Anda di halaman 1dari 22

UJI FIKSASI KOMPLEMEN LANGSUNG DENGAN VIRUS AVIAN

INFECTIOUS BRONCHITIS PADA AYAM



Oleh:
Talitha Khairunisa, SKH B94134253
Yeni Kezia Bekalani, SKH B94134259

PROGRAM PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN
BIDANG LABORATORIUM DIAGNOSTIK
DEPARTEMEN ILMU PENYAKIT HEWAN DAN KESMAVET
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014

PRINSIP KERJA
Metode fiksasi komplemen digunakan untuk mendeteksi
keberadaan antibodi dalam serum pasien.
Komponen pertama dalam metode ini adalah sistem
indikator yang terdiri dari:
sel darah merah domba
antibodi fiksasi-komplemen (immunoglobulin-G)
Sumber eksogenus komplemen (serum darah marmut)
Ketika elemen-elemen tersebut dicampurkan dalam kondisi
optimal, antibodi anti-domba akan berikatan dengan
permukaan sel darah merah.
Komplemen subsekuen akan terikat pada kompleks antigen-
antibodi yang terbentuk dan menyebabkan sel darah merah
menjadi lisis.

Komponen kedua yang digunakan adalah antigen spesifik dan
serum pasien.

Kedua komponen tersebut ditambahkan ke dalam suspensi sel
darah merah domba sebagai tambahan komplemen.

Kedua komponen metode fiksasi komplemen tersebut diuji
secara berurutan.

Serum pasien awalnya ditambahkan ke dalam antigen yang
telah diketahui, kemudian kompleks antibodi-antigen yang
dihasilkan akan mengikat seluruh komplemen.

Sel darah merah domba dan antibodi anti-sel darah domba
ditambahkan.
Apabila komplemen belum terikat dengan kompleks antigen-
antibodi yang terbentuk dari serum pasien dan antigen,
maka komplemen akan dapat berikatan dengan sistem
indikator sel darah merah domba dan antibodi anti-domba.

Sel darah merah domba lisis antibodi di dalam serum
pasien kurang/uji fiksasi komplemen negatif.

Sel darah merah yang lisis serum pasien mengandung
antibodi fiksasi komplemen/ uji fiksasi komplemen positif.
Alat dan metode
Virus
Strain virus avian infectious bronchitis yang diisolasi oleh Dr H.
P. Chu dan Cambridge 163/57.

Infeksi eksperimental pada ayam
- 34 ekor ayam usia 8 minggu dibagi 2 kelompok
- Semua ayam diambil sampel darahnya sebelum diinfeksi.
- Kelompok pertama diinokulasikan dengan 0.25 ml virus
infectious bronchitis (titer virus 10
6.5
EID 50/ml) di daerah
sinus dan trakhea.
- Kelompok kedua menerima inokulasi virus dengan
konsentrasi yang sama secara intravena.

Dua ekor ayam dari setiap kelompok dimatikan pada hari ke-2,
ke-5, ke-7, ke-10, ke-14, dan ke-21 setelah infeksi.
Kemudian empat ekor ayam lainnya juga diambil sampel
darahnya pada hari ke-5, ke-7, ke-10, ke-14, ke-28, ke-35, ke-42,
dan ke-49.
Uji fiksasi komplemen dan uji netralisasi serum dilakukan
terhadap semua sampel serum.
Dosis kedua virus diberikan secara intravena dengan jumlah 0.4
ml pada konsentrasi yang sama kepada ayam-ayam yang tersisa
di setiap grup pada hari ke-49.
Ayam-ayam tersebut kembali diambil darahnya pada hari ke-7,
ke-14, dan ke-21 pasca reinfeksi.
Uji fiksasi komplemen dilakukan terhadap semua sera, dan uji
netralisasi virus dilakukan terhadap 2 ekor ayam dari setiap
grup.
Uji fiksasi komplemen
A. Eritrosit domba
B. Hemolysin
C. Sel Sensitisasi
D. Komplemen
E. Antigen
F. Sera

