Peningkatan Fagositosis dari Platelet pada Pasien Dengue Virus dengan Infeksi Sekunder

oleh Human Makrofag

Abstrak. Hubungan antara persentasi fagositosis trombosit oleh perbedaan THP-1 sel diperiksa
menggunakan flowcytometry dan jumlah trombosit perifer serta platelet-terkait IgG (PAIgG)
pada 36 pasien dengan sekunder virus dengue (DV) infeksi. Persentasi fagositosis dan level
PAIgG meningkat secara signifikan pada pasien ini selama fase akut dibandingkan dengan
sukarelawan sehat. Persentasi peningkatan fagositosis dan PAIgG ditemukan selama fase akut
menurun secara signifikan selama fase pemulihan. Sebuah korelasi terbalik antara jumlah
trombosit dan persentasi fagositosis (P = 0,011) dan tingkat PAIgG (P = 0,041) ditemukan di
antara pasien ini selama fase akut. Korelasi tidak ditemukan, bagaimanapun, antara fagositosis
persen dan tingkat dari PAIgG. Data kami menunjukkan bahwa fagositosis trombosit dipercepat
terjadi selama fase akut sekunder Infeksi DV, dan itu merupakan salah satu mekanisme
trombositopenia pada penyakit ini.
PENDAHULUAN
Virus dengue (DV), sebuah patogen nyamuk virus manusia, milik genus Flavivirus dari keluarga
Flaviviridae, dan memiliki empat serotipe (DEN-1, DEN-2, DEN-3, dan DEN-4). Jenis virus
dengue 1-4 menginduksi spektrum yang luas dari manifestasi klinis, termasuk manifestasi
perdarahan yang terkait dengan trombositopenia dan permeabilitas pembuluh darah meningkat.
Infeksi sekunder DV, yang umum diamati pada daerah endemis demam berdarah, lebih
cenderung merupakan faktor risiko untuk demam berdarah dengue (DBD). Penyakit ini
sekarang sangat endemik di lebih dari 100 negara tropis. Jumlah kasus telah meningkat pesat
selama tiga decade terakhir, dan telah menjadi masalah kesehatan masyarakat yang utama
khususnya di negara-negara tropis dan subtropis.
Meskipun DV-diinduksi penekanan sumsum tulang menurun trombosit sintesis, mekanisme
kekebalan trombositopenia mengakibatkan kerusakan trombosit meningkat tampaknya operasi
pada pasien dengan DBD. 5 Tingkat peningkatan plateletassociated IgG (PAIgG) sering diamati
pada pasien dengan kronis idiopatik thrombocytopenic purpura (ITP), tetapi juga ditemukan
dalam berbagai penyakit lainnya. 6,7 Kami sebelumnya menunjukkan korelasi yang terbalik
antara tingkat dan jumlah trombosit PAIgG selama fase akut DV sekunder infeksi. 8,9 Kami
berspekulasi bahwa kompleks imun dari DV dengan anti-DV antibodi IgG terletak pada platelet,
sebagai akibat dari pengikatan langsung dari DV ke trombosit. 10 Hasil dari studi sebelumnya
kami menunjukkan bahwa PAIgG formasi, melibatkan IgG anti-DV, dapat menyebabkan
trombositopenia baik melalui reseptor Fc dan melengkapi reseptor-dimediasi trombosit clearance
oleh makrofag dan / atau komplemen-dimediasi lisis platelet. 8 Tidak ada penelitian,
bagaimanapun, telah dilakukan untuk menentukan apakah trombosit ditingkatkan fagositosis
oleh makrofag terjadi pada penyakit ini. dalam hal ini studi, kami mendirikan sebuah uji in vitro
fagositosis trombosit oleh makrofag menggunakan flowcytometry, dan melaporkan peningkatan
fagositosis trombosit dari pasien dengan fase akut DV sekunder infeksi.
