Dewan Asisten Biokima 2009 1

Disusun oleh
Dewan Asisten Biokimia Pendidikan Dokter 2009

Reagen Resadita
Yogik Onky S. W
M. Aprianto
Dwi Jatmiko
M. Rezqa Kalifa
Rasita
Qistira
Medischa Roza
Nunik Fatmawati
Ditya Dewi
Rima Astari
Dwi Utari Pratiwi
Richa


Dewan Asisten Biokima 2009 2
KUMPULAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Blok 2.6
A. CALCIUM SERUM
Prinsip reaksi:
- Serum darah + ammonium oksalatkalsium
oksalat (endapan putih)
- Kalsium oksalat + asam sulfatasam oksalat bebas
- Asam oksalat bebas +kalium permanganate
(titrasi)karbon dioksida dan air
Kalsium serum diendapkan dengan penambahan
Ammonium Oksalat, yang kemudian kalsium dititrasi
dengan Kalium permanganat (titrasi permanganometri)
dalam suasana asam.

Reaksi :
- Ca
2
+ +C
2
04
2
- CaC
2
O
4

- CaC
2
O
4
+ H
2
SO4 Ca
S
O
4
+ H
2
C
2
O
4

- H
2
C
2
O
4
+ On H
2
0
2
+ CO
2


Fungsi reagen dan perlakuan :
- Serum :substrat, sumber Ca2+
- Akuades : pengencer, denaturasi protein serum
- Ammonium oksalat : donor oksalat yang akan
berikatan dg Ca2+
- Asam sulfat : pemberi suasana asam,
membebaskan Ca2+ dari ikatan protein, donor
proton dan oksidator
- Ammonia : mencuci dan memurnikan oksalat
- Kalium permanganate : reduktor, zat titrasi,
donor MnO
-

- Sentrifugasi : memisahkan filtrate dan
presipitatnya
- Vortex : meratakan campuran
- Titrasi : mengukur kadar Ca2+, mengetahui nilai
standar titik setimbang

Procedur :
1. Tabung reaksi = serum 2 ml + akuades 2 ml
Campur
2. Tambahkan Amm. Oxalat 1 ml
3. Inkubasi 10 mnt
4. Sentrifus 10 menit buang supernatan
5. Cuci pinggir tabung dengan 3 ml Ammonia 2%
6. Sentrifuse lagi buang supernatan
7. Tambahkan asam sulfat 2 ml
8. Titrasi dengan permanganat pada suhu 80
o
C

Rumus
= (a-b) x 0.2 x 100 Kadar kalsium (mg/dL)
2
a = volume k-permanganat yang dibutuhkan
b = blanko
Dimana 1 ml 0.01 N K-permanganate setara dengan 0.2
mg ca







Dewan Asisten Biokima 2009 3
B. MDA (MALONDIALDEHYDE)
PRINSIP
MDA dalam plasma akan direaksikan dengan TBA
(thiobarbituric acid) pada kondisi asam, sehingga
terbentuk kompleks TBA
2
MDA
Kemudian diekstraksi dengan reagen Butanol, lalu
dibaca absorbansinya pada panjang gelombang
510, 532, 560 nm
PROSEDUR
1. Sampel 1 ml + reagen TBA 4 ml, lalu vortex.
Waktu praktikum direduksi jadi 0,5 ml sampel+2ml
TBA
2. Inkubasi pada suhu 90C selama 80 menit
reduksi 40 menit
3. Dinginkan dengan es 10 menit 5 menit
4. Tambahkan 4 ml larutan ekstraksi Butanol, lalu
vortex 2 ml Butanol
5. Sentrifugasi 3000 g selama 15 menit
6. Ambil supernatant dan baca absorbansi pada 510,
532 dan 560 nm
7. Tentukan juga absorbansi blanko (aquabidest) dan
standar MDA (1.1,3.3-tetramethoxypropane 10
mol/L)
FUNGSI REAGEN & PERLAKUAN
Plasma: sampel yang diuji
Reagen TBA, terdiri dari:
Asam asetat + NaOH: sebagai buffer (pH=3,5)
SDS (Sodium Duodesil Sulfat): sebagai
emulgator (memutus ikatan kompleks MDA
protein)
TBA: membentuk kompleks warna dengan
MDA (konjugat MDA)
Aquabidest: pelarut
Reagen Butanol, dengan perbandingan:
N-butanol : aquabidest : pyridine = 15 : 3 : 1
Fungsi memisahkan atau mengekstraksi MDA
dari senyawa-senyawa lain / melarutkan MDA
1.1,3.3-tetramethoxypropane: sebagai larutan
standar
Aquabidest: sebagai blanko
Vortex: homogenisasi larutan
Sentrifugasi: memisahkan larutan berdasarkan
perbedaan berat molekul
Inkubasi 90C: optimalisasi reaksi
Pendinginan: menghentikan reaksi
Spektrofotometri pada =530, 532, 560 nm:
pembacaan absorbansi. Karena TBA tidak bersifat
spesifik (tidak hanya berikatan dengan MDA) maka
digunakan 3 panjang gelombang untuk
mengeksklusi ikatan TBA dengan senyawa lainnya.
PERHITUNGAN
Setelah didapatkan nilai absorbansi dari pembacaan
spektrofotometer, hitung terlebih dahulu actual
absorbance (act.A) dari sampel, standar dan blanko.
act.A532 = 1,22 [(A532) (0,56) (A510) + (0,44)
(A560)]
Kemudian, hitung:
Kadar MDA = 10 mol/L

