VALIDASI METODE ANALISIS SENYAWA CEFOTAXIME DENGAN STANDAR INTERNAL

CEFADROXIL SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Iyan Sopyan, Rijal Syahril Maulana, Driyanti Rahayu
Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Sumedang
ABSTRAK
Sampai saat ini penelitian validasi metode analisis ceota!ime dalam pelarutnya menggunakan "#"$ detektor
U% &elum dilaporkan' Penelitian ini &ertujuan untuk mengetahui validitas metode analisis ceota!ime dalam
pelarutnya menggunakan "#"$ detektor U%' Sampel dilarutkan dengan asa gerak dianalisis menggunakan
kolom #() *octadecyl silane+ ,-. ! /,0 mm, ukuran partikel (. 1m, ase gerak ).2,. v3v dapar osat .,.( M *p4
/,0+ dan metanol dengan kecepatan alir .,) ml3menit, deteksi dilakukan pada ,5- nm dengan standar internal
ceadro!il' Metode analisis divalidasi &erdasarkan parameter2 selektivitas, akurasi, presisi, keterulangan,
linieritas, 67D, 678, dan kesesuaian sistem' %alidasi metode analisis menunjukkan hasil uji selektivitas Rs 9
(,-, uji keterulangan dengan "%*:+ ; ,:, linieritas diperoleh pada rentang -<,- 1g3ml dengan koeisien
korelasi *r+ .,===(<.,===,' >erdasarkan rasio luas area dan rasio tinggi puncak kromatogram diperoleh nilai
67D .,./0 dan .,.-5 1g3ml, nilai 678 .,(-/ dan .,(?) 1g3ml, persen akurasi =-,0,<(..,)/: dan =5,?0<
(.(,==:, serta presisi "%*:+ .,),<.,(-=: dan (,.0<(,5.:' 4asil uji kesesuaian sistem terhadap @aktu retensi,
rasio luas area, dan rasio tinggi puncak kromatogram menunjukkan "%*:+ ; (.:' Dapat disimpulkan &ah@a
metode analisis yang digunakan memiliki validitas sesuai dengan yang dipersyaratkan'
Kata kunci2 "#"$, #eota!ime, validasi'
ABSTRACT
Analysis method validation of cefotaxime in its eluen using HPLC with UV detector has not been reported !his
research was purposed to "now the validity of cefotaxime analysis method in its eluen with HPLC UV detection
#amples were eluted with mobile phase and analy$ed using a mobile phase of %&'(& v)v buffer phosphate &*&+
, -pH .*/0 and methanol on an octadecylsilane column (1& x ./ mm* with UV detection at (21 nm Cefadroxil
was used as the internal standard !he result showed selectivity 3s 4 +1* repeatability expressed by its variation
coefficient 5 +&6* linearity range &+7/ 8g)ml with coefficient correlation -r0 between &*999+ and &*999( were
obtained :ased on pea" area and pea" height chromatogram ratio* L;< was &*&./ and &*&12 =g)ml* L;> was
&*+1. and &*+?% =g)ml* accuracy percent was 91*/(7+&&*%.6 and 92*?/7+&+*99* precision -6CV0 &*%(7&*+196
and +*&/7+*2&* and system suitability from retention time* pea" area* and pea" height chromatogram ratio which
their 6CV 5 +&6 !he analysis method proved to be sensitive for cefotaxime analysis in mobile phase
Key words' HPLC* Cefotaxime* validation
PENDAHLAN
#eota!ime adalah anti&iotik golongan
sealosporin generasi ketiga yang mempunyai
khasiat &akterisidal dan &ekerja dengan
mengham&at sintesis mukopeptida pada dinding
sel &akteri' #eota!ime sangat sta&il terhadap
hidrolisis &eta laktamase, maka ceota!ime
digunakan se&agai alternati lini pertama pada
&akteri yang resisten terhadap penisilin' Pada
pengo&atan dengan ceota!ime, &ila pasien
memiliki volume distri&usi sangat kecil, se&agian
&esar o&at ada didalam darah' Anti&iotik
ceota!ime ini dapat di&erikan secara i'v' dan i'm'
karena a&sorpsi di saluran cerna kecil' Masa paruh
eliminasi pendek sekitar ( jam, maka di&erikan
tiap (, jam MI# dapat dicapai dalam @aktu (.
jam' Ikatan protein plasma se&esar /. :
*Pra&aningrum dan Septiana, ,..)+'
#eota!ime adalah anti&iotik &aru yang
hingga saat ini &elum ada metode anBlisis yang
tervalidasi yang dapat dijadikan acuan untuk
menetapkan kadar anti&iotik terse&ut'' Untuk
penetapan kadar ceota!ime, dilakukan analisis
o&at dalam pelarutnya' Se&elum dilakukan metode
analisis, terle&ih dahulu dilakukan validasi'
%alidasi metode analisis merupakan suatu
tindakan yang dilakukan se&agai pem&uktian
terhadap parameter<parameter tertentu yang
dipersyaratkan dan ditetapkan sehingga analisis
(
yang dilakukan mendapatkan hasil yang
diinginkan'
Suatu metode analisis &aru dapat
digunakan apa&ila telah dilakukan validasi' 4al ini
karena adanya per&edaan alat, keter&atasan alat,
&ahan kimia atau kondisi lain yang menye&a&kan
metode terse&ut tidak dapat diterapkan secara
keseluruhan' Sehingga sering dilakukan
modiikasi, penyederhanaan maupun per&aikan
metode, aki&atnya metode terse&ut harus
divalidasi dengan cara yang &enar' Apa&ila metode
ini dapat dipertanggungja@a&kan secara
keseluruhan *presisi, akurasi, selektivitas, &atas