A. Eritrosit domba

- Seekor domba yang selnya tidak rapuh digunakan untuk
membuat preparasi hemolisin dan sistem indikator.
- Satu volume darah yang dikoleksi secara aseptis
ditambahkan ke dalam setengah volume larutan Alsever.
B. Hemolysin
- Dua ekor kelinci muda diinokulasi secara subkutan dengan 0.5 ml
suspensi 10% sel darah merah domba dan diobservasi selama 10 menit
untuk melihat ada atau tidaknya reaksi yang tak diinginkan.
- Kedua ekor kelinci tidak menunjukkan reaksi apapun 1 ml suspensi
10% sel darah merah domba diinokulasikan secara intravena pada
kedua kelinci.
- Inokulasi suspensi 20% sebanyak 1 ml, 2 ml, 2.5 ml, 3 ml, dan 5 ml
secara intravena dalam interval waktu dua hari.
- Darah kelinci-kelinci tersebut diambil untuk diuji seminggu setelah
penyuntikan terakhir
- Serum kemudian dipanaskan pada suhu 56 C selama 30 menit dan
disimpan dalam gliserin netral yang steril dengan volume yang sama,
kemudian dimasukkan ke dalam ampul kecil dan disimpan pada suhu
4C.
- Dosis hemolitik minimum (MHD) untuk hemolysin ditentukan.
Pengenceran tertinggi hemolisin yang menunjukkan hemolisis
sempurna dianggap sebagai satu unit. Titer hemolisin tersebut adalah
1/16000.

C. Sel Sensitisasi

- Setelah dicuci sebanyak tiga kali, sel darah merah domba
disentrifus pada kecepatan 2000 rev/menit selama 10
menit.
- Suspensi sel darah merah 4% dibuat dalam larutan buffer
veronal (pH 7.4) dan volume setara suspensi ini
dicampurkan dengan volume setara hemolisin yang
diencerkan dan mengandung 4 MHD.
- Campuran tersebut kemudian dikocok hingga tercampur
sempurna dan disimpan dalam water bath pada suhu 37
C selama 20 menit.
- Sel sensitisasi selalu disiapkan segar sebelum digunakan.

D. Komplemen

- Darah marmut jantan muda diambil dan seranya dites
terhadap aktivitas lisis melawan eritrosit domba.
- Hanya marmut yang seranya tidak memiliki aktivitas lisis yang
digunakan dalam penelitian ini.
- Serum bening yang dikoleksi dari enam hingga delapan
marmut dikumpulkan dan diawetkan dengan penambahan
volume setara suatu larutan yang mengandung 12% sodium
asetat dan 4% asam borat dalam aquades.
- Komplemen tersebut kemudian dititrasi terhadap keberadaan
antigen dan serum normal unggas di bawah kondisi uji.
- Pengenceran tertinggi komplemen yang menunjukkan lisis
sempurna ditentukan sebagai satu unit komplemen.