INTERPRETASI
< 0 mol/L invalid
0 2 mol/L normal




Dewan Asisten Biokima 2009 4
C. Praktikum Vitamin E
Prinsip
Ekstraksi vitamin E dari serum dengan xylene, kemudian direaksikan mereduksi Fe
3+
menjadi Fe
2+
,
membentuk kompleks warna Fe
2+
-TPTZ yang dibaca pada spektofotometri =520 nm.
Pada proses ekstraksi, dapat terambil senyawa pengganggu, beta-carotene, yang dapat bereaksi dengan
TPTZ membentuk kompleks warna yang dapat dibaca pada spektofotometri =460 nm.
Kemampuan vitamin E mereduksi Fe
3+
menjadi Fe
2+
disebut FRAP (ferric reduction antioxidant power).
Prosedur
Blanko Standar Sampel
Ethanol 1,0 mL - 1,0 mL
Serum - - 1,0 mL
Tambahkan serum secara perlahan, sambil diguncang
untuk memperoleh presipitat protein yang baik.
Akuades 1,0 mL 1,0 mL -
Working standard - 1,0 mL -
Xylene 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Tutup tabung, kocok dengan kuat selama 30 detik
Sentrifugasi selama 5 menit, kecepatan RCF 350-450?
Siapkan 3 cuvet
Supernatan 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
TPTZ 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Spektofotometri =460 nm
FeCl
3
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL
Spektofotometri =600 nm

Fungsi reagen dan perlakuan
Ethanol Pelarut organik nonpolar
Serum Sumber vitamin E yang akan diukur
Akuades Pengencer
Working standard
alfa-tocopherol
Pembanding perhitungan dengan konsentrasi yang diketahui, yakni 1 mg/dL
Xylene Mengekstraksi vitamin E
TPTZ Chromogen (2,4,6-tripyridil-s-triazine) yang berikatan dengan Fe
2+

membentuk kompleks warna merah.
FeCl
3
Sumber Fe
3+
yang akan direduksi vitamin E
Dikocok dengan kuat Mencampur lapisan-lapisan yang terdapat dalam tabung
Dewan Asisten Biokima 2009 5
Sentrifugasi Memisahkan komponen larutan berdasarkan berat molekul atau sifat
polar/nonpolarnya, dengan yang bersifat polar cenderung berada di sebelah
bawah.
Spektofotometri
=460 nm
Membaca absorbansi senyawa pengganggu (beta-carotene)
Spektofotometri
=600 nm
Membaca absorbansi vitamin E total

Perhitungan
Kadar vitamin E =
(A sp520 A bl520) - 0,40(A sp460 A bl460)
A st520 A bl520
X [standar] 1 mg/dL

Interpretasi
Normal: 0,83 1,54 mg/dL