deteksi, &atas kuantitasi, sta&ilitas dan lain<lain+,
tidak menyimpang, dan diakui oleh pihak yang
&erkompeten, maka metode yang dimodiikasi ini
dianggap valid dan dapat digunakan untuk analisis
rutin *4idayat, (===+'
Pengem&angan penetapan kadar
ceota!ime dalam sediaan armasi telah dilakukan
dengan menggunakan metode "#"$ dengan
detector U% dalam cairan cerebrospinal Camun
demikian, selama ini &elum pernah dilaporkan
penelitian mengenai velidasi metode penetapan
ceota!ime dalam pelarut menggunakan "#"$
dengan detektor U%'
METODE PENELITIAN
A!at P"n"!itian
Seperangkat alat kromatograi cair kinerja
tinggi *ShimadDu 6#<(. A$%P+ yang dilengkapi
dengan detektor U%<%IS SPD, auto in@ector
ShimadDu System #ontroler S#6<A, kolom "#"$
*Phenomene!+E panjang ,-. mm, diameter dalam
/,0 mm, ukuran partikel (. 1m, seperangkat alat
spektrootometer U%<%is *analytical Jena, specord
,..+, p4 meter *7hmeter+, ultrasonic bath *CFG
(-(.+, tim&angan analitik *Sartorius+ kepekaan .,(
mg, penyaring vakum &eserta saringan &erpori .,,<
.,/- 1m, dan alat<alat gelas yang &iasa digunakan
di 6a&oratorium Penelitian'
Ba#an P"n"!itian
#eota!ime, ceadro!il' Semua reagen kimia
&erderajat p'a 2 natrium dihidrogen osat
monohidrat *Merck+, asam osat *Merck+, metanol
p'a *Merck+, akua&ides *I"A+, dan natrium
hidroksida'
M"t$%" P"n"!itian
P"&'uatan Fa(" G")ak %an La)utan Baku
P"&'uatan 'u*") *$(*at +NaH,PO-.H,O/
0.01 M2 3H -24
Ditim&ang seksama .,0= gram natrium
dihidrogen osat monohidrat, dimasukkan ke
dalam la&u ukur -.. ml, diencerkan dengan
akua&ides sampai tanda &atas, ditam&ahkan asam
osat untuk mengatur p4 sampai /,0 menggunakan
p4 meter *Snyder et al, (==?+' Disaring
menggunakan milipore dengan pori .,, 1m, dengan
&antuan vakum' Selanjutnya larutan dia@audarakan
dengan ultrasonic bath selama (-<,. menit'
P"&'uatan Fa(" G")ak
"e dalam gelas ukur (.. ml, dicampurkan
). &agian dapar osat p4 /,0 dan ,. &agian
metanol' #ampuran terse&ut disaring menggunakan
milipore dengan pori .,, 1m, dengan &antuan
vakum' Selanjutnya larutan dia@audarakan dengan
ultrasonic bath selama (-<,. menit'
P"n"ntuan Pan5an6 G"!$&'an6 P"n6uku)an
Baku C"*$ta7i&"
Ditim&ang seksama (.. mg #eota!ime,
dilarutkan ke dalam la&u ukur ,.. ml dengan ase
gerak hingga tanda &atas sehingga diperoleh
konsentrasi akhir -.. 1g3ml' Dipipet (.. 1l ke
dalam la&u ukur (. ml, diencerkan dengan ase
gerak sehingga diperoleh konsentrasi -

1g3ml'
"emudian larutan di<scanning dengan
spektrootometer ultraviolet pada panjang
gelom&ang ,,.<5,. nm, sehingga diperoleh
spektrum serapan dan panjang gelom&ang
maksimum #eota!ime'
Baku C"*a%)$7i!
Ditim&ang seksama (.. mg ceadro!il,
dilarutkan ke dalam la&u ukur ,.. ml dengan ase
gerak sampai tanda &atas sehingga diperoleh
konsentrasi -.. 1g3ml' Dipipet (.. 1l ke dalam
la&u ukur (. ml, diencerkan dengan ase gerak
sehingga diperoleh konsentrasi -

1g3ml' "emudian
larutan discanning dengan spektrootometer
ultraviolet pada panjang gelom&ang ,,.<5,. nm,
sehingga diperoleh spektrum serapan dan panjang
gelom&ang maksimum #eota!ime'
P"n"ntuan Ek(tin6(i M$!a) +8/ C"*$ta7i&"
Dipipet sejumlah tertentu larutan
#eota!ime dari larutan &aku #eota!ime dengan
konsentrasi -.. 1g3ml, dimasukkan ke dalam la&u
ukur (. ml, diencerkan dengan ase gerak sampai
tanda &atas, sehingga diperoleh konsentrasi akhir ?,
(., dan (, 1g3m6' "etiga larutan terse&ut
kemudian dianalisis dengan spektrootometer dan
di&aca serapannya pada panjang gelom&ang
maksimum #eota!ime, dan ditentukan nilai
ekstingsi molarnya dengan menggunakan
persamaan 2
&'#
A
''''''''''''*5'(+
"eterangan 2 A H a&sortivitas molar *A+
& H te&al kuvet *cm+
# H konsentrasi #eota!ime
*Molar+
,
O3ti&a(i K$n%i(i KCKT
Sistem "#"$ yang akan digunakan
adalah se&agai &erikut 2
"olom 2 7DS3#() *octadecyl
silane+, panjang ,-. mm,
diameter dalam /,0 mm, dan
ukuran partikel (. 1m
Fase gerak 2 Metanol 2 Ca4,P7/ *p4
,,,+ *?- 2 ,-, ?) 2 ,,, ). 2 ,. +
*akan dioptimasi+
6aju alir 2 .,) ml3menit
Standar internal 2 #eadro!il
Detektor 2 U% ,5- nm
Attenuation 2 5
,inimum
Area <etection 2 -...
P"n"ntuan K$&3$(i(i %a)i Fa(" G")ak
6arutan &aku #eota!ime dengan konsentrasi (.
1g3ml yang mengandung standar internal ceadro!il
dengan konsentrasi akhir - 1g3ml disuntikkan
se&anyak ,. 1l *auto in@ector+ ke dalam alat "#"$
dengan komposisi ase gerak yang &er&eda<&eda
pada kecepatan alir .') ml3menit, kemudian dilihat
@aktu retensi dan pemisahan kedua puncak
*#eota!ime dan ceadro!il+ yang dihasilkan untuk
kemudian digunakan pada tahap analisis
&erikutnya'
Pretreatment Sa&3"!
Baku C"*$ta7i&" %an Baku C"*a%)$7i!
