan terhadap candida pada pasien dengan APECED diakibatkan oleh
autoantibodi yakni pada interleukin 17 dan interleukin 22, karena sel-sel tipe 17 T
helper (Th 17) sangat penting untuk kekebalan antifungi di mukosa. Masih sedikit
yang diketahui tentang kerusakan yang mendasari untuk candida pada pasien dengan
autosomal dominan CMC. Dalam penelitiaan yang terbaru, ditemukan kerusakan
pada Th 17 pada pasien dengan gangguan ini.
Ditemukan bahwa kerusakan pada pasien candida disebabkan oleh mutasi
pada dentin 1 CARD9 yang meningkatkan kesensitifan terhadap fungi tetapi
gambaran klinis tidak lebih parah daripada di autosomal dominan CMC. Kami
mencari penyebab genetik kesensitifan terhadap infeksi fungi mukokutan dalam
keluarga dengan autosomal dominan.









4

METODE
DESIGN PENELITIAN
Penelitian ini disetujui oleh komite etika di Radbound University Nijmegen Medical
Center dan Newcastle dan North Tynesid. Informed consent tertulis disetujui dan
ditandatangani oleh semua anggota keluarga dan subyek kontrol sehat yang
dievaluasi.

KELUARGA 1
Keluarga 1 adalah keluarga yang bukan keturunan Belanda yang terdiri dari
ayah, anak perempuan dan anak laki laki yang telah mengidap CMC berat sejak masa
kanak kanak. ( gambar 1A, tabel S1 dan S2). Pasien yang mengidap penyakit
kandidiasis kronis yang parah orofaringeal dan ddermatophytosis parah dan
kandidiasis kaki. (gambar 1B). Ayah dari keluarga ini mengidap penyakit hepatitis
autoimun, dan anak perempuannya mengidap penyakit hemolisis autoimun dan
anemia pernisiosa, dan juga antibodi antifosfolipid. Anak perempuan nya juga telah
mengidap emboli paru dan pneumonia jirovecii dengan gejala simptomatik infeksi
sitomegalovirus. Anak laki-laki memiliki dermatofitosis luas (Trichophyton rubrum)
pada kaki tapi tidak ada fenomena autoimun. Kami mengkarakteristik respon imun
sel mononuklear perifer-darah (PBMCs) yakni tiga anggota keluarga yang
terpengaruh, ibu yang tidak terpengaruh, dan tiga subyek kontrol sehat. Sang ayah
memiliki sembilan saudara yang tidak terpengaruh (Gambar 1A). Kami melakukan
analisis genetik dari semua anggota keluarga yang terpegaruh dampak dan tidak
terpengaruh.

KELUARGA 2, 3, DAN 4
Kami melakukan analisis imunologi dan analisis genetik dari sampel yakni
sembilan anggota keluarga dari tiga keluarga terkait keturunan Eropa dari Inggris
(Keluarga 2, 3, dan 4). Kesembilan pasien memiliki autosomal dominan CMC dengan
5

hipotiroidisme. Karakteristik mereka telah dilaporkan sebelumnya 9, 10 (Tabel S1 di
Lampiran). Satu pasien di keluarga 2 memiliki karsinoma sel skuamosa oral, dimana
dalam keluarga ayahnya terdapat 4 orang meninggal karena kanker esophagus.
Semua pasien diskrining untuk mutasi AIRE yang berguna untuk menyingkirkan
syndrome APECED. Kami juga menganalisis sampel dari anggota keluarga yang
tidak terpengaruh dari Keluarga 4.

KELUARGA 5
Kami menganalisis dua anggota dengan
CMC dan tiga dari anggota yang tidak
terpengaruh dari keluarga Belanda (Keluarga
5). Kedua Pasien 1 dan ibunya menderita
kanker esofagus (Tabel S1 di Lampiran).

SUBJEK YANG TIDAK TERPENGARUH
Kami menganalisi 301 subyek kontrol
sehat Belanda yang tidak terkait dan 56 subyek
kontrol sehat Inggris keturunan Eropa untuk
mutasi genetik dari CMC . Kami juga
menganalisis database dari 100 set data exome
yang berasal dari subyek sehat keturunan Eropa
tanpa tanda klinis CMC. Sebuah kuesioner
berfokus mengenai asal etnis dari orang tua dan kakek-nenek dari subyek sehat untuk
mengkonfirmasi nenek moyang mereka berasal Belanda dan Inggris .