BAHAN DAN METODE
Pasien dan desain studi. Empat puluh dua pasien secara klinis diduga memiliki infeksi DV
yang terdaftar di San Lazaro Rumah Sakit antara September 2006 dan Februari 2007. Dari
subject ini, 40 didiagnosis dengan fase akut DV infeksi berdasarkan hasil tes aglutinasi partikel
untuk dengue IgM atau reverse transkripsi-polymerase chain Reaksi (RT-PCR). 11,12 Dari
pasien ini, 37 didiagnosis dengan fase akut infeksi DV sekunder berdasarkan hasil tes
hemaglutinasi inhibisi (HI). 13 Diantara 37 pasien dengan infeksi sekunder DV, kami
mengevaluasi 36 pasien yang diperiksa untuk platelet perifer menghitung, tingkat PAIgG,
frekuensi fagositosis trombosit pada saat pendaftaran (fase akut), dan 4 hari setelah tes pertama
(fase penyembuhan) dalam penelitian ini. Satu pasien menarik diri dari transferral studi berikut
untuk rumah sakit lain. Tiga puluh enam sukarelawan sehat (HVS), yang cocok usia, juga
terdaftar sebagai subyek kontrol di St Luke Medis Pusat selama periode yang sama. HVS ini juga
menerima partikel aglutinasi tes untuk demam berdarah IgM, jumlah trombosit, dan pemeriksaan
untuk PAIgG tingkat pada saat pendaftaran. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) dan 3,8%
natrium darah sitrat diambil dari pasien dan dari HVS untuk tes ini. Para jumlah trombosit
ditentukan menggunakan otomatis hemositometer (Sysmex, Hyogo, Jepang). PAIgG yang
tingkat ditentukan menggunakan kompetitif enzim-linked Immunosorbent Assay (ELISA),
seperti dijelaskan sebelumnya. 9 DBD ini didiagnosis oleh Organisasi Kesehatan Dunia (WHO)
kriteria, jumlah trombosit kurang dari titik nadir 100.000 / uL, manifestasi hemoragik, dan
hematokrit meningkat sama atau lebih besar dari 20% di atas rata-rata atau kehadiran baik efusi
pleura atau cairan asites. 14 Kasus DBD yang lebih dinilai pada skala I-IV. Demam dengue (DF)
adalah didefinisikan sebagai peningkatan hematokrit kurang dari 20% dan tidak efusi pleura
terdeteksi di dada dekubitus lateral yang tepat radiograf.
Proposal penelitian untuk studi ini telah disetujui oleh kedua Komite Bioetika dari Rumah Sakit
San Lazaro dan oleh St Luke Medical Center. Orang tua atau wali dari semua pasien disediakan
informed consent tertulis. Sebuah sampel sementara sasaran ukuran 62 dipilih untuk memastikan
bahwa akan ada setidaknya kesempatan 70% untuk mendeteksi perbedaan sebesar 30% (50%
dibandingkan 20%), dengan tingkat alpha satu sisi 0,05, dalam persen fagositosis trombosit
antara pasien dengan fase akut DV infeksi sekunder dan HVS.
Trombosit persiapan untuk uji fagositosis trombosit. Plasma yang kaya platelet (PRP)
dipisahkan dari 5 mL 3,8% natrium sitrat darah diambil dari pasien dengan sekunder DV infeksi
dan dari HVS dengan sentrifugasi dari 200 g untuk 10 menit pada suhu kamar. Setelah
mencuci PRP dengan mencuci penyangga [140 mM NaCl, 5 mM KCl, 12 mM trinatrium sitrat,
10 mM glukosa, sukrosa 12,5 mM, dan 1 mg / mL PGE 1 (pH 6,0) (Cayman Kimia, Ann Arbor,
MI)], 2 10 8 trombosit dicuci ditangguhkan dengan 60 uL buffer fisiologis (PB) (140 mM
NaCl, 3 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 5 mM NaHCO3, 10 mM glukosa, dan 10 mM HEPES, [pH
7,4]) dengan atau tanpa 6,0 pg anti-manusia antibodi monoklonal trombosit (MAb) (tikus IgG 1,
Immuno-Biological Laboratories Co Ltd, Takasaki, Jepang) selama 30 menit pada 37 C, dan
dicuci dengan buffer mencuci. Platelet dicuci kemudian diwarnai dengan 20 M dari CellTracker
Oranye CMTMR (CTO; Probe Molekuler, Inc, Eugene, ATAU) selama 30 menit pada 37 C. 15
The platelet diwarnai dicuci dan ditangguhkan dalam 0,5 mL PB, dan kemudian diinkubasi lain
30 menit pada 37 C untuk menghapus pewarna berlebihan. Dicuci platelet yang dihitung
menggunakan hemositometer otomatis. Efisiensi pelabelan trombosit dengan CTO bertekad
untuk menjadi 94,2% menggunakan flowcytometry (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose,
CA). Frekuensi pelabelan trombosit dengan CTO itu disimpan lebih tinggi dari 80% setidaknya
selama 40 jam (data tidak ditunjukkan). Anti-platelet Platelet MAb pra-perawatan dari HV
disiapkan di masing-masing fagositosis trombosit uji sebagai kontrol positif di samping tidak
diobati trombosit dari pasien dan HVS.