Ditim&ang seksama (.. mg #eota!ime, dilarutkan
ke dalam la&u ukur (. ml dengan ase gerak hingga
tanda &atas sehingga diperoleh konsentrasi akhir
(... 1g3ml'
Ditim&ang seksama (.. mg #eadro!il, dilarutkan
ke dalam la&u ukur (. ml dengan ase gerak hingga
tanda &atas sehingga diperoleh konsentrasi akhir
(... 1g3ml'
Va!i%a(i M"t$%" Ana!i(i( C"*$ta7i&" ("ca)a
KCKT
S"!"kti9ita(
Dengan melihat kromatogram ceota!ime
dan ceadro!il hasil pemisahan secara "#"$, tidak
adanya puncak yang saling tumpang tindih,
@alaupun kedua Dat dalam satu turunan'
Selektivitas dinyatakan dengan nilai resolusi atau
daya pisah *Rs+ dan nilainya 9 (,-
*Snyder et al, (==?+'
K"t")u!an6an +Repeatability/
Di&uat konsentrasi larutan #eota!ime (.
1g3ml dalam asa gerak, kemudian disuntikkan
se&anyak ,. 1l ke dalam alat "#"$ pada kondisi
optimum' Perco&aan diulang se&anyak enam kali,
kemudian dihitung koeisien variasinya *:"%+'
P"&'uatan Ku)9a Baku
6ima seri konsentrasi #eota!ime -, (., (-, ,.
dan ,- 1g3ml dengan standar internal #eadro!il
konsentrasi - 1g3ml dalam asa gerak *pada setiap
konsentrasi #eota!ime+ disiapkan dengan
mem&uat pengenceran secara seri dari stok larutan
&aku #eota!ime dengan asa gerak' Selanjutnya
sejumlah (. 1l disuntikkan ke dalam alat "#"$
pada kondisi optimum' Penentuan linieritas
dilakukan tiga kali pengulangan' "urva kali&rasi
yang diperoleh digunakan untuk menetapkan kadar
sampel'
Persamaan garis regresi linier digam&arkan
se&agai hu&ungan antara konsentrasi #eota!ime
dari rasio luas area kromatogram atau tinggi puncak
kromatogram #eota!ime terhadap standar internal
#eadro!il, kemudian dihitung koeisien
korelasinya'
Bata( D"t"k(i *LOD+ %an Bata( Kuantita(i *LO:+
Cilai &atas deteksi dan &atas kuantitasi analisis
#eota!ime dihitung secara statistik melalui garis
regresi linier dari kurva kali&rasi, nilai pengukuran
akan sama dengan nilai & pada persamaan garis
linier y H &! I a *4armita, ,../+'
Limit of detection *67D+ dinyatakan dengan 2
b
#
L;<
b
5

'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''*5'5+
atau dinyatakan lain se&agai rasio signal terhadap
noise dengan per&andingan *5 2 (+ atau secara
matematis dinyatakan dengan persamaan G H G& I
5 S&' Cilai S& diperoleh dari persamaan 2
( ) { }
,
(
,
3

A Ai
#
#
i
x y
b
,
dimana 2 Sy3! H
( )
,
(
,
,

'

n
B B
i
i
Limit of Cuantitation *6780 dihitung dengan
persamaan 2
b
#
L;>
b
(.

''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''*5'-+
atau dinyatakan lain se&agai rasio signal terhadap
noise dengan per&andingan *(. 2 (+ atau secara
matematis dinyatakan dengan persamaan G H G& I
(. S&, *J'#' Miller and J'C' Miller, (=))+'
Aku)a(i %an P)"(i(i
Akurasi dan presisi diperoleh dengan cara
menetapkan kadar tiga sampel masing<masing tiga
kali pengulangan *n H 5+' "onsentrasi sampel
di&uat sekitar kurva &aku meliputi 5 (. 1g3ml, ,.
1g3ml dan ,- 1g3ml' "urva kali&rasi dengan
koeisien korelasi ter&aik digunakan untuk
5
menetapkan #eota!ime dalam sampel' Persen
akurasi diperoleh dengan cara melihat kedekatan
hasil dari sampel terhadap nilai nominal dan presisi
dilihat dari nilai "% *:+,
Presisi dinyatakan dengan "% *:+, dengan
persamaan 2
: (.. :
,
_

A
#<
DV '''''''''*5'0+
"eterangan 2 "% H "oeisien variasi
SD H Standar deviasi
A
H Rata<rata
5i K"("(uaian Si(t"& *System Suitability+
Uji kesesuaian sistem dilakukan terhadap
sampel #eota!ime konsentrasi (. 1g3ml dengan
standar internal #eadro!il - 1g3ml dalam asa
gerak, kemudian disuntikkan se&anyak ,. 1l ke
dalam alat "#"$ pada kondisi optimum'
Perco&aan diulang se&anyak enam kali *n H 0+' Dari
kromatogram yang diperoleh ditentukan
keterulangan penyuntikan larutan &aku yang
dinyatakan dengan "% dari @aktu retensi, rasio
luas area dan rasio tinggi puncak, tailing aktor, dan
asimetri puncak kromatogram'
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ha(i! P"n6uku)an S3"kt)$*$t$&"t")
P"n"ntuan Pan5an6 G"!$&'an6 Mak(i&u&
Pada penetapan panjang gelom&ang
larutan ceota!ime dalam pelarut diperoleh serapan
maksimum pada panjang gelom&ang ,5- nm dan
untuk larutan ceadro!il diperoleh serapan
maksimum pada ,5, nm' "arena ceota!ime
merupakan senya@a yang akan dianalisis, maka
panjang gelom&ang maksimum ceota!ime
ditetapkan se&agai panjang gelom&ang yang
digunakan pada pendeteksian hasil analisis dengan
"#"$' 4asil scanning dapat dilihat pada Jam&ar
/'('
Jam&ar /'( Spektrum ceota!ime *atas+ ,5- nm
dan ceadro!il *&a@ah+ ,5, nm
Panjang gelom&ang maksimum
merupakan panjang gelom&ang dimana Dat terse&ut
memiliki nilai a&sor&ansi paling &esar' Panjang
gelom&ang maksimum dipilih karena pada panjang
gelom&ang terse&ut Dat akan mem&erikan respon
yang maksimum, terutama apa&ila konsentrasi
analit yang akan dianalisis kecil konsentrasinya'
Cilai panjang gelom&ang maksimum ini dapat
digunakan untuk identiikasi kualitati suatu
senya@a, karena &ersiat spesiik untuk setiap
senya@a yang mempunyai gugus kromoor tertentu
dan jenis transisi elektronik tertentu' Pada >ritish
