PENGHAMBATAN APOPTOSIS SEL HATI MENCIT (Mus musculus) TERINFEKSI

Plasmodium berghei MELALUI EKSPRESI TNF- MENGGUNAKAN EKSTRAK

GAMBIR LAUT (Clerodendrum ineme)
1. Target Luara
Ini merupaka penelitian dalam skala laboratorium yang memiliki target utama untuk
mengetahui apakah Ekstrak daun Gambir Laut (Clerodendrum ineme) berpengaruh terhadap sel
hati mencit (Mus musculus) yang terinfeksi Plasmodium berghei melalui ekspresi TNF-!
mengingat salah satu tanaman tradisional yang digunakan sebagai obat adalah Gambir Laut"
#asil dari penelitian ini di harapkan dapat men$adi bahan informasi untuk masyarakat luas
sebagai obat anti malaria"
!. Met"#e
%enelitian ini di lakukan dengan metode eksperimental laboratorium yaitu dengan melakukan
percobaan di laboratorium dengan mengikuti prosedur ker$a yang sudah ada"
Tahapan pelaksanaan penelitian diuraikan sebagai berikut &
!.1 Ta$a% %er&'a%a
'b$ek percobaan yang digunakan adalah () mencit $antan dengan umur * bulan dengan berat
*+-,-gr yang sehat yaitu tampak dari luar dengan bulu yang mengkilat dan fertile" %enelitian ini
menggunakan .ancangan acak lengkap dengan ) perlakuan dan , kali ulangan" #asil
pengamatan terhadap ekspresi TNF-! akan di analisis secara deskriptif"
!.! A(at #a )a$a &
/lat & neraca analitik! gelas ukur! kompor! panci untuk rebusan! sendok pengaduk!
termometer! 0adah pengurung mencit! /lat suntik! kaca ob$ek! slide gores! lemari pendingin! alat
sonde! pipet 1olum! handcounter! panggangan sate! papan bedah! dissecting set! roll film (0adah
untuk fiksasi organ)! incubator! mikrotom! co1er glass! gelas ob$ek! mikroskop 'lympus 23-(
dan kamera digital"
2ahan & ekstrak rebusan dari tanaman gambir laut dengan beberapa pengenceran ((+ gr4(++
ml5 ( gr4(++ ml5 +!( gr4(++ ml dan +!+( gr4(++ ml)! Plasmodium berghei, he0an u$i berupa
mencit $antan! pakan mencit! alcei1er! pe0arna giemsa! minyak imersi! alkohol! metanol! a6ua
destilata! /luminium foil! tissue! kapas! kloroform! alkohol bertingkat -+7! 8+7! 9+7! :+7! dan
(++7! formalin ;7! <ylol I! <ylol II! paraffin! /%! albumin gliserin! %2= (phosphate buffer
saline)! minyak imersi! #*'*! dan TNF- "
!.* Lag+a$ Ker,a &
!.*.1 Pe-)uata E+&tra+ Ga-)'r Laut
Gambir laut diambil dan ditimbang sebanyak *++ gram" >i cuci bersih dan dimasukan ke
dalam 0adah rebusan yang telah terdapat a6uadest sebanyak *+++ ml dan diletakan pada
kompor! didihkan hingga mencapai (++?@ dan diteruskan selama ,+ menit! ekstrak dibiarkan
dingin kemudian disaring menggunakan kain flanel"
!.*.! Peg'.e+&'a Plasmodium berghei %a#a -e/'t #""r
Antuk penginfeksian mencit donor! diambil darah mencit terinfeksi P. berghei dan
ditambahkan alcei1er ((&,)! dibiarkan beberapa saat kemudian diin$eksi sebanyak *++ l ke
mencit secara intraperitonial" =elan$utnya diamati persen parasitemia" =etelah persen parasitemia
mencapai B*+7! dilakukan pembedahan untuk mengambil darah mencit yang terinfeksi P.