PENELITIAN IMUNOLOGI
Kami menginkubasi PBMC ( 5 106 per mililiter ) , diperoleh dengan
sentrifugasi kecepatan tinggi , pada suhu 37 C di piring 96 -well ( Greiner ) , 12
6

dengan atau tanpa panas membunuh Candida albicans ( 1 106 mikroorganisme per
mililiter [ regangan UC820 ] ) , Escherichia coli lipopolisakarida ( 1 ng per mililiter )
( Sigma - Aldrich ) , interleukin - 1 ( 10 ng per mililiter ) , interleukin - 12 ( 10 ng
per mililiter ) , interleukin - 18 ( 50 ng per mililiter ) , interleukin - 23 ( 10 ng per
mililiter ) ( R & D Systems ) , atau interferon - ( 1 mg per mililiter ) ( Boehringer ) .
Kami menggunakan enzim - linked immunosorbent assay untuk mengukur kadar
interleukin - 1 , tumor necrosis factor ( TNF - ) , interleukin - 17 , interleukin -
22 ( R & D Systems ) , interferon - , dan interleukin - 6 ( PeliKine ) setelah 24 dan
48 jam inkubasi ( tanpa adanya serum ) dan setelah 5 hari inkubasi ( di hadapan 10 %
serum ) . Semua percobaan dilakukan setidaknya tiga kali .

URUTAN CAPTURE DAN SEQUENCING DNA
Kami menerapkan array berbasis urutan capture diikuti oleh sequencing
generasi berikutnya (454 Life Sciences) untuk menganalisis gen dari 100 jalur
imunologi dikenal (Tabel S3 dalam Lampiran Tambahan). Detail mengenai statistik
cakupan juga disediakan pada Tabel S4 dalam Lampiran.

VALIDASI MUTASI DAN HAPLOTYPE ANALISIS
Untuk memvalidasi adanya mutasi pada sinyal transduser dan aktivator
transkripsi 1 (STAT1) pada pasien yang terkena pengaruh, dapat diperkuat dengan
DNA mereka, menggunakan polymerase-chain-reaction (PCR) assay, dan sekuensing
fragmen DNA yang diperkuat dengan metode Sanger. Semua ekson coding yang
melingkar-coil (CC) domain STAT1, termasuk ekson 10, yang diperkuat dan
dianalisis. Mutasi AIRE dikeluarkan oleh sekuensing gen yang sudah dijelaskan
sebelumnya. Kami menggunakan 250K single-nucleotide polymorphism-(SNP) array
(Affymetrix) 14 dan Sanger sequencing untuk menentukan haplotipe terkait dengan
mutasi STAT1.

7

HASIL

KELAINAN IMUNOLOGI DALAM KELUARGA 1
Antara anggota keluarga 1 yang tidak terpengaruh, stimulasi PBMC dengan
candida menghasilkan jumlah protein sitokin interleukin-1, interleukin-6, dan TNF-
yang normal (Gambar.2A dan Gambar S1A pada lampiran), bersama dengan
aktivasi normal toll-like receptor 4(TLR4), toll-like receptor 2(TLR2), dan sinyal jalur
reseptor Dectin 1(Gambar 2B). Sebaliknya, anggota keluarga dengan autosomal
dominan CMC memiliki tingkat helper T-sel sitokin interferon-, interleukin-17, dan
interleukin-22 yang rendah pada reaksi PBMC terhadap stimulasi candida.
Setelah itu, kami meneliti jalur yang mengarah kepada produksi interferon-,
interleukin-17, dan interleukin-22 oleh T-sel pasien. Induksi interferon- pada
paparan sel ini terhadap kombinasi interleukin-12 dan interleukin-18 ini sebagian
rusak (Gambaran 2D). Paparan interleukin-12 itu sendiri menghasilkan interferon-
yang tidak dapat dideteksi, dan paparan interleukin-23 dan interleukin-1b
mengakibatkan produksi interleukin-17 atau interleukin-22 tidak terdeteksi.
(Gambaran 2E, dan Gambaran S1B pada Supplementary Appendix). Namun
demikian, stimulasi mitogenik, menyebabkan produksi interferon- yang normal pada
pasien ini (data tidak ditampilkan). Produksi normal interleukin-6 terhadap stimulasi
interleukin-1 membuktikan bahwa jalur ini masih bergantung pada interleukin-1
reseptor tipe 1 yang masih dalam keadaan baik/utuh (Gambaran 2E). Kesimpulannya,
bahwa kedua jalur interleukin-12 dan interleukin-23 terganggu pada anggota
keluarga yang terkena (Gambaran 3).