Pharmacopoeia ,..) identiikasi ceota!ime
dilakukan pada panjang gelom&ang maksimum ,5-
nmseperti halnya pada penelitian ini yang juga
mengunakan panjang gelom&ang maksimum
ceota!ime pada ,5- nm'
Ha(i! P"n"ntuan Ni!ai Ek(tin6(i M$!a) +/
c"*$ta7i&"
Penetapan nilai ekstingsi molar *+
ceota!ime dilakukan dari tiga variasi konsentrasi,
yaitu (/,00, ,.,=-, dan ,?,,5 1M dalam ase gerak
pada panjang gelom&ang maksimum ceota!ime,
yakni ,5- nm' Cilai ekstingsi molar ceota!ime
dihitung dengan mem&andingkan nilai serapan atau
a&sortivitas molar ceota!ime terhadap te&al kuvet
*umumnya ( cm+ dan konsentrasi ceota!ime yang
diukur' 4asilnya menunjukkan nilai ekstingsi molar
ceota!ime rata<rata ?='==(, )0 M
<(
cm
<('
' Cilai ini
menunjukkan &ah@a ceota!ime sangat
memungkinkan untuk dideteksi dengan jdetektor
ultraviolet pada sistem "#"$' 4al ini dise&a&kan
karena adanya gugus kromoor *ikatan rangkap
terkonjugasi+ pada struktur ceota!ime' Cilai
ekstingsi molar ceo dapat dilihat pada $a&el /'('
$a&el /'( 4asil Perhitungan Fkstingsi Molar *+
#eota!ime
Data ekstingsi molar ceota!ime
pada panjang gelom&ang ,5- nm
Co'
"onsentrasi
molar *M+
Serapan
Cilai
ekstingsi
molar
*M
<(
cm
<(
+
(
,
5
.,....(/00
.,....,.=-
.,....,?,5
(,.)0/
(,)((-
,,(0,(
?/'(.0,/(
)0'/0?,?)
?='/.(,5=
Jumlah ,5='=?-,-)
A
?='==(,)0
"eterangan 2 Cilai ekstingsi molar H serapan di&agi
konsentrasi ceota!ime dan te&al kuvet *(
cm+
/
Ha(i! O3ti&a(i K$n%i(i KCKT
Sistem "#"$ yang akan digunakan untuk
optimasi kondisi adalah se&agai &erikut2
"olom 2 7DS3#() *octadecyl
silane+, panjang ,-. mm,
diameter dalam /,0 mm,
dan ukuran partikel (. 1m
Fase gerak 2 Catrium dihidrogen osat
*.,.( M, p4 /,0 diatur
dengan penam&ahan
Ca74+ 2 metanol *?- 2 ,-,
?) 2 ,,, ?= 2)( dan ). 2 ,.
v3v+
"ecepatan alir 2 .') ml3menit
Standar internal 2 #eadro!il
Detektor 2 U% ,5- nm
Attenuation 2 5
Area <etection
,inimum 2 -...
7ptimasi kondisi "#"$ dilakukan
terhadap parameter kromatograi meliputi @aktu
retensi, resolusi atau keterpisahan *Rs+, jumlah
keping teoritis *C+, dan eisiensi kolom *4F$P+
dari &er&agai variasi komposisi, *4asil optimasi
kondisi "#"$ dapat dilihat pada $a&el /',+'
Prioritas utama pemilihan kondisi adalah nilai
resolusi yang dihasilkan harus 9 (,- *6'R' Snyder
et al, (==?+, nilai resolusi 9 (,- menunjukkan
&ah@a kedua puncak terpisah secara sempurna'
Prioritas kedua adalah @aktu retensi, di&utuhkan
@aktu retensi yang cocok untuk keperluan metode
analisis dalam matriks cairan hayati dimana Dat
pengotor menghasilkan puncak serapan pada @aktu
retensi .<5 menit' Sehingga di&utuhkan @aktu
retensi diatas 5 menit'
$a&el /', 4asil 7ptimasi "omposisi dan
"ecepatan Alir Fase Jerak
"ompo
sisi
ase
gerak
Kaktu
retensi
ceadro!il
*menit+
Kaktu
retensi
ceota!ime
*menit+
Reso
lusi
*Rs+
Jumlah
keping
teoritis
*C+
4F$P
*63C+
?- 2 ,-
5,?-. ?,-() (,=, (0'5,5,--= .,.(-5,
?) 2 ,,
/,.-) =,=/, ,,,) (?',?(,5=/ .,.(//?
?= 2 ,(
/,(=,
(.,-/, ,,5? (-'.(/,5,5 .,.(00-

). 2,.
/,/..
(.,=55
,,?, (0').0,((= .,.(/))
"eterangan 2 6 H Panjang kolom "#"$ *mm+, Fasa
gerak Dapar Fosat p4 /,0 2 Metanol
Fase gerak dengan komposisi dapar osat
.,.( M p4 /,0 dan metanol *). 2 ,.+ dengan
kecepatan alir .,) ml3menit dipilih karena
menghasilkan nilai resolusi *Rs+ ,,?, *9 (,-+ dan
menghasilkan @aktu retensi standar internal le&ih
dari / menit' "ecepatan alir .,) ml3menit
se&enarnya jarang digunakan, saat ini kecepatan
alir yang umum digunakan adalah ( ml3menit'
"ecepatan alir .,) ml3menit digunakan untuk
meminimalisir tekanan di dalam kolom agar
tekanan kolom tidak terlalu tinggi, &ila tekanan
kolom terlalu tinggi maka akan terjadi peningkatan
tekanan sistem yang dapat memperpendek umur
kolom dan pompa'
Kalaupun tidak memiliki nilai 4F$P
terkecil dan jumlah keping teoritis yang ter&esar,
@aktu retensi (.,=55 menit untuk ceota!ime
dipilih karena pertim&angan puncak standar
internal dengan @aktu retensi /,/.. untuk
memastikan puncak dari standar internal tidak
tertutup oleh pengotor pada @aktu validasi metode
analisis dalam matriks cairan hayati yang &iasanya
terdeteksi pada @aktu retensi antara . L 5 menit'
Jumlah keping teoritis dapat digunakan untuk
mengetahui kualitas dan kinerja kolom' Cilai
keping teoritis akan meningkat dengan cara
menurunkan laju alir ase gerak atau dengan
menam&ah panjang kolom, tetapi aki&atnya @aktu
analisisnya akan le&ih lama' *4asil perhitungan dari
resolusi *Rs+, jumlah keping teoritis *C+, dan
eisiensi kolom *4F$P+ dapat dilihat pada
6ampiran A+'
Selanjutnya hasil opimasi "#"$ ini akan
divalidasi dengan menggunakan validasi metode
analisis'
Ha(i! Va!i%a(i M"t$%" Ana!i(i(
Sistem "#"$ yang akan digunakan adalah se&agai
&erikut 2
"olom 2 #() *octadecyl
silane+, panjang
,-. mm,
diameter dalam
/,0 mm, dan
ukuran partikel
(. 1m
Fase gerak 2 Dapar osat .,.(
M p4 /,0 dan
metanol dengan
per&andingan
). 2 ,. v3v
"ecepatan alir 2 .,) ml3menit
Standar internal 2 #eadro!il
Detektor 2 U% ,5- nm
Attenuation 2 5
,inimum Area <etection 2 -...