berghei dari $antung"
!.*.* Ke("-%"+ Per(a+ua
Cencit coba dibagi atas * kelompok yaitu kelompok perlakuan dan kelompok control
negatif" Delompok perlakuan terdiri dari ) kelompok untuk masing-masing dosis yaitu (+ gr4(++
ml! ( gr4(++ ml! +!( gr4(++ ml dan +!+( gr4(++ ml! control (E) dan control (-)" Tiap dosis terdiri
dari , ekor mencit (, replikasi)"

!.*.0 I.e+&' Plasmodium berghei %a#a -e/'t u,'
Plasmodium berghei diinfeksikan pada mencit u$i dan mencit kontrol secara intraperitoneal
dengan dosis sebanyak +!* ml darah terinfeksi P. berghei dari mencit donor" Cencit yang di
gunakan adalah mencit putih $antan! berumur *-, bulan dengan berat badan antara *+-,+ gr"

!.*.1 Pegu,'a %"te&' at' -a(ar'a
=etelah tingkat parasitemia pada mencit u$i telah mencapai ( 7! maka dilakukan pengu$ian
potensi antimalaria dari ekstrak air gambir laut" =etiap kelompok u$i diberikan suspensi ekstrak
secara oral" %emberian ekstrak dilakukan selama ; hari berturut-turut dan pengamatan tingkat
parasitemia dilakukan sampai hari ke )" >osis pemberian yang diberikan sesuai dengan berat
mencit"
!.*.1 Pre%ara&' U(a& 2ara$
%embuatan ulas darah dilakukan dengan cara pengambilan darah dari ekor mencit kemudian
diteteskan pada gelas ob$ek pertama dengan posisi mendatar" Gelas obyek lain ditempatkan pada
bagian darah tadi dengan posisi membentuk sudut ;-
o
sehingga darah menyebar sepan$ang garis
kontak antar kedua gelas obyek" =elan$utnya gelas obyek didorong ke arah depan dengan cepat
hingga terbentuk usapan darah tipis di atas gelas obyek" Alas darah tersebut dikeringkan di udara
kemudian difiksasi dengan mengunakan metanol selama - menit lalu ditetesi dengan pe0arnaan
giemsa sampai penutupi pemukaan usapan darah selam ;- menit" =elan$utnya dicuci dengan air
mengalir pada posisi miring dan dikeringkan di udara" =etelah itu setiap kelompok perlakuan
kemudian diamati parasitemia di ba0ah mikroskop dengan menggunakan minyak emersi dengan
pembesaran (+++<"
*. Pega-ata E+&%re&' TNF-
*.1 Pe-)uata Pre%arat $'&t"("g' Hat'
%reparasi $aringan dilakukan dengan prosedur menurut Durniadi (*++9)&
#ati yang telah difiksasi dengan formalin ;7! di cuci dengan a6uades selama - menit!
dehidrasi dalam alkohol bertingkat -+7! 8+7! 9+7! :+7! dan (++7 masing-masing
selama - menit"
=isa alkohol di bersihkan dengan proses clearing" %ankreas direndam dalam <ylol I dan
<ylol II masing-masing selama - menit"
%roses infiltrasi! organ pankreas di masukkan dalam paraffin I! paraffin II! dan paraffin III
)+7 masing-masing ;- menit"
%roses embedding atau penanaman! pankreas di masukkan dalam kotak paraffin selama
(- menit" Demudian dilakukan sectioning melalui pendiaman dalam blok paraffin selama
beberapa saat kemudian letakkan pada hot plate dengan suhu ;+
+
@ yang bertu$uan untuk
merentangkan hasil irisan dan melelehkan paraffin pada gelas ob$ek"
*.! Pega-ata E+&%re&' TNF-
%engamatan ekspresi TNF- dilakukan dengan metode pengecatan immunohistokimia
menurut Larasati (*++8) dalam Louhenapessy (*+(()&
%reparat histologi di cuci dengan %2= (phosphate buffer saline) p# 8!; selama , menit"
%enghilangan perioksida endogen menggunakan #*'* ,7 selama *+ menit" Demudian
preparat di cuci kembali dengan %2= selama , menit! sebanyak , kali"
2loking! preparat di tetesi antibody primer TNF-! kemudian di inkubasi pada suhu ;+
+
@
selama ( malam" =etelah itu preparat di cuci kembali dengan %2= selam , menit!
