Anda di halaman 1dari 7

Diagnosis konsumsi alkohol kronis

Analisis rambut untuk etil-glukuronat


C. Jurado *, T. Soriano, M.P. Gime'nez, M. Mene'ndez
Instituto Nacional de Toxicolog'a, P.O. Box 863, 41080 Sevilla, Spanyol
Tersedia online 15 Juni 2004
abstrak
Makalah ini menjelaskan prosedur untuk deteksi dan kuantifikasi etil-glukuronat (ETG)
dalam sampel rambut. Selama metode pengembangan khasiat dari ekstraksi ETG dari rambut
dibandingkan dalam empat metode ekstraksi: (a) metanol, (b) metanol: air (1:1); (c) air, dan
(d) air: asam trifluoroasetat (9:1). Selain itu, tiga agen derivatizing dibandingkan dengan
baik: N, O-bistrimethylsilyl-trifluoroacetamide (BSTFA): trimetilklorosilan (TMCs) (99:1)
anhidrida, pentafluoropropionic (PFPA) anhidrida dan heptafluorobutyric (HFBA). Air
ditemukan menjadi pelarut ekstraksi terbaik dan PFPA yang terbaik derivatizing agent.
Keduanya memberikan pemulihan tertinggi, dengan ekstrak bersih dan derivatif lebih stabil.
Metode terakhir adalah sebagai berikut: sekitar 100 mg rambut yang berurutan dicuci dengan
air dan aseton. Sampel didekontaminasi secara halus dipotong dengan gunting, maka standar
internal deuterated (ETG-d5) dan 2 mL air ditambahkan. Setelah sonikasi selama 2 jam,
sampel adalah dipertahankan pada suhu kamar semalam. Derivatisasi dilakukan dengan
PFPA. Derivatif yang disuntikkan ke dalam GC-MS sistem dalam modus dampak elektronik.
Metode ini menunjukkan linearitas selama rentang konsentrasi 0,050-5 ng / mg. Deteksi dan
kuantifikasi batas adalah 0,025 dan 0,050 ng / mg, masing-masing. Berarti pemulihan untuk
tiga konsentrasi belajar (rendah, sedang dan tinggi) yang lebih tinggi dari 87%. Koefisien
variasi dalam presisi intra-dan antar-assay selalu lebih rendah dari 7%. Metode ini secara
rutin diterapkan di laboratorium kami untuk diagnosis konsumsi alkohol kronis.
# 2.004 Elsevier Ireland Ltd All rights reserved.
Kata kunci: Alkohol penanda; Etil-glukuronat; analisis rambut

1. pengantar
Penyalahgunaan alkohol merupakan salah satu masalah sosial yang paling serius seluruh
dunia. Untuk alasan ini, para ilmuwan telah memfokuskan studi mereka, selama bertahun-
tahun, dalam mencari penanda yang cocok memungkinkan mereka untuk membangun
peningkatan kronis konsumsi alkohol. Analisis rambut sudah menunjukkan manfaatnya
dalam menetapkan konsumsi kronis penyalahgunaan obat [1]. Demikian juga, jika kami
menganalisa memadainya penanda alkohol dalam sampel rambut, kita harus mampu
membangun konsumsi alkohol selama periode waktu dimana hanya bergantung pada panjang
rambut. Jumlah awide penanda alkohol telah diselidiki dalam darah dan urin [2,3], namun
hanya dua, etil-glukuronat(ETG) [4-10] dan ester asam lemak etil [10-13] telah
terutama dianalisis dalam sampel rambut. Dalam organisme manusia, etanol terutama
dimetabolisme oleh oksidasi di hati (sekitar 90-95%) dan dalam jumlah yang lebih kecil oleh
ginjal (0,5-2%), paru-paru (1,6-6%) dan kulit (0,5%) [14 ], sedangkan, fase II
biotransformation etanol untuk ethylglucuronide hanya mewakili 0,5% dari eliminasi etanol
total [15,16]. ETG adalah metabolit langsung non-volatile, larut dalam air, dari etanol yang
dapat dideteksi dalam cairan tubuh, darah dan urin, untuk jangka waktu yang lama setelah
hilangnya lengkap etanol. Dalam beberapa kasus telah ditemukan bahkan 80 h setelah
konsumsi etanol [17]. Dalam ETG rambut pertama dideteksi pada tahun 1993 oleh Sachs [4]
dan 1 tahun kemudian oleh Aderjan et al. [5] dan Skopp et al. [6]. Analytical metode serta
deteksi (LOD) dan kuantisasi (LOQ) batas telah meningkatkan dari waktu ke waktu.
