Anda di halaman 1dari 30

Kuliah Kedua

Metoda Mempelajari
mikroorganisme
Untuk apa dipelajari
Mengetahui Jumlah Mikroorganisme. Pada
Perairan mikroba yang sudah melebihi 10
6

sudah dikatakan tercemar
Mengetahui Jenis-jenis mikroorganisme, apa
saja yang ada, organisme menguntungkan
atau merugikan?
Beberapa metoda yang bisa dilakukan
plate count (spread plate, pour plate, spiral
plate),
membrane filtration, MPN, menghitung
langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara
lainnya (misalnya aktivitas metabolik,
turbidimetri, berat kering dll)
Molekuler DNA 16 S
Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada
cawan digunakan satuan CFUs/volume atau
berat. CFUs adalah singkatan dari Coloni
Forming Units yang artinya unit-unit / satuan
pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan
pembentuk koloni adalah sel tunggal atau
sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam
cawan akan membentuk satu koloni tunggal.
Pada dasarnya sel tersebar homogen pada
sampel,
Perhitungan bakteri dengan metoda cawan
Faktor yg diperhatikan pada analisa
sampel jumlah mikroorganismenya :

Memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam sampel
per satuan volum.
Memilih metode yang cocok sehingga dihasilkan data yang akurat.
Mengetahui jenis/golongan mikroorganisme yang akan dihitung,
misalnya bermaksud akan menghitung yeast, bakteri, atau bakteri
genus tertentu saja.
Menentukan media pertumbuhan yang cocok.
Benar-benar mengetahui perbedaan morfologi koloni antara
bakteri, yeast dan molds.
Mencari tahu standar/ batas ambang/ jumlah maksimum aman jika
sample yang dianalisa memerlukan referensi tersebut.
Memperkirakan jumlah sampel (volum/berat) yang perlu
ditampung pada saat pengambilan sampel yang disesuaikan dengan
sample size dari metode teretentu.

Seorang mikrobiologiwan sebaiknya mampu
memprediksi jumlah sel mikroba dalam suatu
sampel tertentu atau yang disebut dengan cell
density sebelum menganalisanya. Densitas sel
sangat tergantung dari jenis sample. Kemampuan
mengira-ira ini dapat diperoleh dari pengalaman,
membaca atau bahkan bagi yang expert didapat
dari perasaan. Fungsi utama memperkirakan
densitas sel ini adalah untuk menentukan perlu
atau tidaknya dilakukan pengenceran atau untuk
menentukan jumlah sampel yang akan dianalisa.
Keputusan ini adalah sangat penting.

Metoda Hitungan Cawan
hasil yang paling baik adalah antara 30-300
koloni per cawan , ada juga yang
menyebutkan 25-250 koloni per cawan.
Mengapa dipilih range jumlah koloni seperti
itu ?... Hal ini ditujukan untuk meminimalisir
kemungkinan-kemungkinan kesalahan dalam
proses analisa, terutama statistical error.
Untuk lebih jelasnya:
Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30
maka:
solusi : memperbesar ukuran sampel.


Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka :
Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies,
misalnya bakteri A menghambat bakteri B dengan
mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik)
sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya
berada diposisi yang berdekatan.
Perebutan nutrisi/ kompetisi sangat tinggi yang lama-
kelamaan menimbulkan keterbatasan nutrisi.
Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu
lebih besar sehingga mengaburkan jumlah
sebenarnya karena dua koloni yang bergabung tetap
dihitung satu koloni.
Memperbesar kemungkinan kesalahan (human error)
dalam menghitung koloni
Solusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan.

Kisaran 30-300 koloni ini dijadikan titik tumpu
dalam menentukan semua faktor yang
mempengaruhi hasil akhir ini, seperti berapa
ukuran sampel yang harus dianalisa dan metode
apakah yang cocok untuk sampel tersebut.
Disarankan sebelum menghitung atau
menganalisa yang sebenarnya, dilakukan
perkiraan (analisa pendahuluan) terlebih dahulu
dengan mencoba memplatingnya pada ukuran
sampel atau pengenceran yang berbeda-beda.

