Anda di halaman 1dari 11

TPC (Daging, telur, susu dan produk-produknya)

1. TUJUAN
Total Plate Count dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah total mikroba yang terdapat
dalam bahan pangan dengan cara menghitung koloni bakteri yang ditumbuhkan pada media
agar.

2. PRINSIP
Contoh dimasukkan dalam cawan petri lalu dituangkan dengan SPCA dengan temperatur
sekitar 45-50
o
C lalu dipadatkan kemudian di inkubasi pada temperatur 35
o
C (untuk produk
susu 32
o
C) selama 48 jam.

3. RUJUKAN
SNI 2897 2008

4. TATA CARA
4.1. Peralatan dan Bahan Penunjang Uji

Peralatan
1. Cawan Petri
2. Tabung Reaksi
3. Pipet Mekanik
4. Botol Media
5. Colony Counter
6. pH meter
7. Magnetic Stirrer
8. Vortex Mixer
9. Inkubator
10. Penangas Air
11. Autoclave
12. Lemari Steril (Biosafety Cabinet)
13. Stomacher

Bahan Penunjang Uji
1. BPW (Butterfields Phosphate-Buffered Water)
2. SPCA (Standard Plate Count Agar)

4.2. Penyiapan Contoh

a) Timbang contoh padat dan semi padat sebanyak 25 gram atau ukur contoh air sebanyak
25 ml secara aseptik, kemudian masukkan dalam wadah steril/kantong stomacher.
b) Khusus untuk contoh padat dan semipadat, tambahkan 225 ml larutan BPW steril ke
dalam kantong stomacher yang berisi contoh. Homogenkan dengan stomacher selama 1
menit sampai dengan 2 menit (kecuali untuk contoh susu cair). Ini merupakan larutan
dengan pengenceran 10
-1
.

4.3. Pengujian

a. Pindahkan 1 ml suspensi dengan tip steril ke dalam larutan 9 ml BPW untuk mendapatkan
pengenceran 10-2.
b. Buat pengenceran 10-3, 10-4, 10-5 dan seterusnya dengan cara yang sama seperti butir a,
sesuai kebutuhan.
c. Selanjutnya masukkan sebanyak 1 ml suspensi dari setiap pengenceran ke dalam cawan
petri secara duplo.
d. Tambahkan 15-20 ml SPCA yang sudah didinginkan hingga temperatur 45 - 50 oC pada
masing-masing cawan yang sudah berisi suspensi. Lakukan pemutaran cawan petri ke
depan dan ke belakang atau membentuk angka delapan agar larutan contoh dan media
SPCA tercampur seluruhnya. Diamkan sampai menjadi padat.
e. Inkubasikan pada temperatur 35 1
o
C (untuk produk susu 32 1
o
C) sampai dengan
48 2 jam dengan meletakkan cawan pada posisi terbalik.

4.4. Penghitungan Jumlah Koloni
Hitung jumlah koloni pada setiap seri pengenceran kecuali cawan petri yang berisi koloni
menyebar (spreader colonies). Pilih cawan yang mempunyai jumlah koloni 25 sampai 250.
Untuk lebih lengkapnya lihat Lampiran.

5. MEDIA DAN PEMBUATANNYA
a) BPW
1) Larutan Stok; Larutkan 34 gram KH2PO4 dalam 500 ml air suling. Atur pH 7,2
dengan NaOH 1N (kira-kira diperlukan 175 ml) dan encerkan sampai 1 liter dengan air
suling. Sterilkan dalam autoclave pada suhu 121
o
C selama 15 menit dan simpan dalam
lemari pendingin sampai saat akan digunakan. pH akhir setelah sterilisasi harus 7,0
0,1.
2) BPW; Tambahkan 1,25 ml larutan stok (1) ke dalam 1 liter air suling. Masukkan
ke dalam botol atau tabung pereaksi dalam jumlah tertentu sehingga setelah sterilisasi
isinya menjadi lebih kurang 2 % dari jumlah yang diperlukan (dikehendaki). Sterilkan
dalam autoclave pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
b) SPCA
Komposisi :
Tryptone 5 gram
Yeast Extract 2,5 gram
Dextrose 1 gram
Agar 15 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan. Masukkan dalam botol media, sterilkan pada 121
o
C selama 15
menit.


