Anda di halaman 1dari 7

Outline Eksperimental

Pendahuluan
Gambar di bawah ini mengilustrasikan langkah-langkah dasar yang diperlukan untuk
memurnikan DNA genom dari sampel darah dengan menggunakan ChargeSwitchgDNA
Blood Kit.








Mengisolasi DNA genom 10-20 l Darah Sampel

1. Pendahuluan
Bagian ini menyediakan pedoman dan petunjuk untuk mengisolasi DNA
genom dari 10-20 l sampel darah manusia. Perlu dicatat bahwa protokol ini
dioptimalkan untuk pemurnian DNA yang efisien dari volume sampel tersebut. Jika
Anda ingin mengisolasi DNA genomik dari 50-100 l sampel darah manusia

2. Mulai Material
Gunakan prosedur ini untuk mengisolasi DNA genom dari sampel darah manusia
yang telah diperlakukan sebagai berikut:
Volume: 10-20 l darah manusia
Perlakuan: Diberikan EDTA- atau sitrat
Kondisi sempel: Segar atau beku

3. Bahan Dibutuhkan
Bahan-bahan berikut di persiapkan sebelum memulai:
Sampel darah (s)
MagnaRack (Katalog no. CS15000) atau 96-Magnetic Separator (Katalog
no. CS15096)
Steril 1,5 ml tabung microcentrifuge
96 x 2 ml dalam piring dengan baik (jika sampel pengolahan di96-Magnetic
Separator)
96 x 300 ml piring mikrotiter U-dipercaya (jika pengolahan
sampel dalam format 96-well)
Vortex mixer
Tips pipet steril (20 ml, 200 ml, dan 1 ml)
Komponen Disediakan dengan Kit
ChargeSwitchLisis Buffer (L12)
Proteinase K
ChargeSwitchBeads Magnetic
ChargeSwitchPemurnian Buffer (N5)
ChargeSwitchCuci Buffer (W12)
ChargeSwitchElusi Buffer (E5) atau TE Buffer (tidak disediakan; 10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,5)

4. Sebelum Mulai
Lakukan langkah-langkah berikut sebelum memulai:
a. Siapkan Lisis Mix: Untuk setiap sampel, campurkan 0,5 ml ChargeSwitch
Lisis Buffer (L12) dan 5 l Proteinase K untuk mempersiapkan Lisis Mix. Jika
Anda mengisolasi DNA dari beberapa sampel, Anda mungkin dapat
meningkatkan volume reagen yang digunakan dan mempersiapkan master Lisis
Mix.
b. Vortex tabung yang berisi ChargeSwitch Magnetic Beads untuk meresuspend
secara penuh dan mendistribusikan beads secara merata dalam buffer
penyimpanan.
c. Siapkan Pemurnian Mix: Untuk setiap sampel, campuran 20 l ChargeSwitch
Beads Magnetic (sepenuhnya disuspensi, lihat atas) dan 100 l ChargeSwitch
Pemurnian Buffer (N5) untuk mempersiapkan Pemurnian Mix. Jika Anda
mengisolasi DNA dari beberapa sampel, Anda mungkin meningkatkan yang
volume reagen yang digunakan dan mempersiapkan master Pemurnian Mix.

5. Mempersiapkan Lisat
Ikuti prosedur di bawah untuk mempersiapkan lisat dari 10-20 ul sampel darah.
1 Transfer sampel darah 10-20 l ke tabung microcentrifuge steril (atau piring dengan
baik 96 x 2 ml dalam).
2 Tambahkan 0,5 ml Lisis Mix (lihat di atas) untuk sampel dan pipet atas dan ke
bawah dengan lembut 5 kali untuk campuran.
Penting: Gunakan 1 ml ujung pipet set ke 450 ml untuk mencampur sampel.
Pastikan bahwa ujung terendam, dan pipet atas dan ke bawah lembut untuk
menghindari membentuk gelembung.
3 Inkubasi sampel pada suhu kamar selama 10 menit atau sampai sampel jelas dengan
tidak ada benjolan yang terlihat.
4. Lanjutkan ke DNA Binding, halaman berikutnya.