E. Antigen

- Telur fertil berusia 9-10 hari diinokulasikan dengan 0.1 ml dari 10
-2
pengenceran virus (titer virus 10
6.5
EID 50/ml) di kantung allantoisnya
dan diinkubasi pada suhu 37 C.
- Telur yang mati dalam kurun waktu 24 jam dibuang.
- Telur didinginkan setelah virus bermultiplikasi selama 48 jam, cairan
allantois dipanen secara aseptis, dikumpulkan dan disentrifus pada
kecepatan 3000 rev/menit selama 15 menit.
- Cairan allantois yang bening kemudian disentrifus kembali pada
kecepatan 19000 rev/menit selama 1 jam.
- Pellet yang dihasilkan kembali dilarutkan dalam sejumlah kecil buffer
veronal dan diberikan vibrasi pada 1.5 ampere (MSE ultrasonik power
unit) selama 1 menit. Suspensi tersebut kemudian didistribusikan dalam
volume 1.5 ml dan disimpan beku pada suhu -30C.
- Konsentrasi optimal antigen ditentukan berdasarkan adanya serum
positif dengan metode titrasi papan catur (chess board titration).
- Pada metode titrasi papan catur, sebanyak 50 L pengenceran
antiserum dimasukkan ke dalam kolom 1. Kemudian tambahkan 25
L VBS ke dalam kolom 2-6, baris A-H.
- Tepuk plate untuk mencampurkan reaktan.
- 25 L 3HD50 ditambahkan ke dalam sumur 1-6, baris A-H. Tepuk
plate untuk mencampur reaktan dan inkubasikan pada suhu +4 C
selama semalam
- Komplemen 3, 1, 1/2 HD50 dibuat dengan back titration antigen dan
Cback titration.
- Pada back titration, 25 L VBS dimasukkan ke dalam sumur 7, 8, 9
baris A. Letakkan 25 L antigen pada setiap pengenceran efektifnya
ke dalam sumur 7, 8, 9. Masukkan 25 L komplemen 3HD50 ke dalam
kolom 7, baris A, 25 L komplemen 1HD50 ke dalam kolom 8, baris A
dan 25 L komplemen 1/2HD50 ke dalam kolom 9, baris A.
- Pada Cback titration, letakkan 50 L VBS ke dalam sumur 10, 11, dan
12 di baris A. Masukkan 25 L komplemen 3HD50 ke dalam kolom 10,
baris A, 25 L komplemen 1HD50 ke dalam kolom 11, baris A, dan 25
L komplemen 1/2HD50 ke dalam kolom 12, baris A.
- Pada saat inkubasi satu malam telah selesai, letakkan
plate pada suhu +37 C selama 30 menit.

- Pada waktu yang sama, inkubasikan volume HS
secukupnya pada suhu +37 C selama 30 menit dan
campurkan setelah 10, 20, dan 30 menit. Inkubasikan
pada suhu +4C selama 2 jam. Kemudian baca hasil di
plate.

- Pengenceran optimal merupakan hasil yang memberikan
fiksasi lengkap pada pengenceran tertinggi.


F. Sera

- Enam belas ayam diambil darahnya untuk mengkaji aktivitas
antikomplementer sera ayam-ayam tersebut.
- Uji ini dilakukan pada sera yang segar dan tidak dipanaskan, serta
setelah penyimpanan pada suhu 4 C dan -30 C.
- Dua kali pengenceran serum segar yang tidak dipanaskan dibuat
mulai dari 1/8 hingga 1/128.
- Sera yang diencerkan dalam 0.2 ml volume didistribusikan dalam
tujuh baris tube berbeda dan dua unit komplemen dalam 0.2 ml
ditambahkan ke dalam setiap sera diikuti dengan penambahan 0.2 ml
pengenceran antigen.
- Sistem tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 4C.
- Satu baris tube diambil dari kulkas pada waktu 1 jam, 2 jam, 3 jam, 4
jam, 6 jam, 12 jam, dan 18 jam kemudian diinkubasikan pada suhu 37
C selama 30 menit.
- Sistem indikator kemudian diinkubasikan kembali selama 30 menit
pada suhu 37 C setelah ditambahkan sel sensitisasi.
Uji Kelayakan

- Pengenceran ganda berturut pada 0.2 ml sera ayam yang tidak
dipanaskan dibuat di dalam tabung dengan dasar bulat, dimulai dari
pengenceran 1/8, 0.2 ml antigen (4 unit) yang ditambahkan, diikuti
dengan 0.2 ml komplemen (2 unit).
- Kontrol antigen yang sesuai, antiserum, dan komplemen juga
dimasukkan.
- Sistem indikator kemudian disimpan ke dalam kulkas pada suhu 4 C
selama 3 jam, diikuti dengan pengocokan berkala dan inkubasi selama
30 menit di dalam water bath bersuhu 37 C.
- Sel sensitisasi sebanyak 0.2 ml ditambahkan ke dalam setiap tabung
dan hasilnya dibaca setelah tiga menit (menunjukkan hemolisis
sempurna).
- Sera positif dan sera negatif digunakan untuk meyakinkan bahwa
sensitifitas dari kesusksesan uji memiliki hasil yang seragam.
- Pengenceran tertinggi serum menunjukkan bahwa lebih dari 50%
fiksasi dianggap sebagai batas titer serum. Hasil dibaca secara visual.