Berbagai metode umum untuk uji enumerasi
bakteri yang ditanamkan dalam cawan petri
antara lain:
Plate count dengan teknik penanaman
spread plate dan pour plate
Membrane filtration
Pemilihan metode yang benar tergantung
kepada : Kisaran Hitung

Hitungan cawan adalah bila sel mikrobe
yang masih hidup ditumbuhkan pada medium,
maka mikrobe tersebut akan berkembangbiak
dan membentuk koloni yang dapat dilihat
langsung.
Metode hitungan cawan dibedakan menjadi dua
metode tuang dan metode permukaan.
Metode tuang yaitu sejumlah sampel (1 ml atau
0,1 ml) dari pengenceran yang dikehendaki
dimasukan dalam cawan petri, kemudian
ditambah agar-agar cair steril ang telah
didinginkan (47-50
0
C) sebanyak 15-20 ml.dan
digoyangkan supaya sampelnya menyebar.

Pada pemupukan dengan metode permukaan,
terlebih dahulu di buat agar cawan kemudian
sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan
dipipet pada permukaan agar-agar tersebut.
Kemudian diratakan denngan batang gelas
melengkung yang steril. Jumlah koloni dalam
sampel dapat dihitung sebagai berikut :
Koloni per ml atau per gram = Jumlah hitungan
x faktor pengenceran (1/pegenceran)
Keuntungan metode hitungan cawan adalah:
1. hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung
2. beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus
3. dapt digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena
kolni yang terabentuk mungkin berasal dari mikroba yang
mempunyai penampakkan fisik.

Kelemahan metode hitungan cawan adalah :
1. hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang
sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin
membentuk koloni
2. medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin
menghasilkan jumlah yang berbeda pula
3. mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium
padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas, tidak menyebar
4. membutuhkan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama
sehingga pertumbuhan koloni dapat di hitung
Tugas
Apa prinsip metoda hitungan cawan
Langkah-langkah Metode cawan?
Langkah-langkah metodaSpread plate dan Pour
Plate ditulis dengan kertas bukan di ketik.
Kenapa yang diakui jumlah koloni hanya 30 300
Apa prinsip hitungan MPN, langkah MPN, tabel
hitugan MPN
Apa prinsip perhitunganmikroskopis,
langkah2nya,Apa dan gambarkan objek gelas
untukmenghitung dg mikrosopis
Most probable numbre
Untuk metode MPN (Most probable numbre)
digunakan medium cair dalam wadah berupa tabung
reaksi, perhitungan di lakukan berdasarkan jumlah
tabung yang positif yaitu tabung yang mengalami
perubahan pada mediumnya baik itu berupa
perubahan warna atau terbentuknya gelembung gas
pada dasar tabung durham, sesuai dengan jenis bakteri
yang akan di amati. Pada metode perhitungan MPN ini
digunakan bentuk tiga seri pengenceran, yang pertama
10-1, 10-2, dan 10-3. Kemudian dari hasil perubahan
tersebut dicari nilai MPNnya pada tabel nilai MPN
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN
adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth
unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming
unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai
MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah
individu bakteri. Satuan yang digunakan,
umumnya per 100 mL/gram/\.
Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak
3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok.
Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan
jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media
pada tabung adalah Lactose Broth


Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi
jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap
serinya setelah diinkubasi
Jumlah Perkiraan Terdekat (Metode MPN)
Uji Penduga
1. Diinokulasikan 5 ml sampel ke dalam 5 tabung
medium LB seri ganda
2. Diinokulasikan 5 ml sampel ke dalam 5 tabung
medium LB seri
tunggal
3. Diinokulasikan 0,1 ml sampel ke dalam 5 tabung
medium LB seri tunggal
4. Diinkubasikan semua tabung pada suhu 35oc selama
24 jam. Bila ada asam dan gas dinyatakan positif.
5. Dicatat hasilnya dan dihitung dengan tabel MP
Lihat Tabel

Metode counting Cell
Metode Counting Cell adalah metode
perhitungan sel bakteri dengan cara
menghitung langsung sampel yang menjadi
objek perhitungan secara mikroskopis (
dibawah mikroskop).