6. Mengikat DNA
Ikuti prosedur berikut untuk mengikat DNA ke ChargeSwitch Magnetic Beads.
a. Ambil dan keluarkan kembali menggunakan pipet secara perlahan campuran
pemurnian (Purification mix) yang mengandung ChargeSwitch Magnetic Beads
untuk mensuspensikan beads secara penuh
b. Tambahkan 120 l campuran pemurnian (purification mix) ke sampel tercerna
(digested sample) lalu ambil dan keluarkan kembali menggunakan pipet secara
perlahan sebanyak 5 kali agar tercampur
c. Inkubasi pada suhu ruangan selama 1 menit agar DNA terikat pada ChargeSwitch
Magnetic Beads
d. Tempatkan sampel pada MagnaRack (atau 96-well Magnetic Separator jika
menggunakan 96-well deep plate) selama 1 menit atau sampai terbentuk tight
pellet
e. Tanpa memindahkan sampel dari MagnaRack, pindahkan secara hati-hati bagian
supernatan lalu dibuang. Jangan mengganggu pellet of beads dengan cara
memiringkan pipet sehingga tip pipet berada di posisi agak jauh dari pellet

f. Pindahkan sampel yang mengandung pellet magnetic beads dari MagnaRack.
Tidak boleh ada supernatan di tube tersebut.
g. Tambahkan 500 l ChargeSwitch Lysis Buffer (tanpa Proteinase K) ke tube lalu
ambil dan keluarkan menggunakan pipet secara perlahan sebanyak 3 kali untuk
mencampurkan. Gunakan tip pipet 1 ml yang diset menjadi 450 l
h. Tambahkan 50 l ChargeSwitch Purification Buffer lalu ambil dan keluarkan
menggunakan pipet secara perlahan sebanyak 3 kali untuk mencampurkan.
Gunakan tip pipet 1 ml yang diset menjadi 500 l.
i. Inkubasi pada suhu ruangan selama 1 menit
j. Tempatkan sampel di MagnaRack selama 1 menit atau sampai beads membentuk
tight pellet
k. Tanpa memindahkan sampel dari MagnaRack pindahkan secara hati-hati bagian
supernatan lalu dibuang. Jangan mengganggu pellet of beads dengan cara
memiringkan pipet sehingga tip pipet berada di posisi agak jauh dari pellet

l. Segera dilanjut ke proses pencucian DNA (DNA Washing)
7. Pencucian DNA (DNA Washing)
a. Pindahkan sampel yang mengandung pellet magnetic beads dari MagnaRack dan
tidak boleh ada supernatan di tube
b. Tambahkan 500 l ChargeSwitch Wash Buffer ke sampel lalu ambil dan
keluarkan menggunakan pipet secara perlahan sebanyak 2 kali untuk
mensuspensikan ulang magnetic beads.
c. Tempatkan sampel di MagnaRack selama 1 menit atau sampai beads membentuk
tight pellet
d. Tanpa memindahkan sampel dari MagnaRack pindahkan secara hati-hati bagian
supernatan lalu dibuang. Jangan mengganggu pellet of beads dengan cara
memiringkan pipet sehingga tip pipet berada di posisi agak jauh dari pellet

e. Lanjutkan dengan proses elusi DNA
8. Elusi DNA
a. Pindahkan sampel yang mengandung pellet magnetic beads dari MagnaRack.
Tidak boleh ada supernatan di tube
b. Tambahkan 100 l ChargeSwitch Elution Buffer ke sampel lalu ambil dan
keluarkan menggunakan pipet secara perlahan sebanyak 10 kali untuk
mensuspensikan kembali magnetic beads
Penting : Jangan menggunakan air untuk elusi. DNA tidak akan terelusi
dikarenakan buruknya kapasitas air sebagai buffer.
c. Inkubasi pada suhu ruangan selama 1 menit
d. Tempatkan sampel di MagnaRack selama 3 menit atau sampai beads membentuk
tight pellet
e. Tanpa memindahkan tube dari MagnaRack, pindahkan secara hati-hati
supernatan yang mengandung DNA ke tube microcentrifuge steril (atau 96 x
300 l U-bottomed microtiter plate). Jangan mengganggu pellet of beads dengan
cara memiringkan pipet sehingga tip pipet berada di posisi agak jauh dari pellet

f. Buang magnetic beads yang sudah digunakan. Jangan memakai ulang beads.
9. Penyimpanan DNA
Simpan DNA yang sudah dimurnikan pada suhu -20
0
C atau gunakan secara langsung
untuk analisis. Cegah dilakukannya pembekuan & pencairan DNA secara berulang