Anda di halaman 1dari 58

DIAGNOSIS PENYAKIT VIRUS

BAHAN AJAR
MIKROBIOLOGI VETERINER


OLEH
G NGURAH K MAHARDIKA
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS UDAYANA
BUKIT JIMBARAN
2004
KENAPA PERLU DIAGNOSIS YANG BENAR DAN TEPAT?
Penyakit eksotik
Penyakit zoonosis
Sertifikasi status bebas penyakit tertentu
Keperluan Inseminasi Buatan, Transfer Embryo,
transfusi darah
Program pengendalian test and slaughter
Investigasi Kesmavet
Managemen Klinik


DASAR-DASAR DIAGNOSIS
Klinis
Epidemiologi
Patologi Anatomi
DIAGNOSE SEMENTARA
pengambilan sampel
ISOLASI DAN PROPAGASI
biakan sel
telur bertunas
hewan percobaan
Deteksi Virus
Deteksi Protein
Virus
Deteksi genom Deteksi Antibodi
DIAGNOSE DIFINITIV
Di Lapangan
Di Laboratorium
POSTULAT
KOCH*
*Keraguan & Penyakit Baru
Lesi Histopatologi
Epidemiologi
Epidemi=wabah
Ilmu tentang wabah
Geografi
Musim
Spesies
Umur
Kelamin
Morbitas, mortalitas, dan case fatality rate


Pengambilan Spesimen
Tepat Spesimen
sesuai gejala klinis
sesuai perubahan PA
sesuai pathogenesis penyakit yang diduga
Tepat Waktu
Pada fase akut
Tepat pengiriman
Dalam transport medium
Es/es kering
Tertutup rapat
Berlabel
Disertai data penyakit, diagnosis sementara
Ijin pengiriman (Luar Negeri)
Transport medium
Larutan fisiologis
PBS, NaCl 0,9%, Media Biakan Sel
Antibiotika (Penisilin dan streptomisin)
Antijamur
+/- Gliserol (terutama untuk transportasi jarak
jauh tanpa kondisi dingin)
MACAM SPESIMEN
Gejala Spesimen
Pernafasan
Pencernaan
Kelamin
Mata
Kulit
Syaraf Pusat
Sistemik
Nekropsi/Biopsi
Semua Penyakit
Usapan Hidung, Kerongkongan, aspirasi naso-faring
Feses
Usapan kelamin
Usapan Konjungtiva
Kerokan Kulit, Epitil, Usapan kapas
Cairan serebrospinal, feses, usapan hidung (tergantung
penyakit)
Usapan hidung & feses (tergantung penyakit), darah
dalam antikoagulan
Potongan organ yang sesuai
Darah tanpa antikoagulan ---- serum
BERBAGAI METODE DIAGNOSTIK VIRUS
METODE
isolasi virus

mikroskup elektron

Serologi (deteksi
Protein)
Pelacak DNA/RNA

Histopatologi

Deteksi Ab
KEUNGGULAN
sensitif, bahan baku
kajian lebih lanjut
cepat, deteksi virus
yang sulit ditumbuhkan
cepat, peka, informasi
serotipe, KIT
cepat, peka, untuk semua
virus
cepat, mudah, tersedia

berguna untuk wabah
KEJELEKAN
lambat, sering sulit

mahal, tak tersedia

tidak untuk semua virus
sulit interpretasi
tak selalu tersedia
kontaminasi DNA tinggi
terbatas untuk virus
tertentu dg perubahan khas
Lambat, sulit interpretasi
ISOLASI VIRUS
spesimen
suspensi
Biakan sel
telur bertunas
hewan lab
Panen dan Identifikasi
Tujuan:
1. Memisahkan
suatu virus dari
agen yang lain
2. Memperbanyak
virus
3. Identifikasi
awal

Fisik-Kimiawi
- Secara Aseptis
- Penggerusan
- Pencairan-pembekuan berulang
- Larutan isotonis berpenyangga
- Sentrifugasi Ultra Sentrifugasi
- Ultrafiltrasi
- Penambahan Antibiotika
sprektrum luas
- Penambahan Agen Anti Jamur dan
anti mikoplasma

Pengamatan Klinis,
Patologis, Mikroskopis,
DETEKSI VIRION
Elektronmikroskup
Imuno-elektronmikroskup
Gambar Elektron Mikroskopis berbagai virus
Gambar Elektron Mikroskopis berbagai virus
Panel Contoh Imuno-
Elektron Mikroskopi
Infeksi Virus Hepatitis C
pada biakan sel (Barba
dkk. 1997)
sel terinfeksi yang
direaksikan dengan serum
negatif (E) dan serum
positif VHC (F)
Perhatikan N : inti sel, ER
retikulum endoplasmik, M
mitokondria; LD lipid droplet