Ha(i! 5i S"!"kti9ita(
Untuk mengetahui selektivitas suatu
metode yang digunakan, dapat dilihat dari daya
-
keterpisahan *resolusi+ kedua puncak' Pada Jam&ar
/', terlihat puncak ceado!il dengan @aktu retensi
/,/.. menit terpisah dari puncak ceota!ime
dengan @aktu retensi (.,=55 menit dengan nilai
resolusi Rs H ,,?,, sesuai persyaratan untuk nilai
resolusi yaitu 9 (,- *6'R' Snyder et al, (==?+'
Dengan nilai resolusi terse&ut, dapat disimpulkan
&ah@a metode "#"$ ini dapat digunakan untuk
menganalisis ceota!ime dengan menggunakan
standar internal ceadro!il'
Jam&ar /', "romatogram ceota!ime dan standar
internal ceadro!il
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
V
o
lts
0
.0
0
0
0
.0
0
2
0
.0
0
4
0
.0
0
6
0
.0
0
8
0
.0
1
0
0
.0
1
2
V
o
lts
0. 000
0. 002
0. 004
0. 006
0. 008
0. 010
0. 012
(
9
9
( 1
%
/ .
?
.
+
/
? (
/
/
1
2
9 +
&
?
&
.

9
1
&
% (
%
%
.
9
. 1
(
(
&
Detector A- 1 (235nm)
cefocefa
ij al fg 5 ppm 80PO4pH4. 4-20!eOH 20 "# 0. 8 m#menit 0-08-2008-002
3etention !i me
Area
Height
Ha(i! 5i K"t")u!an6an +Repeatability/
Uji keterulangan dilakukan terhadap
ceota!ime dengan konsentrasi (. 1g3ml
menggunakan standar internal ceadro!il - 1g3ml'
Dilakukan replikasi se&anyak enam kali, kemudian
diamati @aktu retensi, luas area kromatogram, dan
tinggi puncak kromatogram' Rata<rata @aktu
retensi untuk ceota!ime menunjukkan nilai =,//5
M .,.) menit dan "% H .,)-:' 4asilnya dapat
dilihat pada $a&el /'5'
$a&el /'5 4asil Uji "eterulangan *3epeatability+
ceota!ime >erdasarkan Kaktu Retensi
*n H 0+
"eterangan 2 Uji dilakukan dalam asa gerak dengan standar
internal ceadro!il - 1g3ml
"eterulangan &erdasarkan rasio luas area
kromatogram diperoleh dengan nilai "% H (,-.:
*dapat dilihat pada $a&el /'/+, dan hasil
keterulangan &erdasarkan rasio tinggi puncak
kromatogram menunjukkan nilai "% H (,-):
*dapat dilihat pada $a&el /'/+'
$a&el /'/ 4asil Uji "eterulangan *3epeatability+
#eota!ime >erdasarkan 6uas Area
"romatogram *n H 0+
"eterangan 2 Uji dilakukan dalam asa gerak dengan standar
internal ceadro!il - 1g3ml
$a&el /'- 4asil Uji "eterulangan *3epeatability+
#eota!ime >erdasarkan $inggi
Puncak "romatogram *n H 0+
"eterangan 2 Uji dilakukan dalam asa gerak dengan standar
internal ceadro!il - 1g3ml
Pada &e&erapa literatur, kriteria seksama
di&erikan jika metode mem&erikan simpangan &aku
relati atau koeisien variasi ,: atau kurang' $etapi
nilai ini sangat leksi&el &ergantung pada
konsentrasi analit yang dianalisis, jumlah sampel,
dan kondisi la&oratorium' "oeisien variasi akan
meningkat dengan menurunnya kadar analit yang
dianalisis *4armita, ,../+'
Ha(i! 5i Lini")ita(
Uji linieritas dilakukan untuk melihat
kemampuan metode analisis dalam mem&erikan
respon yang &aik pada &er&agai macam konsentrasi
analit pada suatu kurva kali&rasi untuk
menghasilkan garis lurus' Parameter adanya
hu&ungan linier dinyatakan dengan koeisien
ppm
ceota!ime
*1g3ml+
Kaktu retensi
*menit+
ceadro!il #eota!ime Rasio
(.
(.
(.
(.
(.
(.
/,(/,
/,.=,
/,.)5
/,.=,
/,.)5
/,(..
=,5)5
=,5-.
=,/(?
=,/-
=,/)5
=,-?-
,,,0-55(
,,,)/=/0
,,5.05=,
,,5.=5)/
,,5,,--?
,,55-500
A
/,.== =,//5 ,,5.5==0
"% : .,-/( .,)/? (,(.(0-/
Donse n
tr
as
i
ceota!ime
*1g3ml+
6uas area kromatogram
#eadro!il #eota!ime Rasio
(.
(.
(.
(.
(.
(.
,).0(/
,?=,.)
,??./(
,?0()-
,0-=?5
,?-/?,
-5?,,(
-5()(0
-5-./5
-,=0-0
-,?,(=
-,-/?.
(,=(///)
(,=./?5(
(,=5(,??