Sehingga, sedangkan pada tahun 1994 Aderjan [5], dengan GC-MS-EI, dilaporkan mulai
LOQs dari 1 sampai 5 ng / mg, pada tahun 2001 Yegles et al. [7], dengan menggunakan GC-
MS-NCI, mampu mengukur konsentrasi 0,002 ng / mg. ETG terdeteksi, pada 49 sampel
rambut dari orang-orang dengan diketahui riwayat penyalahgunaan alkohol sering, dalam
konsentrasi sampai dengan 13,2 ng / mg, sedangkan ETG tidak terdeteksi di rambut dari
empat peminum sosial dengan konsumsi harian yang dilaporkan sendiri hingga 30 g etil
alkohol. Dalam rambut dari lima anak, ETG tidak terdeteksi [8]. Dalam studi lain, di
postmortem sampel ETG pecandu alkohol ditemukan dalam konsentrasi 4025 pg / mg dan
pada pasien penarikan alkohol dalam kisaran 119-388 pg / mg [9]. Tidak ada ETG ditemukan
di rambutnpeminum sosial dan anak-anak. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengembangkan dan memvalidasi metode, sensitif analisis yang tepat dan spesifik untuk
penentuan etil-glukuronat dalam sampel rambut2. Bahan dan metode

2.1. Reagen
Etil-glukuronat dan etil-glukuronat-d5 (ETG-d5), yang yang terakhir digunakan sebagai
standar internal, yang dibeli dari Medichem (Stuttgart, Jerman), trifluoroasetat (TFA),
pentafluoropropionic (PFPA) dan heptafluorobutyric (HFBA) anhidrida diperoleh dari Sigma
(Madrid, Spanyol). N, O-Bistrimethylsilyl-trifluoroacetamide (BSTFA): trimetilklorosilan
(TMCs) (99:1) diperoleh dari Supelco (Bellefonte, PA). Yang lain bahan kimia dan reagen
adalah kelas analitis dan diperoleh dari Merck (Barcelona, Spanyol).
2.2. rambut sampel
Rambut sampel yang dianalisis dalam penelitian ini berasal dari kasus di mana pembentukan
konsumsi alkohol kronis yang diperlukan. Mayoritas dari mereka berasal dari perceraian
proses. Untuk pengembangan dan optimalisasi metode, tiga kolam renang rambut dibuat-
setidaknya 5 g adalah diperlukan agar dapat melakukan semua tes dan penentuan. Sampel
dipilih dari antara yang diterima di Instituto Nacional de Toxicolog'a di Sevilla, Spanyol.
Konsumsi alkohol dikenal karena sampel sebelumnya dianalisis untuk penyalahgunaan obat
dan mereka memberikan hasil yang positif untuk ethylbenzoylecgonine (EBE), juga dikenal
sebagai cocaethylene, metabolit dari kokain berasal setelah konsumsi simultan kokain dan
etanol. Akhirnya, kami memilih tiga sampel rambut dengan konsentrasi EBE dari 8,97, 4,69
dan 9,23 ng / mg, masing-masing. Sampel didekontaminasi, halus dipotong dan dicampur
untuk mendapatkan homogen kolam renang dari masing-masing sampel. Sebuah kolam
sampel rambut kosong diperoleh dari eightyear- gadis yang pasti tidak minum alkohol setiap
minuman.