LD
LD
DETEKSI PROTEIN VIRUS
ELISA
Enzim linked Immunosorbent assay
IMUNOFLUORESENS
Fluorescence Antibody Test (FAT)
WESTERN BLOT
Hambatan hemaglutinasi (HI)
Uji Fiksasi Komplemen
Uji Netralisasi
Agar Gel Precipitation Assay
Dll.
PENGUKURAN ANTIBODI
Serum tunggal
Penyakit baru
Penyakit endemik --- deteksi IgM
Sera sepasang
Serum fase akut dan fase kesembuhan (2-4 minggu)
Terjadi peningkatan antibodi yang signifikan
DETEKSI DNA/RNA
PCR (polymerase chain reaction)
Amplifikasi (perbanyakan) DNA secara
invitro (dlam tabung reaksi)
RT - PCR (Reverse Transcriptase
PCR) untuk virus RNA
Histopatologi (Lesi Patognomonik)
Contoh pada Rabies
INTERPRETASI
Kesesuaian Klinis, epidemiologi, Patologi &
Diagnosis lab
Sering keliru
banyak infeksi sub-klinis
Dalam hal ragu-ragu --- Postulat Koch
Agen dapat ditumbuhkan
Isolat dapat menimbulkan penyakit yang sama pada
infeksi percobaan
Agen dapat diisolasi kembali dari infeksi percobaan
KEAMANAN LAB
Biosafety Level 1
Biosafety Level 2
Biosafety Level 3
Propagasi penyakit zoonosis pada
hewan percobaan
Biosafety Level 4
Eksperimen infeksi penyakit
zoonosis yang berbahaya
ELISA

ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Uji serologi dalam cairan dimana antigen atau
antibodi dilapiskan pada lubang plastik (microplate),
dan antigen atau antibodi yang menempel dilacak
dengan antibodi lain yang berpenanda enzim
Kepekatan warna diukur dengan alat ELISA READER
Skema Prosedur ELISA indirek untuk pemeriksaan
antibodi terhadap HIV
Baca (optical density)
Kromogen/substrat
Cuci
Anti Ig-Human dilabel
enzim
Cuci
Serum pasien
Cuci
Protein-protein virus
HIV dilapiskan pada
microplate polysterene
Contoh Microplate ELISA
Western Blot
Deteksi antigen atau antibodi dimana antigen
dielektroforesis dalam media poliakrilamid
dan kemudian dipindahkan ke permukaan
membran nitroselulosa, ikatan antigen-
antibodi dilacak dengan entibodi lain yang
berpenanda enzim
Contoh WB
Western Blot HIV
Lane 1, HIV+ serum (positive
control)
Lane 2, HIV- serum (negative
control)
Lane A, Patient A
Lane B, Patient B
Lane C, Patient C
FAT
Fluorescence Antibody Test
Uji serologi untuk deteksi antigen atau
antibodi dengan menggunakan antibodi lain
yang berpenanda FITC (fluorescence Iso-Thio-
Cyanate)
Signal dilihat dibawah mikroskup UV
Digunakan untuk deteksi rabies baku
FAT: Skema Mikroskup
Skema FAT
FAT direk
FAT indirek
Mikroskup fluoresens
Slides are read under a fluorescence
microscope in a dark room

FAT direk dari
preparat sentuh
otak anjing
penderita rabies
Positif (atas) dan
negatif (bawah).

FAT biakan sel terinfeksi Spuma Virus.
Perhatikan juga intensitas signal dan
bentukan sinsitia
Complement Fixation
Ag mixed with test serum to be assayed for Ab
Standard amount of complement is added
Erythrocytes coated with Abs is added
Amount of erythrocyte lysis is determined
Ag
Patients
serum

Ag No Ag
Ag
Methodology
IMUNOHISTOKIMIA
Fiksasi jaringan pada glas obyek
Antigen un-masking
Ensimatis
Microwave
Autoklaf atau pressure cooker
Blocking
Penambahan antibodi terhadap Ag yang dicari
Berlabel enzim (direk)
Tak berlabel (indirek)
Penambahan antispesies Ab (indirek)
Substrat
Background staining
Pengamatan dengan mikroskup cahaya

Contoh Imunohistokimia
Badan Inklusi pada
intrasitoplasmik
pada sel Syaraf
tertular Rabies
(Negri bodies).

Agar Gel Precipitation Test (AGPT)

Agar Gel Immunodiffusion assay
Uji Hambatan Hemaglutinasi
(Hemaglutination inhibition/HI)
Aktif
Virus yang mempunyai hemaglutinin
Influenza, Newcastle Disease/ND, Parvovirus
Pasif
Didahului dengan uji HA
(hemaglutination assay)

Uji Hemaglutinasi (HA)
Uji Hemaglutinasi (HA)
Virus yang Mempunyai
hemaglutinin
Sel Darah Merah
Virus yang Mempunyai
hemaglutinin
Sel Darah Merah
Antibodi
Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI)
Contoh Mikroplate uji HI dengan 4 Serum (S1 S4)
Virus 4 unit HA yang digunakan diperlihatkan dibagian bawah
Uji Netralisasi
Biakan Sel
Telur Bertunas
Hewan Lab
Sel Sehat
Embryo Sehat
Hewan Sehat
Virus tidak
dapat
direisolasi
Sel Sakit/Mati
Embryo Sakit/Mati
Hewan Sakit/Mati
Virus dapat direisolasi
Uji Netralisasi Enterovirus Babi pada biakan sel ginjal babi.
A. Virus ditambahkan dengan antibodi positif sebelum
diinokulasikan pada biakan sel
B. Virus ditambahkan dengan antibodi negatif
SKEMA PCR (Animasi)
Komponen PCR
DNA target
Primer (Oligonukleotida pendek, komplementer dg target) dalam konsentrasi
berlebihan
dNTP (dA, dC, dG, dTTP)
Mg2+
Enzim Polimerase DNA Taq-polymerase
Contoh Hasil PCR
RT-PCR
Target RNA dikopi menjadi cDNA dengan
menggunakan primer dan enzim reverse
transkriptase, setelah itu baru PCR
RT-PCR pada Rabies