6. LAMPIRAN













Interpretasi Penghitungan Koloni

Pelaporan hasil :
1. Bulatkan angka menjadi 2 angka yang sesuai, bila angka ketiga 6 atau di atasnya, maka angka
ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua naik 1 angka, misalnya 456 menjadi 460.
2. Bila angka ketiga 4 atau dibawahnya, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua
tetap, misalnya 454 menjadi 450.
3. Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0 (nol) dan angka kedua
adalah genap, misalnya 445 menjadi 440 dan 455 menjadi 460.


E. Coli (Enumerasi pada daging, telur, susu dan produk-produknya)

1. TUJUAN
Tujuan metode pengujian ini untuk memperoleh konsentrasi E. coli dalam atau 1 gram
contoh makanan atau dalam 100 ml minuman. Prosedur ini tidak mencakup untuk
memperoleh konsentrasi E. coli pada air minum dalam kemasan.

2. PRINSIP
Metode Angka Paling Mungkin (APM) terdiri dari uji presumptive (penduga), uji konfirmasi
(peneguhan) dan isolasi-identifikasi melalui uji kimia Indole, Methyl Red, Voges-Proskauer
dan Citrate (IMViC).

3. RUJUKAN
SNI 2897 2008

4. TATA CARA
4.1. Peralatan dan Bahan Penunjang Uji
Peralatan
1. Cawan Petri
2. Tabung Reaksi
3. Pipet Mekanik
4. Botol Media
5. Stomacher
6. pH meter
7. Magnetic Stirrer
8. Vortex Mixer
9. Inkubator
10. Penangas Air
11. Autoclave
12. Lemari Steril (Biosafety Cabinet)

Bahan Penunjang Uji
1. BPW (Butterfields Phosphate-Buffered Water)
2. ECB (EC Broth)
3. SS-LSTB (Single Strength Lauryl Sulphate Tryptose Broth)
4. VRBA (Violet Red Bile Agar)
5. TSAS (Tryptone Soya Agar Slant)
6. KCB (Koser Citrate Broth)
7. MRVPM (Methyl Red Voges Proskauer Medium)
8. Gram Stain (Crystal VioletAmmonium Oxalate, Methyl Red, Lugol, Huckers Counterstain)
9. Reagen Kovac
10. -naphthol 1%
11. TB (Tryptone Broth)
12. Kultur Kontrol E. Coli
13. Kultur Kontrol Enterobacter agglomerans

4.2. Penyiapan Contoh

a) Untuk makanan, timbang contoh padat dan semi padat sebanyak 25 gram kemudian
masukkan dalam wadah steril/kantong stomacher, sedangkan untuk minuman akan dipipet
langsung dari contoh kedalam media.
b) Tambahkan 225 ml larutan BPW steril ke dalam kantong stomacher yang berisi contoh.
Homogenkan dengan stomacher selama 1 menit sampai dengan 2 menit (kecuali untuk
contoh cair yang mudah larut). Ini merupakan larutan dengan pengenceran 10
-1
.

4.3. Pengujian

a. Uji Pendugaan
Buat seri 3 tabung dengan 3 pengenceran.
1) Pipet 1 ml suspensi 10
-1
ke dalam 3 tabung pengenceran pertama yang telah berisi 10
ml SS-LSTB dan tabung durham juga ke dalam tabung yang berisi 9 ml BPW.
2) Pipet 1 ml suspensi pengenceran ke dalam 3 tabung pengenceran kedua yang telah
berisi SS-LSTB juga ke dalam tabung yang berisi 9 ml BPW.
3) Pipet 1 ml suspensi pengenceran ke dalam tabung pengenceran ketiga yang telah
berisi 10 ml SS-LSTB
4) Inkubasi pada temperatur 35
o
C selama 48 3 jam.
5) Perhatikan adanya gas yang terbentuk di dalam tabung Durham. Hasil uji dinyatakan
positif apabila terbentuk gas.

b. Uji Konfirmasi (Peneguhan)
1) Pengujian selalu disertai kontrol positif (gunakan E. coli sebagai kontrol positif).
2) Pindahkan biakan positif dari 4.3.a.5 dengan menggunakan jarum inokulasi dari setiap
tabung SS-LSTB ke dalam tabung ECB yang berisi tabung Durham.
3) Inkubasikan di waterbath pada temperatur 45,5 0.2
o
C selama 48 2 jam.
4) Perhatikan adanya gas yang terbentuk di dalam tabung Durham. Hasil uji dinyatakan
positif apabila terbentuk gas.
5) Selanjutnya lakukan isolasi dan identifikasi kultur yang didapat dari tabung yang
positif.