Diferensiasi dari THP-1 sel. dibedakan manusia monocytic THP-1 sel (nomor your; JCRB-
80194, Kesehatan Ilmu Penelitian Sumber Daya Bank, Jepang) dikultur di RPMI-1640 dengan
25 mM menengah dari HEPES, betis janin 10% serum (FCS) (Hyclone, Selatan Logan, UT), dan
penicillinstreptomycin (Gibco, Grandisland, NY), pH 7,2. Para THP-1 sel dibedakan dengan
adanya 1 ng / mL TGF-1 (Calbiochem, San Diego, CA) dan 50 nM dari 1,25 - (OH) 2 vitamin
D 3 (Calbiochem) selama 24 jam. 16 Panen THP-1 sel dicuci dua kali dengan sentrifugasi, dan
supernatant dihapus. Dua puluh uL phycoerythrin (PE)-terkonjugasi tikus anti-manusia
monoklonal IgG CD11b 1 (BD Pharmingen, San Diego, CA) atau PE-terkonjugasi monoklonal
IgG tikus 1 isotipe kontrol (DakoCytomation, Glostrup, Denmark) adalah ditambahkan ke
masing-masing tabung dan diinkubasi pada suhu 4 C selama 30 menit. Sampel dicuci dua kali
dan disuspensikan dalam PBS yang mengandung 1% paraformaldehyde, dan kemudian dianalisis
menggunakan flowcytometry. Meskipun tidak ada ekspresi CD11b ditemukan di dibedakan
THP-1 sel, peningkatan ekspresi CD11b ditemukan di THP-1 sel dibedakan (data tidak
ditunjukkan). Ekspresi CD11b adalah spesifik karena tidak ada peningkatan ditemukan dalam
intensitas fluoresen sel dibedakan ternoda dengan PE-terkonjugasi antibodi kontrol.
In vitro fagositosis trombosit. Dibedakan THP-1 sel adalah unggulan pada 1 10 6 sel / sumur
menggunakan plat 24-baik di 'Hanks larutan yang mengandung garam seimbang CaCl 2 0,15
mM dan 1,0 mM MgCl2 (HBSS + +, Nissui, Tokyo, Jepang) pH 7,2, selama 1 jam untuk
mematuhi sel. Lima belas nM dari phorbol-12-miristat-13- asetat (PMA) (Sigma, St Louis, MO)
ditambahkan setelah inkubasi selama satu jam lagi untuk mengaktifkan THP-1 sel. 15 Para 5
10 6 platelet dilabeli dengan CTO yang ditambahkan untuk setiap sumur dan piring
disentrifugasi pada 500 g selama 5 menit pada suhu kamar, dengan inkubasi pada 37 C
selama 30 menit. Setelah inkubasi, patuh sel dicuci dua kali menggunakan dingin 5 mM EDTA-
PBS, sel-sel kemudian terlepas menggunakan 0,05% tripsin-0,53 mM EDTA selama 5 menit
pada 37 C. Setelah berhenti reaksi dengan menambahkan RPMI-1640 dengan FCS 10%, sel-sel
terpisah dipisahkan oleh pipeting yang kuat di atas es, mereka kemudian dikumpulkan dengan
sentrifugasi pada 200 g selama 5 menit pada suhu 4 C. Dipulihkan sel yang diwarnai dengan
fluoresein isotiosianat (FITC) terkonjugasi anti-CD61 manusia tikus IgG (DakoCytomation)
selama 30 menit pada 4 C. Sel dicuci dua kali dan disuspensikan dalam PBS yang mengandung
1% paraformaldehyde, diikuti dengan analisis menggunakan flowcytometry. Dalam percobaan
awal, suatu neon diabaikan CTO sinyal terdeteksi dalam supernatan dari mencuci penyangga.
