Anda di halaman 1dari 12

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Kerangka Konsep
















Gambar 3.1 Kerangka Konsep
B. Hipotesis
Berdasarkan tinjuan puskata yang telah disajikan, diajukan
hipotesis yaitu, terdapat peningkatan reaksi imun tikus jantan wistar yang
diinduksi bakteri A.actinomycetemcomitans setelah pemberian ekstrak buah
talok (Muningia calabura L) yang ditunjukkan dengan peningkatan aktivitas
dan kapasitas fagosit makrofag pada latex beads (secara in vitro).
Variabel Terkendali

1) Pembiakan banteri A.actinomycetemcomitans dalam media
gliserin dan dibiakkan sampai konsentrasi 1x10
8
CFU.
2) Tikus jantan galur wistar usia 2 bulan dengan berat badan
180-200 gram.
3) Induksi bakteri pada gingiva bagian anterior mandibula tikus
jantan wistar sebanyak 0,1 ml dengan spuit 1 cc dengan
frekuensi 2 kali sehari selama 2 hari.
4) Makrofag dari cairan peritoneal tikus jantan galur wistar usia 2
bulan dengan berat badan 180 gram.
5) Teknik pengambilan makrofag dari cairan peritoneal tikus
jantan galus wistar menggunakan jarum suntik ukuran 25 gauge
dan spuit injeksi ukuran 10 ml dengan sudut pengambilan
sebesar 30
0
.
6) Teknik kultur makrofag in vitro dalam microplate 24 well
menggunakan medium RPMI.
7) Volume suspensi makrofag sebanyak 200 l (5x10
5
sel) dalam
tiap sumuran.
8) Kondisi in vitro selama inkubasi kultur makrofag dalam
inkubator dengan 5% CO
2
dan suhu 37
0
C.
9) Ukuran latex beads yang digunakan, diameter 3 m.
10) Konsentrasi latex beads sebesar 2,5x10
7
/ml
11) Volume latex beads dalam tiap sumuran sebanyak 200 l.
12) Konsentrasi ekstrak buah talok (Muningia calabura L) sebesar
0,01%, 0,005%, 0,001%.
Variabel Bebas
ekstrak buah talok
(Muningia calabura L).
Variabel Terikat
aktivitas makrofag
terhadap latex beads.
Variabel Tidak Terkendali
1) Kondisi sistemik individual tikus.
2) Respon imun individual tikus.

C. Jenis dan Metode Penelitian
Penelitian yang digunakan adalah laboratorium eksperimental
dengan rancangan percobaan post test only control group design.

D. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di LPPT unit I, unit II, dan unit IV
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
E. Variabel Penelitian
a. Variabel Bebas
Variabel bebas penelitian ini adalah ekstrak buah talok (Muningia
calabura L).
b. Variabel Terikat
Variabel terikat penelitian ini adalah aktivitas makrofag terhadap
latex beads.
c. Variabel terkendali
1) Pembiakan banteri A.actinomycetemcomitans dalam media gliserin dan
dibiakkan sampai konsentrasi 1x10
8
CFU.
2) Tikus jantan galur wistar usia 2 bulan dengan berat badan 180-200
gram.
3) Induksi bakteri pada gingiva bagian anterior mandibula tikus jantan
wistar sebanyak 0,1 ml dengan spuit 1 cc dengan frekuensi 2 kali sehari
selama 2 hari.
4) Makrofag dari cairan peritoneal tikus jantan galur wistar usia 2 bulan
dengan berat badan 180 gram.
5) Teknik pengambilan makrofag dari cairan peritoneal tikus jantan galur
wistar menggunakan jarum suntik ukuran 25 gauge dan spuit injeksi
ukuran 10 ml dengan sudut pengambilan sebesar 30
0
.
6) Teknik kultur makrofag in vitro dalam microplate 24 well menggunakan
medium RPMI.
7) Volume suspensi makrofag sebanyak 200 l (5x10
5
sel) dalam tiap
sumuran.
8) Kondisi in vitro selama inkubasi kultur makrofag dalam inkubator
dengan 5% CO
2
dan suhu 37
0
C.
9) Ukuran latex beads yang digunakan, diameter 3 m.
10) Konsentrasi latex beads sebesar 2,5x10
7
/ml
11) Volume latex beads dalam tiap sumuran sebanyak 200 l.
12) Konsentrasi ekstrak buah talok (Muningia calabura L) sebesar 0,01%,
0,005%, 0,001%.
d. Variabel Tidak Terkendali
1) Kondisi sistemik individual tikus.
2) Respon imun individual tikus.
F. Definisi Operasional
Tabel 3.1 Definisi Operasional
No Variabel Definisi Operasinal Cara Pengukuran Skala
1. Ekstrak buah talok
(Muningia
calabura L)
Sediaan cair buah talok
(Muningia calabura L)
yang dibuat dengan
teknik maserasi dan
pelarut akuades.
Konsentrasi
ekstrak 0,01%,
0,005%,
0,001%
ratio
2. Makrofag Sel fagosit besar berinti
bulat.
Pewarnaan
Giemsa
Desimal
3. Uji viabilitas sel
makrofag
Suatu uji yang
dilakukan untuk
Dengan trypan
blue-
Desimal
mengetahui viabilitas
makrofag (makrofag
yang hidup)
hemocytometer
4. MTT-assay Suatu uji kolorimetrik
(pewarnaan) yang
bertujuan untuk
mengukur viabilitas
makrofag
ELISA reader Desimal
5. Aktivitas fagosit
makrofag
Aktivitas fagosit
makrofag terhadap
media latex beads.
Terdapat dua
parameter, yaiut
kemapuan fagosit dan
index fagosit
Kemampuan
fagosit:
presentase sel
yang
melakukan
fagosit dari 100
sel makrofag

