Anda di halaman 1dari 14

MAKALAH ANALISIS FISIKOKIMIA II

ANTIBIOTIK BETA-LAKTAM
Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Analisis Fisikokimia II
Dosen : Dra Wiwiek Indriyati M.S., Apt


Disusun Oleh:
Hani Nurliyani 260110120025
Eni Herdiani 260110120026
Tazyinul Qoriah Alfauziah 260110120027
Novia Eka Putri 260110120028



FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2014
PENDAHULUAN
Antibiotika beta laktam merupakan golongan antibiotika yang pertama
kali ditemukan. Meskipun sampai sekarang banyak golongan antibiotika dengan
berbagai variasi sifat dan efaktivitasnya terhadap bakteri, namun demikian
antibiotika ini masih sering dipergunakan sebagai obat pertama dalam mengatasi
suatu infeksi. Golongan antibiotika ini secara umum tidak tahan terhadap
pemanasan, mudah rusak suasana asam dan basa serta dapat diinaktifkan oleh
enzim beta laktamase. Antibiotika beta laktam terdiri atas dua golongan.
Golongan pertama adalah penisilin beserta turunannya, yang sampai sekarang
telah dapat diisolasi sampai dengan generasi keempat. Namun demikian perlu
diperhatikan adanya sifat alergi dari pasien terhadap penggunaan penisilin dan
turunannya. Golongan kedua adalah sefalosporin beserta turunannya, yang sampai
sekarang telah diisolasi sampai generasi ketiga. Meskipun golongan sefalosporin
mempunyai spektrum anti bakteri yang lebar, biasanya hanya dipergunakan
sebagai pengobatan alternatif apabila penggunaan golongan penisilin kurang
memberikan hasil yang memuaskan (Supriyatna, 1996).
Antibiotik beta-laktamase bekerja membunuh bakteri dengan cara
menginhibisi sintesis dinding selnya. Pada proses pembentukan dinding sel,
terjadi reaksi transpeptidasi yang dikatalis oleh enzim transpeptidase dan
menghasilkan ikatan silang antara dua rantai peptida-glukan. Enzim
transpeptidase yang terletak pada membran sitoplasma bakteri tersebut juga dapat
mengikat antibiotik beta-laktam sehingga menyebabkan enzim ini tidak mampu
mengkatalisis reaksi transpeptidasi walaupun dinding sel tetap terus dibentuk.
Dinding sel yang terbentuk tidak memiliki ikatan silang dan peptidoglikan yang
terbentuk tidak sempurna sehingga lebih lemah dan mudah terdegradasi. Pada
kondisi normal, perbedaan tekanan osmotik di dalam sel bakteri gram negatif dan
di lingkungan akan membuat terjadinya lisis sel. Selain itu, kompleks protein
transpeptidase dan antibiotik beta-laktam akan menstimulasi senyawa autolisin
yang dapat mendigesti dinding sel bakteri tersebut. Dengan demikian, bakteri
yang kehilangan dinding selmaupun mengalami lisis akan mati (Gigure, 2007).

Gambar 1. Mekanisme kerja antibiotik yang menghambat pembentukan dinding
sel (sumber:)

fsdd

1. Metisilin
2. Meropenem
3. Cefaclor
Sifat Fisikokimia
a) Pemerian: Bubuk Kristal putih atau kuning pucat, sedikit larut dalam air,
praktis tidak larut dalam metanol, metilen klorida, kloroform, dan benzen.
Tidak berbau atau berbau sulfur ringan.
b) pH 3 - 4.5 (2.5% aqueous suspension)
c) Titik leleh/titik beku 300.2 F (149 C) (decomposes)
d) Berat Molekul 385.82
Sumber: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00833

Penggunaan
Cefaclor, juga dikenal sebagai cefachlor atau cefaclorum adalah generasi
kedua antibiotik golongan sefalosporin yang digunakan untuk mengobati
infeksi tertentu yang disebabkan oleh bakteri seperti pneumonia dan infeksi
pada telinga, paru-paru, tenggorokan, dan saluran urin.
Cefaclor telah menunjukkan efek bakterisida terhadap banyak gram positif
aerob, aerob gram negatif dan beberapa bakteri anaerob, termasuk
Staphylococcus aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes dan H. influenzae
(termasuk strain yang resisten ampisilin) (Mangla dan Aggarwal, 2012).
Analisis
Dapat diperiksa dengan spektrofotometer absorpsi infra merah dan ultra
violet, yang dibandingkan dengan spectrum yang diperoleh dari cefaclor
CRS.
Nama IUPAC:
(6R,7R)-7-{[(2R)-2-amino-2-
phenylacetyl]amino}- 3-chloro-8-oxo-5-thia-
1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene- 2-carboxylic
acid