MUTASI MISSENSE PADA STAT 1
Mutasi STAT3, yang diketahui penyebab sindrom hyperimmunoglobulin E
dan yang terlibat dalam reseptor interleukin-12 dan interleukin-23 jalur reseptor
sinyal, tidak terdapat pada ketiga anggota keluarga 1 yang terpengaruh. Peneliti juga
8

tidak menemukan adanya mutasi pada STAT4, yang kebetulannya mengkode protein
yang terlibat dalam jalur sinyal, atau dalam AIRE. Berdasarkan pengamatan terhadap
defek sitokin yang diamati, peneliti memilih 100 gen yang mengkode protein yang
berhubungan dalam sinyal interleukin-12 dan interleukin-23 dan respon Th1 dan
Th17 (Tabel S3 dalam lampiran).



9

ANALISIS URUTAN 100 GEN KANDIDAT
Dengan menggunakan array berbasis urutan kapture yang diikuti oleh urutan
generasi berikutnya , kami mengamati terdapat rata-rata 723 varian per sampel.
Mengingat bahwa penyakit ini adalah penyakit langka dan diturunkan secara
autosomal dominan, kami memutuskan untuk menyaring varian ini berdasarkan
varian dikenal SNP . Dari 723 varian yang diidentifikasi , terdapat 651 varian yang
berhubungan dengan SNP atau berlokasi di daerah polymerphic . Setelah
pengecualian varian yang terdeteksi oleh proyek urutan exom , dalam sebuah
database in-house , atau melalui Proyek
Genom 1000 , kami mendapatkan sisa rata-rata
38 varian baru per pasien ( Tabel S8 dalam
Lampiran). Dalam varian ini , hanya 4 per
pasien kode non - identik varian , dan dari
jumlah ini , tidak lebih dari 4 disebut di
minimal 20 % dari semua diteliti dan karena
itu dianggap sebagai varian kandidat
heterozigot .
Dari 11 calon varian, hanya 7 yang
diamati yang berasal dari anggota keluarga
yang terpengaruh. Manakala dari 7 varian , 3
cosegregated di tiga anggota yang terpengaruh
pada Keluarga 1 ( Tabel S9 dalam Lampiran) .
Pasien ini masing-masing membawa varian
gen heterozigot dari STAT1 di ekson 10
dengan pemetaan kromosom 2 (c.820C T;
p.Arg274Trp ) . Mutasi memprediksi perubahan asam amino ( arginin untuk
trytophan ) dalam domain CC STAT1 (Gambar S2 dan S3 dalam Lampiran) . Pada
setiap pasien yang terkena dampaknya , STAT1 adalah satu-satunya gen dengan
10

heterozigot , kode non - identik varian , sehingga menjadi kandidat gen yang paling
mungkin. Salah satu anggota keluarga yang tidak terpengaruh (istri Pasien 1 dan ibu
Pasien 2 dan 3) dan dua subjek yang tidak terkait tidak membawa mutasi pada
STATS1. Dari semuanya, heterozigot, kode varian yang non- identik, mereka yang
dalam STAT1 terpengaruh pada residu asam amino yang menunjukkan konservasi
terkuat diatas 44 spesies vertebrata.