sebanyak , kali"
%reparat di tetesi anti bodi sekunder berlabel /% (alkaline phosphate) ( & *-++ (anti lgG
/% Labelled)! di inkubasi pada suhu ruangan selama ( $am" %encuci dengan %2= p# 8!;
selama , menit! sebanyak , kali"
%reparat di tetesi dengan peroksidase =/-#.% (strep a1idin hesoradish pero<ide) dan
inkubasi pada suhu ruangan selama )+ menit" Demudian preparat di cuci dengan %2=
selam , menit! sebanyak , kali"
%emberian chromogen dengan menetesi larutan ,!,-diaminobenFidine (>/2)! dan di
inkubasi pada suhu ruangan selama *+ menit kemudian di cuci dengan a6uades selama -
menit! sebanyak , kali"
@ounterstain! menggunakan hematoksilin" >iinkubasi pada suhu ruangan selama *+
menit" Demudian tetesi dengan air ! di cuci dengan a6uades selama - menit! sebanyak ,
kali"
>ehidrasi dilakukan dengan larutan alcohol bertingkat 8+7! 9+7! :+7 dan (++7 serta
alkohol absolute Idan II masing-masing selama ( menit"
@learing dilakukan dengan <ylol I dan II masing-masing selama , menit! kemudian
preparat di angin-anginkan"
Counting dilakukan dengan menggunakan etillen! lalu di tutup dengan gelas"
'b$ek! di beri label nama preparat kemudian di amati di ba0ah mikroskop"
Gika TNF- terdeteksi maka sel hati akan ber0arna coklat"
0. Ke-a,ua Pe+er,aa
%enelitian yang sampai saat ini di lakukan sudah sampai pada tahap perhitungan persen
parasitemia mencit yang berfungsi untuk menentukan positif atau tidaknya seekor mencit setelah
diinfeksikan melalui intraperitonial sel darah merah yang terinfeksi Plasmodium begrei /ND/"
=elain itu $uga untuk mengetahui berapa pesen parasitemia mencit tersebut" %ada tahapan
berikutnya akan di lakukan preparasi organ hati untuk mengetahui pengaruh ekstrak Gambir laut
terhadap perbaikan organ sel hati yang rusak! dalam penelitian ini yang digunakan adalah
antibody TNF- Darena keterbatasan alat untuk pe0arnaan organ hati dan antibody maka sampel
tersebut di kirim ke Ani1ersitas 2ra0i$aya Calang untuk seln$utnya di lakukan preparasi"
1. Keter/a%a'a Target Luara
2erdasarkan target luaran yang telah di $elaskan sebelumnya! target penelitian ini telah
tercapai sebesar 9+7" =aat ini hanya menunggu hasil dari preparasi organ hati untuk mengetahui
bagaimana pengaruh ekstrak gambir laut terhadap perbaikan organ hati yang rusak"
3. Per-a&a(a$a #a Pe4e(e&a'a4a
3.1 /dministratif H
3.! Teknis
permasalahan & kurang memadainya peralatan dalam Laboratorium sehingga pe0arnaan organ
hati dengan antibody tidak dapat di ker$akan di Lab" Ioology F-CI%/ /mbon"
%enyelesaian & untuk mendapatkan hasil yang maksimal maka sampel tersebut di kirim ke