Namun, tidak ada pewarnaan langsung dibedakan THP-1 sel dengan CTO dalam supernatan dari
buffer mencuci untuk CTO bernoda trombosit dikonfirmasi oleh flowcytometry (Data tidak
ditampilkan).
Flowcytometry analisis. Frekuensi fagositosis trombosit oleh dibedakan THP-1 sel ditentukan
oleh frekuensi CTO penanda positif dan trombosit spesifik CD61 negatif sel. Para THP-1 sel
dibedakan gated dan 10.000 peristiwa itu diperoleh dari sampel masing-masing. Untuk
standardisasi dari nilai-nilai untuk fagositosis trombosit, persen fagositosis diungkapkan dengan
menggunakan rumus berikut: frekuensi fagositosis tes trombosit dibagi dengan frekuensi
fagositosis dari trombosit kontrol positif (pretreated dengan anti-trombosit MAb) 100.
Analisis statistik. Semua data dinyatakan sebagai mean SD. Jumlah trombosit dan tingkat
PAIgG selama periode antara fase akut dan konvalesen diuji menggunakan Wilcoxon tes yang
ditandatangani peringkat. Tingkat fagositosis trombosit, PAIgG menghitung, trombosit antara
HVS dan pasien dengan DV infeksi, dan jumlah trombosit antara pasien dengan DF dan DBD
dianalisis menggunakan uji Mann-Whitney U. signifikansi dari korelasi diperkirakan
menggunakan Pearson korelasi; P <0,05 dianggap signifikan. Para SPSS statistik perangkat
lunak, versi 13.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) digunakan untuk analisis data.
HASIL
Dari 36 pasien dengan infeksi sekunder DV, 24 dan 12 didiagnosis sebagai DF dan DBD,
masing-masing (Tabel 1). Dua belas pasien dengan DBD yang diklasifikasikan lebih lanjut ke
DBD I (N = 2) dan DBD II (N = 10). Tidak ada kasus DBD III atau IV dimasukkan. Para jumlah
trombosit perifer secara bermakna lebih rendah pada pasien dengan infeksi DV daripada di HVS
(P <0,05). Meskipun jumlah trombosit dan peningkatan dalam hematokrit secara signifikan
berbeda pada pasien dengan DBD dari pasien dengan DF (P <0,05), tidak ada perbedaan yang
signifikan ditemukan antara kedua sub kelompok sehubungan dengan demografi data, yang
meliputi usia dan hari setelah onset. Tingkat dari PAIgG secara signifikan lebih tinggi pada
pasien dengan DV infeksi dibandingkan HVS (P <0,05). Meskipun tingkat PAIgG lebih tinggi
pada pasien DBD dibandingkan pada pasien DF, tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan
antara dua sub kelompok, yang dalam perselisihan dengan laporan kami sebelumnya. 9
Table 1
Laboratory data on patients with acute phase of secondary dengue virus infection and
healthy volunteers
Diagnosis (n) Age (years) Days after onset % Increase in hematocrit Platelet
count (10 3 /L) PAIgG value (ng/10 7 PLT) Percent phagocytosis

HV (36) 20.1 7.1 322.7 98.1
11.4 10.1 23.5 23.0
DV infection
(36) 20.2 5.7 5.5 0.7 20.3 11.7 53.1 28.0*
47.5 70.7* 55.5 60.4*
DF (24) 20.1 5.3 5.4 0.7 10.1 4.9 60.0 24.3
34.5 47.8 47.7 52.8
DHF (12) 20.3 6.8 5.7 0.5 29.9 9.9** 39.3 30.8** 71.5
98.4 71.8 73.2

PLT = platelets; HV = healthy volunteer; DV = dengue virus; DF = dengue fever; DHF = dengue
hemorrhagic fever.