MUTASI STAT1 PADA ORANG LAIN YANG TERPENGARUH
Berikutnya kami meneliti tiga keluarga Inggris keturunan Eropa dengan
autosomal dominan CMC (Gambar 4, dan Tabel S1 dan S10 dalam Lampiran).
Dengan menggunakan teknik yang sama, kami mengamati STAT1 varian yang
berbeda (c.800C T; p.Ala267Val), yang juga mempengaruhi ekson 10 pada pasien
yang turut terpengaruh. Seorang anggota yang terpengaruh dari keluarga lain (Pasien
5 di Keluarga 2) memiliki cakupan yang sangat lemah untuk ekson 10 dari STAT1.
Namun inspeksi manual bacaan menunjukkan varian yang sama dalam dua dari lima
bacaan. Pada pasien yang masing-masing terpengaruh, kami mengkonfirmasikan
adanya mutasi ini pada PCR amplifikasi urutan DNA pengkodean domain CC
STAT1, diikuti oleh urutan Sanger (Gbr.4, dan Tabel S10 dalam Lampiran
Tambahan).
Urutan analisis STAT1 pada pasien yang terpengaruh tambahan
mengungkapkan Arg274Trp varian dalam anggota keluarga ketiga (Pasien 1 di
Keluarga 4) dan Ala267Val varian dalam dua pasien dari keluarga Belanda kedua
dengan autosomal dominan CMC (Pasien 1 dan 2 di Keluarga 5 ) (Gbr.4). Kami tidak
mengidentifikasi Ala267Val atau Arg274Trp varian 301 tidak terkait subyek kontrol
sehat di Belanda atau 56 subyek kontrol yang sehat di Inggris. Kami juga tidak
mengamati varian tersebut dalam 100 data exome set dari subyek keturunan Belanda
atau di 179 subyek keturunan Eropa dengan sampel DNA yang disekuensing sebagai
bagian dari 1000 Genomes Project. Pada analysis yang lebih lanjut dari 100 in-house
11

exom diidentifikasi hanya satu perubahan baru missense pada gen STAT1 (c.314T
C), yang kami atribut pada artefak pemetaan yang disebabkan oleh elemen ulangi
mendasari dalam ekson 5.

ANALISIS HAPLOTIPE
Untuk menentukan apakah mutasi STAT1 mutasi pendiri, kami melakukan
analisis haplotipe menggunakan high-density array SNP dan urutan Sanger DNA
genom dari anggota yang terpengaruh dan tidak terpengaruh dari semua keluarga
dalam penelitian kami. Kami menyimpulkan bahwa Arg274Trp dan Ala267Val
mutasi terletak di haplotipe yang berbeda (Tabel S11 dalam Lampiran Tambahan).
Tambahan pula, setiap mutasi terletak pada haplotype yang berbeda yang umum bagi
semua keluarga yang membawa mutasi, dicadangkan bahwa ada efek pendiri untuk
setiap mutasi, meskipun ada kemungkinan bahwa mutasi yang sama terjadi lebih dari
sekali pada haplotipe umum secara kebetulan. Yang terakhir ini dikuatkan oleh fakta
bahwa dalam Keluarga 1, hanya 1 Pasien dipengaruhi dan sembilan saudara tidak
terpengaruh (menunjukkan tetapi tidak membuktikan adanya mutasi de novo).

PENEITIAN FUNGSIONAL
Analisis Sitokin dari PMBCs diperoleh dari pasien dengan CMC dalam
penelitian konfirmasi mengungkapkan kekurangan yang serupa dengan yang diamati
dalam Keluarga 1: kekurangan produksi interferon-y dalam menanggapi stimulasi
interleukin-12 dan tidak ada produksi interleukin-22 dalam menanggapi stimulasi
interleukin-1 dan interleukin-23 (Gambar S6A dalam Lampiran Tambahan). Dalam
anggota yang tepengaruh dari Keluarga 1, kami menemukan bahwa penambahan
interferon-y untuk E. coli lipopolisakarida menghasilkan peningkatan produksi TNF-
, yang menunjukkan bahwa jalur sinyal interferon-y masih utuh (Gambar S6B dalam
Lampiran Tambahan)