Uji Netralisasi Serum

- Pengenceran awal dibuat dari 1/2 dan 1/5 sera yang dipanaskan pada
suhu 56C selama 30 menit, kemudian pengenceran seri berganda
dari 1/5 sera dibuat hingga menjadi 1/320.
- Jumlah konstan virus (0.05 ml yang mengandung 100 EID 50)
dicampurkan dengan jumlah setara sera yang diencerkan.
- Campuran tersebut disimpan pada suhu 40 C selama satu jam dan
diinokulasikan dalam 0.1 ml volume ke dalam kantung allantois pada
setiap buah telur ayam yang berjumlah 5 buah telur ayam fertil berusia
9 hari.
- Telur kemudian diinkubasikan pada suhu 37 C selama delapan hari.
- Kematian dan kekerdilan embrio dianggap sebagai indikator terjadinya
infeksi virus IB.
- Telur-telur yang mati dalam kurun waktu 24 jam setelah infeksi
dibuang.
- Pengenceran tertinggi serum menunjukkan bahwa lebih dari 50 %
netralisasi virus diambil sebagai titer serum.
hasil
Tabel 1 Titer antibodi fiksasi komplemen dan netralisasi pada sera ayam yang
dimatikan pada berbagai waktu setelah inokulasi virus infectious
bronchitis secara intratrakheal dan intranasal.
Hari Pasca Infeksi No. Ayam
Titer Antibodi
Fiksasi Komplemen Netralisasi
0 601 <8 <2
2 604 <8 <2
2 605 <8 <2
5 606 <8 <2
5 607 <8 <2
7 609 8 <2
7 667 <8 <2
10 611 16 <2
10 657 16 <2
14 676 64 2
14 669 32 <2
21 608 64 5
21 671 16 5
Tabel 2 Titer antibodi fiksasi komplemen dan netralisasi pada sera ayam
yang dimatikan pada berbagai waktu setelah inokulasi virus
infectious bronchitis secara intravena
Hari Pasca Infeksi No. Ayam
Titer Antibodi
Fiksasi Komplemen Netralisasi
0 600 <8 <2
2 602 <8 <2
2 603 <8 <2
5 656 <8 <2
5 683 <8 <2
7 655 8 <2
7 659 8 <2
10 661 16 <2
10 663 32 <2
14 672 32 2
14 654 32 <2
21 658 32 5
21 669 32 5
kesimpulan
- Dari keseluruhan sera yang didapat sebelum infeksi, tidak ada yang
menunjukkan titer antibodi fiksasi komplemen ataupun netralisasi.
- Antibodi fiksasi komplemen ditemukan di sebagian besar sera setelah
tujuh hari pasca inokulasi virus, namun antibodi netralisasi baru dapat
dideteksi pada hari keempat belas.
- Terdapat kenaikan signifikan antibodi fiksasi-komplemen setelah hari
ketujuh setelah infeksi eksperimental tersebut dan mencapai titer
tertingginya dalam rentang waktu 14 hari hingga 28 hari, sedangkan
antibodi netralisasi mencapai puncak titernya setelah hari ke-28 dan
tetap konstan hingga hari ke-49, yaitu periode maksimum uji.
- Antibodi fiksasi komplemen cenderung menghilang setelah hari ke-28
dan negatif di sebagian besar sera yang diambil pada hari ke-42 dan 49
setelah infeksi.
- Setelah inokulasi kedua, terjadi kenaikan titer antibodi baik pada fiksasi
komplemen maupun netralisasi.