2.3. metode analitis
Sekitar 100 mg rambut yang berurutan dicuci dengan air dan aseton selama 15 min masing-
masing. didekontaminasi rambut Sampel dikeringkan dan dipotong halus (<1 mm).
Kemudian, 50 mL 1 ng / mL metanol solusi standar internal (ETG-d5) dan 2 mL air
ditambahkan. Setelah sonikasi selama 2 jam, yang sampel dipertahankan pada suhu kamar
semalam. Itu Keesokan harinya sampel disentrifugasi dan lapisan atas diuapkan sampai
kering di bawah aliran nitrogen, dengan bantuan pemanasan blok pada 40 8C (model 2050-1,
Lab-Line Instrumen Inc, Melrose Park, IL). Ekstrak yang terkandung dalam botol itu
diderivatisasi dengan 100 mL PFPA selama setengah jam di ruang- temperatur. Setelah
penguapan, residu dilarutkan
2.4. instrumentasi
Identifikasi, karakterisasi dan kuantifikasi ETG dilakukan dalam sistem GC-MS, yang terdiri
dari spektrometer massa HP-5973 digabungkan ke kromatografi gas HP-6890 dan dilengkapi
dengan injector otomatis HP-7683 (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). kromatografi
pemisahan dicapai dengan kolom kapiler DB-1 (25 m di panjang? 0,2 mm i.d. ? 0,33 mm
ketebalan film). Suhu oven diadakan di 70 8C selama 2 menit, kemudian diprogram untuk
280 8C pada tingkat 20 8C/min. dan diadakan di suhu ini selama 4 menit. Injektor dan GC-
MS antarmuka suhu adalah 220 dan 280 8C, masing-masing. Helium digunakan sebagai gas
pembawa dengan laju alir 1 mL / menit. Detektor selektif massa dioperasikan secara
elektronik Dampak modus pada 70 eV. Ion suhu sumber adalah 230 8C. Pengambilan data
dilakukan dalam pemantauan ion terpilih (SIM) mode. Dalam kondisi waktu retensi turunan
pentafluoropropionic dari ETG adalah 7,62 menit. Dan massa m / z adalah 333.100, 23440
dan 4952 untuk ETG-PFP dan m / z 338, 239 dan 500 untuk ETG-d5-PFP (ion digarisbawahi
digunakan untuk kuantifikasi, sementara yang lain adalah kualifikasi ion). ETG diidentifikasi
oleh waktu retensi dan relatif kelimpahan dari tiga ion dipantau dibandingkan dengan standar
internal. dengan 50 mL n-heksana, dan 1 mL (berisi pentafluorinated turunan dari ETG dan
ETG-d5) disuntikkan ke dalam sistem gas kromatografi-spektrometer massa (GC-MS).
3. Optimasi metode analisis
3.1. Efek dari empat pelarut pada kemanjuran ETG ekstraksi dari rambut Beberapa prosedur
untuk membebaskan ETG, yang dimasukkan dalam sampel rambut, dijelaskan dalam
literatur. Mereka termasuk perawatan dengan air [7,8] atau dengan metanol: air [5,6].
Gambar. 1. Perbandingan efektivitas dari empat metode dalam penggalian ETG dari rambut.
Bar adalah konsentrasi rata-rata dan garis adalah rentang (konsentrasi maksimum dan
minimum). Dalam sampel 3 hanya tiga metode dibandingkan karena kuantitas rendah sampel.