(,=(??-)
(,=),,,)
(,=.?-,0
A
,?-?/),) -5(.?.,) (,=,05,)
"% : (,)? .,)- (,-.
Donsentras
i
#eota!ime
*1g3ml+
$inggi puncak kromatogram
#eadro!il #eota!ime Rasio
(.
(.
(.
(.
(.
(.
((.=0
((5(0
((.)=
((/.=
((5(,
((())
=?)/
=)(-
(..=-
(.(,)
(..?)
==0-
.,))(?-=
.,)0?5-0
.,=(.50,
.,))??,.
.,)=.=(,
.,)=.0)0
A
((,5- ==??,- .,)))(55
"% : (,(0 (,/= (,-)
0
korelasi, dan suatu metode analisi yang valid
mempunyai harga koeisien korelasi le&ih dari
.,=== *6'R' Snyder et al, (==?+'
Untuk mengetahui hu&ungan linieritas
antara konsentrasi ceota!ime dengan rasio luas
area kromatogram dan rasio tinggi puncak
kromatogram, di&uat kurva kali&rasi dari
ceota!ime' "urva kali&rasi di&uat dengan cara
mem&uat larutan ceota!ime dalam asa gerak
sehingga diperoleh konsentrasi akhir -, (., (-, ,.,
dan ,- 1g3ml yang mengandung standar internal
ceadro!il dengan konsentrasi akhir - 1g3ml
kemudian setiap konsentrasi ceota!ime diukur
dengan "#"$' Masing<masing konsentrasi
dilakukan tiga kali pengukuran' Persamaan garis
regresi linier dengan koeisien korelasi ter&aik
digunakan untuk menetapkan kadar sampel
ceota!ime untuk kemudian diamati nilai akurasi
dan presisinya' Pada $a&el /'0 dan /'? dapat dilihat
nilai a *intercept+, & *slope+, dan r *koeisien
korelasi+ dari masing<masing persamaan kurva
kali&rasi'
$a&el /'0 4asil Uji 6inieritas #eota!ime
>erdasarkan Rasio 6uas Area
"romatogram *Replikasi H 5+
Replikasi
Eilai
a & R
( .,(??= .,(?)5 .,===--.
, .,()5 .,(0. .,==)/==
5 .,()0 .,(5, .,==)===
"eterangan 2 Uji dilakukan dalam asa gerak dengan konsentrasi
ceota!ime -, (., (-, ,., dan ,- 1g3ml dengan
standar internal ceadro!il - 1g3ml
Untuk menetapkan kadar sampel,
digunakan persamaan kurva kali&rasi yang
mempunyai koeisien korelasi 9 .,===, dimana nilai
ini merupakan kriteria suatu metode analisis yang
valid *6'R' Snyder et al, (==?+' Persamaan garis
regresi linier &erdasarkan rasio luas area pada $a&el
/') *perhitungan dapat dilihat pada 6ampiran+ yang
digunakan untuk menetapkan kadar ceota!ime
adalah y H .,(??= ! I.,(?)5 dengan r H .,===--.'
$a&el /'? 4asil Uji 6inieritas #eota!ime
dengan >erdasarkan Rasio $inggi
Puncak "romatogram *replikasi H 5+
Replikasi
Eilai
a & r
( .,.)0 .,..) .,==)/=)
, .,.)/ .,.?5 .,===-==
5 .,.)0 .,./- .,==)===
"eterangan 2 Uji dilakukan dalam asa gerak dengan konsentrasi
ceota!ime -, (., (-, ,., dan ,- 1g3ml
dengan standar internal ceadro!il - 1g3ml
Persamaan garis regresi linier &erdasarkan rasio
tinggi puncak pada $a&el /'? *perhitungan dapat
dilihat pada 6ampiran yang digunakan untuk
menetapkan kadar ceota!ime adalah y H .,.)/ ! I
.,.?5 dengan r H .,===-=='
Cilai koeisien korelasi yang diperoleh
&erdasarkan rasio luas area kromatogram dan rasio
tinggi puncak kromatogram menunjukkan nilai 9
.,===, hal ini mem&uktikan &ah@a metode analisis
yang digunakan sudah memenuhi kriteria linieritas
pada rentang -<,- 1g3ml' Persamaan garis kurva
kali&rasi yang ter&aik ditunjukkan pada Jam&ar /'5
dan /'/
Jam&ar /'5 "urva kali&rasi ceota!ime
&erdasarkan rasio luas area
kromatogram
"eterangan 2 "urva kali&rasi di&uat dari konsentrasi
ceota!ime -, (., (-, ,., dan ,- 1g3ml
dengan standar internal ceadro!il - 1g3ml
dalam asa gerak'
Jam&ar /'/ "urva kali&rasi ceota!ime
&erdasarkan rasio tinggi puncak
kromatogram
"eterangan 2 "urva kali&rasi di&uat dari konsentrasi ceota!ime
-, (., (-, ,., dan ,- 1g3ml dengan standar
internal ceadro!il - 1g3ml dalam asa gerak'
Ha(i! 5i Limit of Detection +LOD/
Limit of detection *67D+ mutlak
ditentukan jika analit yang dianalisis
konsentrasinya relati kecil seperti dalam matrik
?