Langkah langkah yang harus dilakukan dalam
perhitungan bakteri dengan cara penghitungan
langsung sel bakteri (Counting Cell) adalah :
Permukaan counting cell dan kaca penutup
dibersihkan dengan tissue.
Lakukan persiapan pengenceran :
alarutan pengenceran disiapkan dan disusun
berderet
b.tulis pada tabung dengan urutan pengenceran
10-1 10-3 sesuai dengan perkiraan jumlah
bakteri.

c.suspensi dikocok baik-baik sampai kekeruhan
rata. Lalu secara aseptik diambil 10 ml sampel
(campuran sampel sudah ditambah dengan
larutan fisologis NaCl 0,9%) dari tabung
pengencer dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi ini merupakan pengenceran 10-1.
d. Secara aseptik 1 ml sampel diambil dari
pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi yang sudah berisi 9 ml larutan
fisiologil sehingga menjadi pengenceran 10-2,
demkian juga hal yang sama untuk pengenceran
10-3

Secara aseptik sampel diambil dari pengenceran 10-1
sebanyak 1 ml dan diletakkan diatas permukaan
countinf cell, dan ditutup dengan penutup, diusahakan
agar permukaan hitung penuh olehsampel, sehingga
jika ditutup tidak menimbulkan gelembung udara.
counting cell diletakkan pad amikroskop , kemudiaan
diamati dengan pembesaran objektif berkekuatan
rendah dan di hitung jumlah sel yang terdapat dalam
kotak-kotak counting cell (1000 kotak) x volme sampel
(1ml) x faktor pengenceran sampel.

Keuntunagn
Jumlah bakteri yang ada pada sampel dapat
terhitung dengan jumlah yang pasti.
Dengan pengamatan langsung bakteri dapat
dikelompokkan berdasarkan bentuk dan warna.
Kerugian
Memerlukan waktu yang lama dalam menghitung
bakteri karena dilakukan secara manual.
Memerlukan ketelitian dalam mengelompokkan
bakteri.

Cara Hitungan Mikroskopik

Metode Petroff-Hausser
Dalam metode ini, perhitungan mikroskopik di lakukan
dengan pertolongan kotak-kotak skala, dimana di
dalam setiap ukuran, skala yang seluas 1 mm
2
terdapat
25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm
2
, dan setiap
kotak besar terdiri dari 16 kotak-kotak kecil. Tinggi
sampel yang terletak di antara kaca benda dan kaca
penutup adalah 0,02 mm. jumlah sel dalam beberapa
kotak besar dapat dihitung, kemudian di hitung jumlah
sel rata-rata dalam kotak besar. Jumlah sel per sampel
dapat di hitung sebagai berikut:
Jumlah sel per ml sampel = jumlah sel per
kotak besar x 25 kotak x 1 /
0,02 x 10
3
Jumlah sel / cm
3
(ml)
Jumlah sel per ml sampel = jumlah sel per
kotak besar x 25 x 50 x 10
3
Jumlah sel per ml sampel = jumlah sel per
kotak besar x 1,25 x 10
6



Misalnya : Didapat jumlah mikrobe yang mau di hitung 12 sel
mikrobe, maka jumlah sel per ml sampel adalah : 12 x 1,25 x 10
6
=
1,5 x 10
7
sel/ml.
Keuntungan hitungan ini adalah metode yang cepat dan
murah, tetapi mempunyai kelemahan sebagai berikut :
sel-sel mikrobe yang telah mati tidak dapat di bedakan dari sel ang
masih hidup. Karena itu keduanya terhitung.
sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat dibawah mikroskap,
sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung.
untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel didalam suspensi harus
cukup tinggi, minimal untuk bakteri 10
6
sel/ml. hal ini disebabkan
dalam setiap bidang pandang yang di amati harus terdapat
sejumlah sel yang dapat dihitung.
tidak dapt digunakan untuk menghitung sel mikrobe di dalam
bahan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan,
kaena hal tersebut akan mengganggu dalam perhitungan sel.

Tehnik molekuler DNA !6 S
Merupakan tehnik terbaru untuk menentukan
spesies mikroorganisme
Sekuen gen 16S rDNA dari mikroorganisme
yang baru ditemukan dapat dibandingkan
dengan pustaka sekuen 16S rDNA dari
mikroorganisme lain melalui program
pelacakan Database Basic Local Aligment
Search Tool (BLAST)

Tahap analisis DNA
Isolasi DNAhewan yang akan diteliti
Reaksi Polimerisasi Berantai Polimer chain
reaction (PCR)
Elektroforesis dan Pengamatan Hasil PCR
Purifikasi Gel Elektroforesis
Sekuensing dan Analisis BLAST
http://www/ncbi.nlm.nih.gov/.
Lihat Hasil



Tugas minggu depan
Cri salah satu metoda dalam mikrobiologi,
tuliskan langkah2 pekerjaanya,sebutkan
keuntungan dan kerugiannya
Buat 10 soal kuliah kedua, objekctif pilihan 4 a
b c d