* P < 0.05 (versus HV), ** P < 0.05 (versus DF).
Perwakilan data frekuensi fagositosis trombosit dalam percobaan tunggal yang ditunjukkan pada
Gambar 1. Frekuensi fagositosis adalah 20,8% untuk platelet dari HV yang yang pretreated
dengan anti-platelet MAb (Gambar 1A), 3,2% untuk trombosit tidak diobati dari HV (Gambar
1B), dan 16,8% untuk platelet tidak diobati dari pasien dengan DF (Gambar 1C). Nilai-nilai
fagositosis persen 15,4% untuk HV dan 80,8% untuk pasien dengan DF, masing-masing. Para
fagositosis persen secara signifikan lebih tinggi dalam jumlah pasien dengan infeksi DV
sekunder dibandingkan jumlah HVS (P <0,05, Tabel 1). Para fagositosis persen sama lebih tinggi
pada pasien DBD dibandingkan pada pasien DF, tapi tidak signifikan perbedaan yang ditemukan
antara dua subkelompok.
Antara fase akut dan penyembuhan, perubahan dalam trombosit hitungan dan fagositosis persen
trombosit atau PAIgG dibandingkan pada 36 pasien dengan infeksi sekunder DV pada periode
antara fase akut dan penyembuhan. Para rendahnya jumlah trombosit baseline selama fase akut
(53,1 28,0 10 3 / uL) secara signifikan meningkat dan pulih ke kisaran yang normal selama
fase penyembuhan (374,4 92,2 10 3 / uL; P <0,01, Gambar 2A) pada pasien ini. Sebaliknya,
yang PAIgG dasar meningkat (47,5 70. 7 ng/10 7 trombosit) dan persen fagositosis (55,5
60,4%) menurun secara signifikan selama fase akut, dan kembali ke tingkat normal (21,0 17,6
ng/10 7 trombosit untuk PAIgG, 24,5 34,6% untuk persen fagositosis) selama fase
penyembuhan dalam subyek (P <0,05 untuk PAIgG; Gambar 2B, P <0,05 untuk persen
fagositosis; Gambar 2C). Sebuah korelasi terbalik yang signifikan dikonfirmasi antara jumlah
platelet dan PAIgG yang tingkat antara 36 pasien total selama fase akut sekunder DV infeksi
(Gambar 3A), yang konsisten dengan kami sebelumnya hasil. 8,9 Sebuah korelasi terbalik yang
signifikan juga ditemukan antara jumlah platelet dan fagositosis persen (Gambar 3B) di antara
mata pelajaran tersebut. Di sisi lain, tidak ada korelasi signifikan yang ditemukan antara persen
fagositosis dan tingkat PAIgG di antara pasien tersebut (Gambar 3C).


PEMBAHASAN
Dalam studi ini, kami menunjukkan bahwa fagositosis persen trombosit dari pasien selama fase
akut sekunder DV infeksi meningkat secara signifikan, dibandingkan dengan mereka yang
berasal dari sukarelawan yang sehat, menggunakan uji in vitro dalam. Para persen fagositosis
trombosit secara signifikan terbalik berkorelasi dengan jumlah trombosit selama fase akut di
kalangan pasien ini, meskipun tidak ada korelasi yang signifikan ditemukan antara fagositosis
persen dari trombosit dan PAIgG tingkat. Karena kita sebelumnya terdeteksi anti-DV IgG dan
DV RNA pada trombosit dari pasien dengan infeksi DV sekunder, tetapi bukan dari sukarelawan
yang sehat, kehadiran kekebalan kompleks pada trombosit dapat berkontribusi pada peningkatan
fagositosis trombosit antara pasien dengan fase akut DV infeksi sekunder. 8,9 Meskipun tidak
ada korelasi antara tingkat fagositosis PAIgG dan trombosit ditemukan di penelitian ini, nilai-
nilai PAIgG, yang ditentukan oleh sebuah ELISA kompetitif menggunakan anti-IgG manusia,
mungkin tidak mencerminkan jumlah IgG anti-DV pada platelet dalam masing-masing individu
kasus. Sebuah korelasi antara tingkat trombosit terkait IgG anti-DV dan fagositosis persen harus
diperiksa, meskipun assay untuk platelet-terkait anti-DV IgG tidak saat ini tersedia.