Gambar Spektrum IR Sefaklor
Sumber:
http://www.pmda.go.jp/english/pharmacopoeia/pdf/sixteenth_edition/JP16%2
0IR%20A%20to%20C.pdf

Gambar Spektrum UV Sefaklor
Sumber:
http://www.pmda.go.jp/english/pharmacopoeia/pdf/sixteenth_edition/JP16%2
0UV%20C%20to%20D.pdf

Hebert A, Sigman E, Levy M. 1991. Serum sickness-like reactions from cefaclor
in children. J Am Acad Dermatol 25 (5 Pt 1): 8058.
Parra F, Igea J, Martn J, Alonso M, Lezaun A, Sainz T. 1992. Serum sickness-
like syndrome associated with cefaclor therapy. Allergy 47 (4 Pt 2): 43940.
http://www.toku-e.com/Assets/MIC/Cefaclor.pdf
King BA, Geelhoed GC. 2003. Adverse skin and joint reactions associated with
oral antibiotics in children: the role of cefaclor in serum sickness-like
reactions . J Paediatr Child Health 39 (9): 67781.
LactMED. Summary of Cefaclor's use during lactation. National Library of
Medicine. Retrieved 22 May 2011.
Ito, S.; Blajchman A, Stephenson M et al. 1993. Prospective follow-up of adverse
reactions in breast-fed infants exposed to maternal medication. Am J Obstet
Gynecol 168 (5): 13931399.

4. Benzilpenisilin

Nama lain : Penisilin-G, Benzatin Penisilin-G
Benzilpenisilin adalah antibiotik yang tetap berguna tetapi mempunyai
spektrum sempit, terutama melawan bakteri gram positif. Benzil penisilin
efektif untuk mengobati infeksi pneumokokus, streptokokus, mmeningokokus
serta leptospira. Benzilpenisilin juga bermanfaat untuk profilaksis gangren
gas klstridium. Benzilpenisilin labil dalam asam sehingga absorpsi oralnya
buruk. Benzilpenisilin diberikan melalui suntikan intramuskular, tetapi dosis
besar menyebabkan nyeri dan diberikan secara intravena. Penisilin berdifusi
luas sepanjang jaringan tubuh, tetapi penetrasi ke dalam otak buruk (Neal,
2005).
Sifat Fisika Kimia
Penisilin G diperdagangkan dalam bentuk hablur murni yang bersifat
asam. Penisilin G dalam larutan tidak stabil pada PH 5 atau kurang dan pada
PH 8 atau lebih. Larutan penisilin bila dibiarkan beberapa hari lamanya akan
terurai meskipun disimpan dalam tempat dingin. Penisiln G dapat membentuk
garam dengan logam alkali dan alkali tanah yang larut dalam air, sedangkan
garam dengan logam berat tidak mudah larut (Wattimena, 1991).
Penisilin terdiri dari dua cincin berupa satu inti siklik pada gugus
amida dapat diikat berbagai jenis radikal dan diperoleh berbagai jenis
penisilin. Dalam suasana basa atau oleh pengaruh enzim -laktamase seperti
penisilinase yang disekresi oleh mikroba tertentu, maka inti laktam terbuka
dan terbentuk asam penisilinoat. Oleh pengaruh amidase dirantai samping
terbentuk asam 6-aminopenisilinat. Selanjutnya oleh pengaruh asam terjadi
hidrolisa dan diperoleh penisilamin dan aldehid, sehingga aktivitas
antimikrobanya berkurang (Wattimena, 1991).
Mekanisme Kerja
Berdasarkan mekanisme kerjanya antibiotic -laktam I termasuk
antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba. Efek bakterisid
diberikan pada mikroba yang sedang aktif membelah. Pada waktu
berlangsungnya pembelahan, sebagian dari dinding sel induk dilisis oleh
suatu asetilmuramidase. Dinding sel bakteri terdiri dari mukopeptida.
Transpeptidase terlibat dalam pembentukan dinding sel baru. Enzim ini
diblokir oleh penisilin sehingga pembentukan dinding sel tidak sempurna
yang mengakibatkan matinya bakteri. Oleh karena dinding sel kokus gram
positif terdiri dari 60 % sedangkan kokus gram negative hanya mengandung
10 % mukopeptida, maka spectrum antimikroba dari penisilin tidak luas
(Wattimena, 1991).
Indikasi dan Dosis Penggunaan
Indikasi spesifik untuk benzilpenisilin:
Selulit
Endokarditis bakteri
Meningitis
Pneumonia aspirasi, abses paru-paru
Sifilis
Septisemia pada anak-anak
Dosis bayi dan anak:
Grup A streptococcal pada infeksi saluran pernafasan atas: 25.000-50.000
unit/kg, sebagai dosis tunggal. Maksimal 1.2 juta unit.
Profilaksis untuk demam reumatoid kambuhan: 25.000-50.000 unit/kg
setiap 3-4 minggu. Maksimal 1.2 juta unit.
Sifilis awal : 50.000 unit/kg sekali suntik. Maksimal 2-4 juta unit.
Sifilis lebih dari 1 tahun: 50.000 unit/kg setiap minggu untuk 3 dosis.
Maksimal 2-4 juta unit/dosis.
Dosis dewasa:
Grup A streptococcal pada infeksi saluran pernafasan atas: 1.2 juta unit
sebagai dosis tunggal.
Profilaksis untuk demam reumatoid kambuhan: 1.2 unit setiap 3-4 minggu.
Sifilis awal: 2.4 juta unit sebagai dosis tunggal di dua tempat suntikan.
Sifilis lebih dari 1 tahun: 2.4 juta unit pada 2 tempat suntikan, 1 minggu
untuk 3 dosis.
Analisa Kualitatif dan Kuantitatif
Spektrofotometri Infrared (Kualitatif)
Sampel dilarutkan dalam kloroform. Kemudian larutan tersebut dianalisis
menggunakan spektrofotometer infared. Spektrum sampel yang dihasilkan
dibandingkan dengan spektrum penisilin murni.