Index fagosit:
jumlah latex
beads yang
difagosit oleh 1
sel makrofag.
Ratio

G. Populasi dan Sampel
a. Populasi
Populasi penelitian ini adalah tikus jantan galur wistar berusia 2
bulan dengan berat badan 180-200 gram.
b. Sampel
Jumlah tikus yang digunakan sebagai sampel ditentutan berdasarkan
rumus Federer:
(t-1)(n-1) 15
Keterangan:
t = jumlah perlakuan
n = besar sampel pada masing-masing perlakuan
Penelitian ini menggunakan jumlah ulangan 4, sehingga sampel per
kelompok harus lebih dari 5. Penelitian ini menggunakan 6 ekor tikus per
kelompok, sehingga jumlah tikus yang dibutuhkan dalam penelitian ini
adalah 24 ekor tikus. Penentuan tikus pada masing-masing kelompok
perlakuan dengan teknik random sampling yaitu cara pengambilan
sampel yang memberikan kesempatan yang sama untuk diambil kepada
setiap elemen populasi.
H. Sumber Data
Sumber data yang diperoleh adalah sumber data primer yang diperoleh
langsung melalui prosedur penelitian.

I. Alat dan Bahan
a. Alat
1. Alat pembuatan ekstrak buah talok (Muningia calabura L)
a) Pisau
b) Timbangan digital
c) Oven blower
d) Alat penyerbuk
e) Plastik
f) Gelas ukur
g) Pengaduk elektrik
h) Tabung Erlenmeyer
i) Toples kaca
j) Kertas saring
k) Pompa vacum
l) Corong buchner
m) Rotary evaporator
n) Shaker evaporator
o) Blower evaporator
p) Pipet tetes
q) Tabung reaksi
r) Plat KLT
s) Bejana KLT
t) Lampu UV 254 nm dan 365 nm

2. Alat kultur makrofag dan pengambilan serum
a) Gunting
b) Pinset
c) Hemocytometer
d) Inkubator CO2
e) Kapas
f) Microplate 24 well
g) Sentrifugator
h) Spuit injeksi 10 ml
i) Jarum suntik 25 gauge
j) Tabung sentrifugasi
k) Coverslip
l) Hematokrit
m) Tabung litium heparin

3. Alat uji morfologi sel
a) Glass slide
b) Deck glass
c) Mikroskop fluoresen
4. Alat uji aktivitas fagosit
a) Microplate 24 well
b) Object glass
c) Mikroskop cahaya
d) Inkubator CO2
5. Alat uji MTT-assay
a) Microplate 96 well
b) Microplate reader
c) Inkubator CO2
b. Bahan
1) Akuades
2) Kloroform
3) Anisaldehid
4) Anhidrat asetat glasial
5) H
2
SO
4