Selama pengembangan metode analisis, yang kemanjuran ETG ekstraksi dari sampel rambut
manusia adalah diselidiki dengan menggunakan empat pelarut ekstraksi yang berbeda: (a)
metanol, (b) metanol: air (1:1); (c) air, dan (d) metanol: TFA (9:1). Ekstraksi dilakukan
dengan ultrasonicating tentang 100 mg sampel dengan 2 ml pelarut yang dipilih, di hadapan
standar internal (ETG-d5), selama 2 jam. Kemudian campuran dipertahankan pada suhu
kamar prosedur yang diuraikan semalam dan di atas diterapkan. Enam ulangan dari setiap
sampel dianalisis. Hasil (Gambar 1) menunjukkan bahwa, untuk setiap salah satu dari tiga
sampel dipelajari, semakin tinggi pemulihan dan koefisien lebih rendah dari
Variasi yang diperoleh dengan metode B dan C. Kedua metode memiliki khasiat yang sama,
meskipun C Metode sedikit baik. Faktor lain adalah bahwa ekstrak diperoleh dengan metode
C lebih bersih (Gambar 2), memberikan kami kromatogram dengan kebisingan latar belakang
kurang dan lebih baik puncak bentuk. Akibatnya, hal ini memungkinkan untuk mencapai
LOD rendah dan LOQ, yang dalam kasus ETG, dengan konsentrasi rendah seperti, di kisaran
picograms, adalah hal yang sangat penting untuk dipertimbangkan.
3.2. derivatisasi
Tiga agen derivatizing dibandingkan: pentafluopropionic anhidrida anhidrida,
heptafluobutyric dan N, OBistrimethylsilyl- trifluoroacetamide: trimetilklorosilan (99:1).
Seperti pada studi sebelumnya, enam ulangan adalah dianalisis untuk penentuan masing-
masing. Efikasi dari tiga reagen serupa. Namun demikian, kromatogram yang diperoleh
setelah derivatizing dengan HFBA lebih kotor dan ini menyebabkan LOD dan LOQ tinggi.
Sejauh BSTFA yang bersangkutan, kelemahan adalah bahwa turunan sylil, ETG-TMS,
diperoleh stabil untuk jangka waktu yang sangat singkat, lebih rendah dari 2 jam. Kestabilan
derivatif adalah penting parameter dalam pertimbangan selama pengembangan dari setiap
Metode analitis. Di atas semua, jika metode ini direncanakan untuk secara rutin diterapkan di
laboratorium toksikologi, di mana sampel dapat disuntikkan selama sepanjang malam jika
mereka mudah dibuang di injector otomatis. Untuk semua alasan ini, kami akhirnya memilih
derivatisasi dengan PFPA. Setelah agen derivatizing terpilih, derivatisasi yang kondisi,
seperti suhu dan waktu inkubasi, yang dioptimalkan. Inkubasi kali mulai dari 15 menit untuk
1 jam dan dua suhu, suhu kamar dan 60 8C, adalah dibandingkan. Gambar. 3 menunjukkan
bahwa kondisi terbaik dicapai setelah mempertahankan sampel pada suhu kamar selama 30
min.
4. hasil
4.1. Rentang konsentrasi, linearitas dan sensitivitas ETG konsentrasi dalam sampel rambut
dari pecandu alkohol dan peminum sosial dapat bervariasi dari beberapa picograms per
miligram untuk beberapa nanogram per miligram. Untuk mengembangkan dan memvalidasi
metode yang memungkinkan kita untuk menganalisis sampeldikumpulkan dari berbagai besar
peminum, maka perlu untuk menetapkan linearitas untuk berbagai konsentrasi. Akibatnya
kurva kalibrasi terdiri dari tujuh poin mulai dari 50 pg / mg sampai 5 ng / mg ETG (0,05, 0,1,
0,25, 0,5, 1, 2,5 dan 5 ng / mg) dan ditentukan oleh merendam sampel rambut kosong dengan
jumlah yang tepat dari ETG solusi standar dan kemudian menerapkan di atas dijelaskan
Prosedur. Data kalibrasi diperoleh, y 2.283x? 0,1074 dan r2 0,9991, menunjukkan
proporsionalitas lineal yang baik antara respon dari sistem GC-MS dan dipelajari berbagai
konsentrasi. Sensitivitas ditentukan oleh sampel rambut perendaman dengan meningkatnya
konsentrasi ETG sampai setara respon tiga (batas deteksi, LOD) atau sepuluh (batas
kuantifikasi, LOQ) kali kebisingan latar belakang adalah diamati. LOD dan LOQ adalah
0,025 dan 0,050 ng / mg, masing.