4.4. Isolasi-Identifikasi

a. Isolasi-identifikasi
1) Buat goresan pada media VRBA dari tabung ECB yang positif. Inkubasi pada
temperatur 35
o
C selama 18-24 jam.
2) Koloni yang diduga E. coli berdiameter 2-3 mm berwarna merah gelap pada bagian
pusat koloni.
3) Ambil koloni yang diduga dari masing-masing media VRBA dengan menggunakan
ose, pindahkan ke TSAS. Inkubasikan TSAS pada temperatur 35
o
C selama 18-24
jam untuk uji biokimia

b. Uji Biokimia dengan IMVIC
1. Uji Produksi Indole
a) Inokulasikan koloni dari tabung TSAS pada TB dan inkubasikan di waterbath pada
temperatur 35
o
C selama 24 2 jam (gunakan kontrol positif dan negatif).
b) Tambahkan 0,2 - 0,3 ml Reagen Kovac.
c) Hasil reaksi negatif ditandai dengan adanya bentuk cincin merah pada lapisan atas
media, sedangkan hasil reaksi negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning.
2. Uji Voges Proskauer
a) Ambil biakan dari media agar miring TSAS lalu inokulasikan ke tabung yang berisi 10
ml MRVPM. Inkubasikan pada temperatur 35
o
C selama 48 2 jam.
b) Ambil 1 ml media, masukkan ke dalam wadah steril. Sisa media kembali di
inkubasikan pada pada temperatur 35
o
C selama 48 2 jam untuk pengujian Methyl
Red.
b) Tambahkan 0,6 ml -naphthol 1% dan 0,2 ml KOH 40% kemudian digoyang-goyang.
c) Hasil reaksi positif ditandai adanya warna merah eosin dalam waktu 2 jam.
3. Uji Methyl Red
a) Ambil dari inkubator sisa dari media MRVPM.
b) Tambahkan 2-5 tetes indikator Methyl Red pada tabung.
c) Hasil uji positif ditandai adanya warna merah dan hasil reaksi negatif ditandai adanya
warna kuning.
4. Uji Citrate
a) Inokulasikan koloni dari media agar miring TSAS ke dalam KCB dan inkubasikan
pada temperatur 35
o
C selama 96 jam.
b) Hasil uji positif ditandai dengan terbentuknya kekeruhan pada media.

Klasifikasi E. coli dapat dilihat pada Tabel 1. (nomor 1 dan 2)

Tabel 1. Hasil IMViC pada E. coli

4.5. Penghitungan Jumlah Koloni
Jumlah E. coli dinyatakan berdasarkan uji APM,isolasi-identifikasi dan uji biokimia.

5. MEDIA DAN PEMBUATANNYA
a) BPW
1) Larutan Stok; Larutkan 34 gram KH2PO4 dalam 500 ml air suling. Atur pH 7,2
dengan NaOH 1N (kira-kira diperlukan 175 ml) dan encerkan sampai 1 liter dengan air
suling. Sterilkan dalam autoclave pada suhu 121
o
C selama 15 menit dan simpan dalam
lemari pendingin sampai saat akan digunakan. pH akhir setelah sterilisasi harus 7,0
0,1.
2) BPW; Tambahkan 1,25 ml larutan stok (1) ke dalam 1 liter air suling. Masukkan
ke dalam botol atau tabung pereaksi dalam jumlah tertentu sehingga setelah sterilisasi
isinya menjadi lebih kurang 2 % dari jumlah yang diperlukan (dikehendaki). Sterilkan
dalam autoclave pada suhu 121
o
C selama 15 menit.
b) SS-LSTB (Single Strength-LSTB)
Komposisi :
Tryptose 20 gram
Lactose 5 gram
K2HPO4 2,75 gram
KH2PO4 2,75 gram
NaCl 5 gram
Sodium Lauryl Sulphate 0,1 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan, atur pH 6,8. Masukkan 10 ml ke dalam tabung reaksi yang
mengandung tabung Durham terbalik. Kemudian sterilkan selama 10 menit pada 121
o
C.
c) DS-LSTB (Single Strength-LSTB)
Komposisi :
Tryptose 40 gram