6) Saponin standar
7) Metanol
8) Larutan trypan blue (Merck, Germany)
9) Media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Gibeo, Aucland,
New Zealand)
10) Fetal Bovine Serum (FBS) 2% (Caisson Labs, USA)
11) Tikus galur Wistar (Rattus norvegicus)
12) Bakteri A. actinomycetemcomitans (Lab. Mikrobio UNAIR)
13) Buah talok (Muningia calabura L)
14) N-hexane (Merck, Germany)
15) Latex beads diameter 3 m (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri,
USA)
16) Phospat Buffer Saline (PBS) (Gibeo, Auckland, New Zealand)
17) Giemsa 20% (Merck, Germany)
18) Ketamin hidroklorida 10% (Troy Labs. Pty. Ltd., Australia)
19) Ethidium Bromide solution (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)
20) MTT 5mg/ml PBS (50 mg MTT dalam 10 ml PBS) (Bio-Basic Canada
Inc., Canada)
21) SDS 10% dalam 0,1 N HCL (Merck, Germany)
22) Serum tikus galur Wistar
J. Cara Kerja
a. Pembuatan ekstraksi
1. Determinasi terlebih dahulu buah talok (Muningia calabura L).
2. Dipersiapkan buah talok (Muningia calabura L.).
3. Buah talok (Muningia calabura L.) diiris dibagi menjadi dua, lalu
dikeringkan menggunakan oven blower selama 2x24 jam.
4. Buah talok (Muningia calabura L.) yang sudah kering ditimbang
dan digiling agar menjadi serbuk.
5. Serbuk buah talok (Muningia calabura L.) dimaserasi
menggunakan pelarut akuades kemudian diaduk menggunakan
pengaduk elektrik selama 30 menit.
6. Hasil adukkan disimpan selama 24 jam.
7. Hasil evaporasi disimpan di dalam toples kaca kecil kemudian
ditempatkan dalam blower evaporator.
8. Dievaporasi menggunakan shaker water bath selama 24 jam.
b. Pembiakan bakteri A. actinomycetemcomitans
Indukan bakteri di beli dari laboratorium mikrobiologi Universitas
Airlangga, lalu pembiakan dilakukan oleh BLK Yogyakarta. Bakteri
dibiakkan dalam media gliserin supaya tidak merusak struktur bakteri,
hingga konsentrasi 1x10
8
CFU yang merupakan konsentrasi standar
penggunaan bakteri.
c. Induksi bakteri A. actinomycetemcomitans
Dilakukan aklimatisasi sampel selama 7 hari kemudian berat badan
tikus ditimbang, lalu dilakukan induksi bakteri dengan cara mengulas A.
actinomycetemcomitans sebanyak 0,1 ml dengan spuit 1 cc pada gingiva
tikus bagian anterior mandibula 2 kali sehari selama 2 hari.
d. Pengambilang sampel
Sampel diambil dari tikus yang sifat genetiknya sama, maka
pengambilan sampel secara random atau tidak, bukan merupakan
masalah. Sampel diambil secara acak untuk menghindari bias karena
faktor umur dan berat badan dan dilakukan penimbangan setelah dan
sesudah pengambilan. Tikus diadaptasikan dahulu selama 1 minggu dan
diberikan perlakuan yang sama sebelum dilakukan perlakuan uji
eksperimental. Tikus yang telah diadaptasikan selama 1 minggu lalu
dibagi menjadi 4 kelompok secara acak, masing-masing kelompok
berjumlah 6 ekor tikus, yaitu kelompok K, P1, P2, dan P3.
Keterangan :
K: kelompok perlakuan kontrol, tikus diinduksikan bakteri A.
actinomycetemcomitans 0,1ml dan diberi akuades.
P1: kelompok perlakukan satu, tikus diinduksikan bakteri A.
actinomycetemcomitans 0,1ml dan diberi ekstrak buah talok dengan
konsentrasi 0,01% setiap 3 kali sehari selama 3 hari
P2: kelompok perlakukan dua, tikus diinduksikan bakteri A.
actinomycetemcomitans 0,1ml dan diberi ekstrak buah talok dengan
konsentrasi 0,005% setiap 3 kali sehari selama 3 hari.
P3: kelompok perlakukan tiga, tikus diinduksikan bakteri A.
actinomycetemcomitans 0,1ml dan diberi ekstrak buah talok dengan
konsentrasi 0,001% setiap 3 kali sehari selama 3 hari.








K. Alur Penelitian













L. Metode Analisa Penelitian
Data dikumpulkan dan diolah dengan menggunakan program SPSS for
windows. Analisis data meliputi analisis deskriptif, tes normalitas, dan uji
parametrik. Analisis deskriptif berupa rerata, standar deviasi dan grafik.
Variabel terpengaruh untuk aktivitas fagosistosis makrofag peritoneal
didapatkan skala pengukuran ratio. Distribusi data diuji secara analisis
dengan tes normalitas. Apabila data terdistribusi normal dan variasi data
sama, maka analisis data dilanjutkan dengan uji secara parametrik
menggunakan one-way ANOVA untuk membandingkan aktivitas fagositosis
pada makrofag peritoneal tikus yang diberi ekstrak buah talok dan yang tidak
Tikus jantan galur Wistar 24 ekor
Adaptasi selama 7 hari
Randomisasi
Induksi bakteri A.
actinomycetemcomitans
Kel. Kontrol
Diet standar +
akuades
Kel. Perlakuan 1
Diet standar +
ekstrak buah
talok 0,01%
Kel. Perlakuan 2
Diet standar +
ekstrak buah talok
0,005%
Kel. Perlakuan 3
Diet standar +
ekstrak buah talok
0,001%
Kultur makrofag peritoneal
Respon imun tikus fagosit
makrofag
Uji statistik
diberi perlakuan. Tingkat signifikansi yang digunakan adala 95%. Jika p<
0,05pada uji one-way ANOVA, analisis data dilanjutkan dengan Post Hoc test
untuk melihat perbedaan antar variabel.
M. Jadwal Penelitian
Berikut di bawah ini adalah rencana jadwal penelitian:
Tabel 3.2 Jadwal Penelitian
No Uraian Kegiatan
Bulan ke-
1 2 3 4 5 6
1
Penyusunan Proposal
2
Pengumpulan Data
3
Analisa Data
4 Penyusunan Hasil
Analisa Data