Ani1ersitas 2ra0i$aya Calang untuk selan$utnya di lakukan preparasi"
3.* 'rganisasi %elaksana
%ermasalahan & sulit untuk mengkoordinasi anggota yang beda dengan angkatan karena berbda
kelas dan berbeda $ad0al"
%enyelesaian & pengumpulan $ad0al kuliah dan kegiatan yang kemudian di buatkan $ad0al
koordinasi untuk membahas penelitian serta pembagian tugas penger$aan
3.0 Deuangan
%ermasalahan & masalah yang timbul terkait dengan keuangan adalah pelaksaaan yang sempat
tersendat untuk keperluan membei beberapa peralatan kebutuhan penelitian
tahap satu"
%enyelesaian & kami mengeluarkan dana pribadi untuk membeli beberapa peralaran penting dan
mendasar terlebih dahulu! kemudian dana tersebut akan dig anti ketika kami
menerima dana yang sesuai pada proposal"
5. Pegguaa B'a4a
.ekapitulasi dana yang diusulkan
N". A(at #a Ba$a B'a4a (R%) Keteraga
( /lkohol ,+ 7! -+ 7! 8+ 7! 9+ 7! :+ 7! (++ 7 *-:"+++!- 2ahan habis
pakai /lbumin Gliserin *,+"+++!-
/ntibodi TNF- (",;-"+++!-
/ntibodi sekunder berlabel 2iotin ("(+,"+++!-
@hloroform *8)":++!-
>/2 (,!, diaminobenFidine) *8+"+++!-
Etellan *+-"+++!-
Formalin ;7 (-+"+++!-
F2= *,8"+++!-
#ematoksilin *:8"+++!-
#*'* , 7 (98"+++!-
Cencit ((9 ekor E 6 reserve) )8+"+++!-
%araffin I! II! III *-+"+++!-
%2= (%hosphate 2uffer =aline) *;-"+++!-
%eroksidase Strep Avidin-Hesoradish Peroxidase) *8-"+++!-
%akan mencit (,+ kg) ,-+"+++!-
=teril /6uades *-+"+++!-
3ylol I! II! III *)-"+++!-
>aun Gambir laut -+"+++!-
T"ta( 3.610.6778-
* 2uku pedoman ,++"+++!- %enun$ang
%DC
%enggunaan Internet (++"+++!-
T"ta( 077.7778-
, Dertas /; (* rim) :8"+++!- /TD
penelitian
dan laporan
hasil
Tinta refill (2lack E Tri @olor) *--"+++!-
%en$ilidan *-+"+++!-
T"ta( 37!.7778-
0 /luminium Foil *-"-++!-
/ntiseptic #and ,-"+++!-
Cencit >rink 2ottle (-+"+++!-
%embuatan Dandang Cencit ,-+"-++!-
=urgical 'peration e6uipment (( =et) -++"+++!-
=urgical Glo1es (=arung Tangan =teril) 8-"-++!-
=urgical Casker -+"+++!-
=ekam %adi (-+ kg) *-+"+++!-
Tissue .oll *8"+++!-
@otton .oll ;-"+++!-
Garum oral 4 Garum sonde ,++!+++
T"ta( 1.979.1778-
1 Pe4e:aa te-%at #a %era(ata La)"rat"r'u- 177.777
3 Pu)('+a&' #a &e-'ar 1.777.777
5 Per(eg+a%a Ta-)a$a 177.777
T"ta( 1;!;*;0;1;3;5 11.5!1.0778-
2aa 4ag #' #a%at Ta$a% 1 (07<) = R%. 0.017.7778-
9. 2"+u-eta&' Keg'ata Pee('t'a
%enyiapan sampel daun gambir laut serta %embuatan ekstrak
%embedaan mencit donor untuk mengambil darah terinfeksi Plasmodium berghei /ND/ dan
penginfeksian Plasmodium beghai /ND/ pada mencit u$i
%emberian ekstrak air gambri laut pada mencit terinfeksi Plasmodium berghei
%engambilan sampel darah dan organ hati
%engu$ian kadar =G%T