Gambar 1. Frekuensi fagositosis trombosit dari relawan sehat (HV) dengan (A) atau tanpa anti-
platelet antibodi monoclonal pengobatan (B), atau platelet tidak diobati dari pasien dengan
demam dengue (DF) (C) yang akan ditampilkan. Para CellTracker Jeruk CMTMR (CTO) positif
dan Sel CD61 negatif (kiri atas wilayah) dianggap sebagai THP-1 sel yang dibedakan trombosit
tertelan. Nilai-nilai fagositosis persen ditentukan untuk menjadi 15,4% untuk HV dan 80,8%
untuk pasien dengan DF menurut rumus yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode.
Mitrakul dan lain-lain 17 melaporkan bahwa kelangsungan hidup trombosit dipersingkat pada
pasien dengan DBD fase akut dengan menggunakan radiolabeled lebih dari 30 tahun lalu
trombosit. Mereka menyarankan bahwa trombosit yang rusak sedang terjebak dan diasingkan
dalam hati bukan di limpa, seperti yang biasanya terjadi di penyakit ini. Temuan mereka
clearance trombosit dalam hati dari pasien dengan DBD fase akut dapat dijelaskan, dalam
sebagian, oleh fagositosis peningkatan trombosit seperti yang ditunjukkan oleh Hasil dari
penelitian ini.

Gambar 2. Perbandingan jumlah platelet perifer (A; N = 36), PAIgG (B; N = 34), dan
fagositosis persen (C; N = 36) antara akut (tes pertama) dan fase konvalesen (empat hari setelah
tes pertama) dari infeksi virus dengue sekunder. * P <0,05, ** P <0,01.
Kami dilaporkan sebelumnya kurangnya kemanjuran dosis tinggi imunoglobulin intravena untuk
pasien dengan sekunder Infeksi DV, dan menyarankan bahwa pembukaan trombosit oleh
makrofag melalui reseptor Fc bukanlah mekanisme utama dalam penyakit ini. 18 Selanjutnya,
dalam percobaan awal pada suatu uji penghambatan fagositosis trombosit dari pasien DF,
penghambatan fagositosis sebagian trombosit oleh dibedakan THP-1 sel ditemukan dengan
mouse anti-manusia melengkapi reseptor 3 (CR3) (CD11b) MAb, dibandingkan dengan kontrol
MAb. Karena aktivasi komplemen dimediasi oleh beredar antigen virus yang terlibat dalam
patogenesis ini penyakit, 19,20 pembukaan trombosit oleh makrofag melalui CR3 mungkin
terlibat dalam penyakit ini. Melanjutkan studi inhibisi tes yang diperlukan untuk menarik
kesimpulan untuk molekul yang tepat mekanisme fagositosis trombosit dalam DV sekunder
infeksi.
Trombosit, sel darah anucleated, dapat menjalani apoptosis Program. Pengobatan platelet dengan
berbagai agonis trombosit menginduksi apoptosis dan caspases, yang merupakan efektor utama
apoptosis, yang terlibat dalam fenomena ini dalam vitro. 21,22 Brown dan lain-lain 23
melaporkan peningkatan ekspresi proapoptotic protein dengan flowcytometry dan perubahan
morfologi yang mirip kepada mereka apoptosis granulosit ditemukan oleh mikroskop electron
dalam trombosit usia. Mekanisme lain yang mungkin untuk peningkatan fagositosis trombosit
dari pasien dalam penelitian ini bisa menjadi pemulung reseptor-dimediasi fagositosis.
Sebagai kesimpulan, penelitian ini menunjukkan suatu peningkatan fagositosis trombosit yang
baru diisolasi dari pasien selama fase infeksi akut DV sekunder di dalam uji in vitro
mempekerjakan dibedakan THP-1 sel. peningkatan trombosit fagositosis secara bermakna
dikaitkan dengan trombositopenia selama fase akut dari penyakit ini. Penelitian lebih lanjut
diperlukan untuk menentukan mekanisme molekuler dari trombosit fagositosis oleh makrofag
dalam infeksi DV sekunder.