Lactose 10 gram
K2HPO4 5,5 gram
KH2PO4 5,5 gram
NaCl 10 gram
Sodium Lauryl Sulphate 0,2 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan, atur pH 6,8. Masukkan 10 ml ke dalam tabung reaksi yang
mengandung tabung Durham terbalik. Kemudian sterilkan selama 10 menit pada 121
o
C.
d) ECB
Komposisi :
Tryptose 20 gram
Lactose 5 gram
K2HPO4 4 gram
KH2PO4 1,5 gram
NaCl 5 gram
Bile Salts no. 3 1,5 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan. Jika perlu panaskan agar bahan-bahan benar-benar larut.
Tuangkan 10 ml ke dalam tabung reaksi yang berisi tabung Durham terbalik. Kemudian
sterilkan selama 10 menit pada 121
o
C.
e) VRBA
Komposisi :
Yeast Extract 3 gram
Peptone 7 gram
Sucrose 20 gram
Bile Salts no. 3 1,5 gram
NaCl 5 gram
Lactose 10 gram
Neutral Red 0,03 gram
Crystal Violet 0,002 gram
Agar 15 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan, kemudian panaskan sampai semua bahan larut. Sterilkan pada
temperatur 121
o
C selama 15 menit. pH akhir 7,4.
f) MRVPM
Komposisi :
Peptone 7 gram
Glucose 5 gram
K2HPO4 5 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan, atur pH 6,9. Masukkan ke dalam tabung kimia sebanyak 10 ml.
Sterilkan pada temperatur 121
o
C selama 15 menit.
g) TSAS
Komposisi :
Pancreatic digest of casein 15 gram
Enzymatic digest of soya bean 5 gram
NaCl 5 gram
Agar 15 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan dengan mendidihkan. Setelah larut, masukkan media ke dalam
tabung reaksi lalu sumbat mulut tabung dengan sumbat kapas. Sterilkan pada 121
o
C
selama 15 menit. Setelah selesai sterilisasi, keluarkan dari autoclave dan miringkan tabung
pada Biosafety Cabinet. (PERHATIAN : Jangan sampai media mengenai sumbat tabung)
h) KCB
Komposisi :
Na(NH4)HPO4 1,5 gram
K2HPO4 1 gram
MgSO4 0,2 gram
Sodium Citrate 3 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan, atur pH 6,8. Masukkan ke dalam tabung sebanyak 10 ml.
Sterilkan pada 121
o
C selama 15 menit.
i) TB
Komposisi :
Tryptone 10 gram
Air Suling 1 liter
Larutkan semua bahan. Masukkan ke dalam tabung sebanyak 10 ml. Sterilkan pada 121
o
C selama 15 menit. pH akhir 6,9 0,2
j) Reagen Kovac (Indole)
Komposisi :
P-dimethylaminobenzaldehyde 5 gram
n-Amylalcohol 75 ml
HCl pekat 25 ml
Larutkan P-dimethylaminobenzaldehyde dalam n-Amylalcohol. Dengan perlahan-lahan
tambahkan HCl. Simpan pada 4
o
C.
k) Gram Stain
1. Crystal Violet-Ammonium Oxalate
Komposisi :
- Crystal Violet (90% kadar zat warna) 2 gram
- Etanol (95%) 20 ml
- Ammonium Oxalate 0,8 gram
- Air Suling 80 ml
Larutkan Crystal Violet dalam Etil Alkohol dan Ammonium Oxalate dalam air suling.
Campurkan kedua larutan tersebut dan simpan campuran selama 24 jam sebelum
digunakan.
2. Lugol
Komposisi :
- Iodine 1 gram
- KI 2 gram
- Air Suling 300 ml
Masukkan bahan-bahan ke dalam air suling, campurkan dan biarkan 24 jam sehingga Iod
melarut sempurna.
3. Huckers Counterstain
Komposisi :
- Safranine 0 2,5 gram
- Etanol 100 ml
Larutan Kerja : Tambahkan 10 ml larutan dengan komposisi di atas dengan 90 ml air
suling.
4. Acetone-Alcohol
Komposisi :
- Iodine 10 ml
- KI 10 ml
l) -naphthol 1%
Larutkan 1 gram -naphthol dalam 100 ml alkohol mutlak.
m) Methyl Red
Larutkan 0,1 gram Methyl Red dalam 300 ml etanol lalu encerkan dengan air suling
menjadi 500 ml

6. LAMPIRAN

Tabel 1. MPN seri 3 tabung dengan tiga pengenceran dengan tingkat kepercayaan
95%


Lanjutan Tabel 1. MPN seri 3 tabung dengan tiga pengenceran dengan tingkat
kepercayaan 95%