&iologis *J' Indrayanto, (==/+' 4asil uji 67D
dihitung &erdasarkan kurva kali&rasi ceota!ime
dari persamaan yang mempunyai koeisien korelasi
*r+ ter&aik' Cilai 67D ditetapkan dari kurva
kali&rasi ceota!ime terhadap rasio luas area
kromatogram dan rasio tinggi puncak
kromatogram' Cilai 67D dari rasio luas area
kromatogram adalah .,.-.), 1g3ml dan
&erdasarkan rasio tinggi puncak kromatogram
adalah .,.-)=0 1g3ml'
Ha(i! 5i Limit of Quantitation +LO:/
Limit of Cuantitation *678+ mutlak
ditentukan jika analit yang dianalisis
konsentrasinya relati kecil seperti dalam matrik
&iologis *J' Indrayanto, (==/+' 4asil uji 678
dihitung &erdasarkan kurva kali&rasi ceota!ime
dari persamaan yang mempunyai koeisien korelasi
*r+ yang paling &aik' Cilai 678 ditetapkan dari
kurva kali&rasi ceota!ime terhadap rasio luas area
kromatogram dan rasio tinggi puncak
kromatogram' Cilai 678 dari rasio luas area
kromatogram adalah .,(0=/ 1g3ml dan &erdasarkan
rasio tinggi puncak kromatogram adalah .,(=0-
1g3ml' Cilai 678 sangat tergantung pada galat
sistemik yang dapat dilihat se&agai intercept atau
titik potong pada sum&u y dari persamaan garis
kurva kali&rasi'
Ha(i! P"n"ntuan K"t"!itian +Precision/ %an
K"t"3atan +Accuracy/
Untuk mengetahui presisi dan akurasi,
di&uat 5 macam konsentrasi sampel ceota!ime
yang kadarnya ditetapkan &erdasarkan kurva
kali&rasi ceota!ime' "onsentrasi sampel
ceota!ime dalam asa gerak di&uat sekitar nilai
kosentrasi pada kurva kali&rasi, &erturut<turut
adalah (., ,., dan ,- 1g3ml dan mengandung
standar internal ceadro!il - 1g3ml' "adar sampel
ditetapkan dari persamaan kurva kali&rasi
ceota!ime terhadap rasio luas area kromatogram
dan tinggi puncak' "emudian data yang diperoleh
digunakan untuk menentukan nilai akurasi dan
presisi'
Pada $a&el /') terlihat &ah@a perhitungan
kadar sampel ceota!ime &erdasarkan rasio luas
area kromatogram mem&erikan nilai presisi yang
dinyatakan se&agai "% *:+ dari konsentrasi (., ,.,
dan ,- 1g3ml &erturut<turut adalah (,,):, (,.5:,
dan .,55:'' Cilai terse&ut sesuai dengan
persyaratan, yaitu dengan nilai "% ; ,:' Untuk
nilai akurasi yang dinyatakan dalam : recovery
sampel dengan konsentrasi (., ,., dan ,- 1g3ml
&erturut<turut adalah =-,0,<==,():, =),=,<
(..,)/:, dan ==,00<(..,5,: *perhitungan dapat
dilihat pada 6ampiran+'
Pada $a&el /'= terlihat &ah@a perhitungan
kadar sampel ceota!ime &erdasarkan rasio tinggi
puncak kromatogram mem&erikan nilai presisi *"%
:+ untuk ketiga sampel &erturut<turut adalah .,(=
:, .,/=: dan .,5-:' Untuk nilai akurasi dari
sampel ceota!ime dengan konsentrasi (., ,., dan
,- 1g3ml dengan standar internal ceadro!il -
1g3ml &erdasarkan perhitungan kurva kali&rasi
rasio tinggi puncak komatogram &erturut<turut
adalah =5,?0<==,0=:, (.(,.0<(.(,==:, dan =),))<
==,-0: *perhitungan dapat dilihat pada 6ampiran+'
$a&el /') 4asil Uji Akurasi dan Presisi
Sampel ceota!ime >erdasarkan
Rasio 6uas Area "romatogram
Replikasi
"onsentrasi ceota!ime nominal *1g3ml+
(. ,. ,-
"onsentrasi ceota!ime yang diperoleh
*1g3ml+
(
,
5
=,-0/0
=,-0,,
=,????
,.,(0)(
(=,?)//
(=,)/,,
,-,.?=/
,/,=(-.
,/,=0))
Replikasi Akurasi *:+
(
,
5
==,()
=-,0-
=-,0,
(..,)/
=),=,
==,,(
(.,5,
==,00
==,))
Akurasi =0,), ==,00 ==,=-
Presisi *:
"%+
(,,) (,.5 .,55
"eterangan 2 Uji akurasi dan presisi dilakukan pada sampel
ceota!ime dalam asa gerak dengan standar
internal ceadro!il - 1g3ml'
N"onsentrasi ceota!ime yang diperolehO
merupakan konsentrasi ceota!ime hasil
perhitungan dari persamaan kurva &aku y H
.,(??=! I .,(?)5, r H .,===(

$a&el /'= 4asil Uji Akurasi dan Presisi
Sampel ceota!ime >erdasarkan
Rasio $inggi Puncak "romatogram
Replikasi
"onsentrasi ceota!ime nominal
*1g3ml+
(. ,. ,-
"onsentrasi ceota!ime yang diperoleh
*1g3ml+
(
,
5
='?5?.
='?5/5
='?.5=
,.,,((,
,.,5=?5
,.,,/.,
,/,?,..
,/,)=(.
,/,)((-
Replikasi Akurasi *:+
(
,
5
=5,?0
==,0=
=-,0,
(.(,.0
(.(,==
(.(,,.
=),))
==,-0
==,,-
Akurasi =?,,- (.(,/, ==,,5
Presisi *:
"%+
.'(= .'/= .'5-
"eterangan 2 Uji akurasi dan presisi dilakukan pada sampel
ceota!ime dalam asa gerak dengan standar
internal ceadro!il - 1g3ml
N"onsentrasi ceota!ime yang diperolehO
merupakan konsentrasi ceota!ime hasil
)
perhitungan dari persamaan kurva &aku y H
.,.)/! I .,.?5, r H .,===-
Ha(i! 5i K"("(uaian Si(t"& +System Suitability
Test/
Untuk memastikan &ah@a sistem yang
digunakan &erjalan secara eekti maka perlu
dilakukan uji kesesuaian sistem' Suatu parameter
yang &erguna adalah keterulangan penyuntikan
yang ditentukan dengan menghitung koeisien
variasi *"%+ dari @aktu retensi, rasio luas area,
rasio tinggi puncak, tailing factor, dan asimetri
puncak kromatogram'
Dilakukan enam kali penyuntikan terhadap
sampel ceota!ime dengan konsentrasi (. 1g3ml,
yang mengandung standar internal ceadro!il -
1g3ml, kemudian diamati @aktu retensi, rasio luas
area, dan rasio tinggi puncak kromatogram'
"onsentrasi terse&ut dipilih untuk me@akili
konsentrasi rendah, diasumsikan jika hasil
konsentrasi rendah sudah dapat mem&erikan nilai
yang &aik, maka diharapkan konsentrasi tinggi
mem&erikan nilai yang &aik pula' Pada $a&el /'(.