4.2. pemulihan
Pemulihan dievaluasi dengan membandingkan luas puncak ETG yang dihasilkan dari sampel
rambut direndam diekstraksi mengikuti prosedur yang diuraikan, dengan luas puncak yang
diperoleh setelah injeksi standar metanol disiapkan pada saat yang sama konsentrasi dan
tanpa pengobatan sebelumnya. Penelitian dilakukan dalam enam ulangan pada tiga
konsentrasi yang berbeda (0.1, 0.5 dan 1 ng / mg). Baik pemulihan, 98, 94,5 dan 87,3%,
diperoleh pada konsentrasi rendah, menengah dan tinggi, masing-masing 4.3. Intra dan antar-
assay presisi Presisi, didefinisikan sebagai deviasi standar relatif, adalah didirikan pada dua
jenis sampel: a) dalam sampel rambut kosong direndam dengan tiga konsentrasi yang berbeda
ETG, tinggi (1 ng / mg), menengah (0,5 ng / mg) dan rendah (0,1 ng / mg), dan
Gambar. 4. SIM kromatogram dari dua sampel rambut positif: segmen 2 sampel M-2 (A), dan
sampel M-4 (B). Itu konsentrasi ditentukan adalah 0,089 ng / mg (A) dan 0,46 ng / mg(B)
rambut.
b) dalam tiga kehidupan nyata sampel positif di mana berikut berarti konsentrasi ETG diukur:
0,21, 0,65 dan 1,75 ng / mg. Ketepatan intra-assay ditentukan dengan menganalisis, pada hari
yang sama dan dalam kondisi yang sama, enam aliquot setiap jenis sampel. Tiga ulangan
sampel masing-masing adalah disuntikkan ke dalam sistem GC-MS. Inter-assay presisi Data
diperoleh dari analisis dari enam ulangan dari sampel dilakukan pada enam hari yang berbeda
(dua analisis per minggu untuk 3 minggu). Hasil yang diperoleh dari setiap pengujian,
ditunjukkan pada Tabel 1, dapat dianggap diterima5. Aplikasi Metode GC-MS digambarkan
sedang rutin diterapkan di laboratorium kami untuk analisis ETG pada manusia rambut
sampel. Tabel 2 menunjukkan hasil yang diperoleh dalam tujuh Sampel berasal dari proses
perceraian di mana kronis konsumsi obat, termasuk etanol, dituntut untuk ditunjukkan oleh
Pengadilan. ETG terdeteksi di atas uji batas kuantifikasi di semua tujuh sampel. Dua wanita
hanya mengkonsumsi etanol, sedangkan lima lainnya subyek dikonsumsi jenis obat lainnya,
juga. Kromatogram Ion diperoleh dari dua kasus ditunjukkan pada Gambar. 4, salah satunya
dengan konsentrasi 0,09 ng / mg (Gambar 4A), dekat dengan batas kuantifikasi, dan yang lain
dengan konsentrasi tinggi-ETG (0,46 ng / mg) (Gambar 4B).
6. kesimpulan
Sebuah metode untuk analisis etil-glukuronat di rambut sampel telah dikembangkan. Ini
terdiri dari ekstraksi dengan air, derivatisasi dengan PFPA dan analisis dengan GC-MS.
Metode ini telah terbukti menjadi sensitif (LOQ 0,05 ng / mg), tepat dan spesifik. Ini juga
telah dibuktikan berguna dalam aplikasi rutin dalam toksikologi forensik laboratorium.
Ucapan Terima Kasih
Para penulis mengucapkan terima kasih kepada Rosario Ledesma dan Glenn Figueroa untuk
bantuan mereka