12


DISKUSI

Kita menemukan bahwa mutasi mempengaruhi wilayah CC (Coiled-coil) dari
Signal Transducer and Activator of transcription 1 (STAT1) pada pasien dengan
autosomal dominan CMC ( Chronic Mucocutaneus Candidiasis) mengakibatkan
kerusakan dari respon Th1 dan Th17, yang ditandai dengan penuruan produksi
interferon gamma, interleukin-17 dan interleukin-22. Sitokin ini sangat penting
sebagai pertahanan terhadap antifungal di kulit dan mukosa. Anggota keluarga 1 yang
terkena memiliki monosit-dependen sitokin respon yang normal tetapi rusak pada
respon Th1 dan Th17. Penemuan ini sejalan dengan kedua penelitian sebelumnya
yang menunjukkan kerusakan produksi dari interferon gamma, interleukin-17 dan
interleukin-22 pada pasien dengan CMC ( Chronic Mucocutaneus Candidiasis) atau
sindrom hiperimmunoglobulin E dan dengan pengamatan bahwa interleukin-17 tikus
yang rusak sensitif terhadap kandidiasis oral
Mutasi STAT1 telah dijelaskan kepada pasien dengan peningkatan sensitivitas
terhadap virus dan mikobakteria. Mutasi-mutasi ini terletak pada region dari STAT1
yang mengkode Src Homology 2(SH2) atau DNA binding domain dari protein dan
mengakibatkan kerusakan sinyal dari interferon gamma, dan tipe 1 interferon
receptor pathway. Mutasi pada CC domain dari STAT1(phe172Ser) mengakibatkan
penurunan cepat protein STAT1, sedangkan mutasi lainnya pada CC domain
dimerisasi diblok dari nonphosporilasi molekul. Mutasi-mutasi ini mempengaruhi
wilayah CC (Coiled-coil), kami mengamati bahwa pasien dengan autosomal
dominan CMC (Chronic Mucocutaneus Candidiasis) langsung mempengaruhi respon
Th1 dan Th17, dengan memodifikasi interaksi dari STAT1 yang berikatan pada
STAT3 dan STAT4.
STAT1 dan STAT2 homodimers diantara sinyal interferon gamma reseptor,
yang menyebabkan resistensi terhadap mikroorganisme intraseluler. Sinyal
13

Interferon gamma reseptor dipertahankan pada pasien dengan autosomal dominan
CMC ( Chronic Mucocutaneus Candidiasis) yang dapat menjelaskan bahwa mereka
sensitive terhadap bakteri dan virus. Namun, infeksi lainnya disebakan oleh candida
dan dermatopites,mulai dari infeksi bakteri pada dada terhadap pneumonia dan
infeksi sitomegalovirus, terjadi pada pasien yang berasal dari Belanda dan Inggris.
pada 2 anggota keluarga yang terkena dengan mutasi Arg274Trp memiliki gangguan
autoimun. STAT1 dan interleukin-17 telah dilaporkan sebelumnya bahwa hal tersebut
terlibat dalam patogenesis penyakit autoimun. Interleukin-17 tampaknya tidak
mungkin menjadi penyebab dari penyakit ini, karena dihasilkan pada level rendah
dengan PBMCs dari pasien yang terkena. Tiga pasien yang terkena hypothyroidism,
dengan dua dari mereka membawa c.800C -> T mutasi dan satu membawa c.820C -
>T mutasi. diketahui bahwa thyrotropin menginduksi produksi dari Suppressor of
cytokine signaling 1 (SOC1) yang pada gilirannya dapat mengubah phosforilasi
STAT1. Thyrotropin dapat bertindak sebagai inhibitor sitokin di jaringan tiroid dan
mutasi STAT1 dapat menghambat melepaskan sel hipotiroid oleh thyrotropin
menyebabkan hipotiroidism. di samping itu, mungkin ada penurunan timbunan
yodium, seperti halnya dengan kekurangan STAT1 tikus. Akhirnya salah satu pasien
Belanda yang terkena (dan almarhum ibu nya) dan dua anggota keluarga Inggris,
yang semuanya membawa mutasi ala267Val, memiliki karsinoma esofagus atau
karsinoma oral. hilangnya fungsi dari STAT1 telah dikaitkan dengan karsinoma
esophagus
Kesimpulan, kita menemukan bahwa mutasi mempengaruhi wilayah CC
(Coiled-coil) dari Signal Transducer and Activator of transcription 1 (STAT1)
menyebabkan autosomal dominan CMC ( Chronic Mucocutaneus Candidiasis).
STAT1 mutan mungkin mempengaruhi pertahanan host terhadap spesies candida
melalui respon Th1 dan Th17 yang tidak normal.Penemuan ini harus memfasilitasi
diagnosis dari CMC pada pasien dengan kandidiasis kronik.