dapat diketahui "% dari @aktu retensi, rasio luas
area kromatogram, dan rasio tinggi puncak
kromatogram ; /:, nilai ini menunjukkan &ah@a
metode analisis yang digunakan telah memenuhi
kriteria kesesuaian sistem yaitu "% ; (.:'
"esesuaian sistem juga digunakan untuk
mengetahui aktor asimetri dan aktor ikutan
*tailing factor+ dari puncak' Asimetri dan aktor
ikutan digunakan untuk mengetahui kondisi kolom
dan kondisi perco&aan' Asimetri puncak ceota!ime
dengan konsentrasi(. 1g3ml dan ceadro!il adalah
. *terdapat pada hasil kromatogram+, dapat dilihat
pada kromatogram kesesuaian sistem *pada
lampiran J+ &ah@a kedua puncak terlihat cukup
simetris' Cilai terse&ut telah memenuhi kriteria
nilai asimetri yakni ; , *6'R' Snyder et al, (==?+'
Cilai aktor ikutan untuk puncak ceota!ime dan
ceadro!il adalah . *terdapat pada hasil
kromatogram+, dapat dilihat pada kromatogram
keseuaian system *pada lampiran J+ &ah@a kedua
puncak tidak memiliki actor ikutan' Faktor ikutan
yang diperoleh telah memenuhi nilai persyaratan,
yaitu ; , *Snyder et al, (==?+'
$a&el /'(, 4asil Uji "esesuaian Sistem
#eota!ime *n H 0+
Cilai "% atas
@aktu retensi, luas area
kromatogram, tinggi
puncak kromatogram,
asimetri, dan aktor ikutan
"onsentrasi
ceota!ime
.,,- 1g3ml
Cilai
koeisien
variasi *"%+
Kaktu
retensi
#eadro!il
ceota!ime
.,-/((
.,)/?,
Rasio (,(.(0
6uas area
kromatogram
#eadro!il
ceota!ime
(,)?(5
.,)-,.
Rasio (,-.(0
$inggi
puncak
kromatogram
#eadro!il
ceota!ime
(,(0/?
(,/=./
Rasio (,-??.
"eterangan 2 Uji kesesuaian sistem dilakukan pada ceota!ime
(. 1g3ml dalam asa gerak dengan standar internal
ceadro!il - 1g3ml
Minut es
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
V
olts
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
V
olts
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
(
9
.
(
(
&
1
(
+
2
+
.
+
.
(
(
%
&
/
+
.
+
+
&
9
/

/
/
%
2
(
.
&
1
9
%
?
+
1
%
2
9
+
2
9
2
%
2
1
2
?
(
(
+
9
?
%
.
Detector A- 1 (235nm)
cefocefa
ij al fg 10 ppm 80PO4pH4. 4-20!eOH 20 "# 0.8 m#menit 0-08-2008-002
3etention !ime
Area
Height
Jam&ar /'- "romatogram overlay uji
kesesuaian sistem ceota!ime (.
1g3ml dengan standar internal
ceodro!il - 1g3ml dalam asa
gerak *n H 0+
SIMPLAN DAN SARAN
Si&3u!an
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan
hal<hal se&agai &erikut 2 *(+ 7ptimasi kondisi
"#"$ dapat dilakukan dengan &aik karena telah
memenuhi kriteria dari @aktu retensi, resolusi,
jumlah keeping teoritis dan 4F$P, sehingga
analisis lanjut dapat dilakukan secara "#"$
dengan detektor U%' *,+ Dari hasil validasi metode
yang meliputi parameter 2 selektivitas,
keterulangan, linieritas, &atas deteksi, &atas
kuantitasi, ketelitian, ketepatan, dan kesesuaian
sistem, maka metode yang digunakan memiliki
validitas sesuai dengan yang dipersyaratkan
sehingga dapat digunakan untuk menganalisis
#eota!ime dalam pelarutnya'
Sa)an
Untuk mendapatkan hasil yang le&ih &aik,
maka perlu dilakukan hal<hal seperti &erikut 2
*(+melakukan validasi metode analisis ceota!ime
dalam cairan hayati *urin atau plasma+ melalui
=
ekstraksi *,+ Menggunakan rela@an *volunteer+
agar hasil yang diperoleh dapat langsung digunakan
untuk uji ketersediaan hayati *&ioavaila&ilitas+ dan
uji kesetaraan hayati *&ioekivalensi+'
DAFTAR PSTAKA
American Society o 4ealth<System Pharmacists,
,..?'#eota!ime'http'))idsearchyahooc
m) PDiakses tanggal ,. Desem&er ,..)Q'
Departemen "esehatan Repu&lik Indonesia' (==-'
Farma"ope Gndonesia' Fdisi I%' Jakarta2
Departemen "esehatan Repu&lik
Indonesia' hal' (..=<(.(,'
Jritter, R'J', J'M' >o&&it, dan A'F' Sch@arting'
(==(' Pengantar Dromatografi' Fdisi II'
>andung2 I$>' hal'().<,5.'
4armita' ,../' Petunjuk pelaksanaan validasi
metode dan cara perhitungannya' ,a@alah
Glmu Defarmasian (*5+2((?<(5-'
4idayat, A' (===' Validasi ,etode Analisis Dimia'
>ul' Agro >io' ,*,+2,,<,)'
Indrayanto, J' (==/' Metoda validasi pada analisis
dengan kromatograi' ,edi"a7Hurnal
Dedo"teran I Farmasi ,.*,+2 /=<-('
Miller, J'#' and J'C' Miller' (=))' #tatistic for
Analytical Chemistry' ,
nd
Fdition' Ce@
Gork2 John Kiley R Son' p'(.=<(,.'
Pra&aningrum, C' dan Septiana %' ,..)'
#eota!ime'http'))yosefwwordpresscom
) (&&%)&2)' P(0 7kto&er ,..)+
Snyder, 6'R', J'J' "irkland, and J'6' Jlajch' (==?'
Practical HPLC ,ethod <evelopment ,
nd
Fdition' Ce@ Gork2 John Killey R Sons,
Inc' p' ((=<(//, 0/5<?,), ?50'
Under@ood, A'6' (=)0' Analisis Dimia Duantitatif'
Penerjemah2 Aloysius 4'P' Jakarta2
Frlangga' hal' --5<--='
(.