Titrasi Iodometri (Kuantitatif)
Sampel dilarutkan dalam air dan larutan dicairkan hingga mengandung
sekitar 2,5 mg penicillin dalam 5 ml. Selanjutnya 5 ml aliquot, B dan S,
dipipet kedalam labu iodin secara terpisah. 5 ml laruan buffer dan 10 ml
larutan iodin ditambahka kedalam labu yang mengandung B. Labu ditutup
dan ditempatkan ditempat gelap selama 20 menit pada suhu ruangan. Setelah
itu kelebihan iodin dititrasi dengan 0,01 N tiosulfat dengan amilum sebagai
indikator. Aliquot S ditambahkan 1 ml NaOH 1 N. Setelah 20 menit pada
suhu ruangan, 5 ml buffer dan 10 ml larutan iodin ditambahka dan campuran
ditempatkan ditempat gelap selama 20 menit dan kemudian dititrasi dengan
0,01 N tiosulfat.
5. Aztreonam

Referensi[sunting | sunting sumber]
1. ^
a

b
(Inggris)Madigan MT, Martinko JM, (2000). Brock Biology of
Microorganisms. Prentice Hall. ISBN 978-0-13-081922-2.
2. ^
a

b

c
(Inggris)Richard Schwalbe, Lynn Steele-Moore, Avery C.
Goodwin (2007). Antimicrobial susceptibility testing protocols. CRC
Press. ISBN 978-0-8247-4100-6.
3. ^
a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

l

m
(Inggris)Brian I. Duerden (1987). "Beta-Lactam
Antibiotics in Systemic Infections" . Phil J Microbiol Infect Dis 16 (2):
6164.
4. ^ (Inggris)MICHAEL D. REED, ROBERT C. STERN, CHERYL A.
O'BRIEN, TOYOKO S. YAMASHITA, CAROLYN M. MYERS,
JEFFREY L. BLUMERI (April 1985). "Pharmacokinetics of Imipenem
and Cilastatin in Patients with Cystic Fibrosis" . ANTIMICROBIAL
AGENTS AND CHEMOTHERAPY 27 (4): 583588.
5. ^
a

b

c

d

e

f

g
(Inggris)Steeve Gigure (2007). Antimicrobial therapy in
veterinary medicine. Wiley-Blackwell. ISBN 978-0-8138-0656-3.
6. ^ (Inggris)Office of Technology Assessment Congress of United States
(1995). Impacts of Antibiotic-Resistant Bacteria. Diane Publishing Co.
7. ^
a

b
(Inggris)R. Fontana, P. Canepari, M. M. Lle, G. Satta (February
1990). "Mechanisms of resistance of enterococci to beta-lactam
antibiotics" . European Journal of Clinical Microbiology & Infectious
Diseases 9 (2): 103105. doi:10.1007/BF01963633 .
8. ^
a

b
uben Vardanyan, Victor J. Hruby (2006). Synthesis of essential
drugs. Elsevier Science. ISBN 978-0-444-52166-8.
9. ^
a

b
(Inggris)Sherry F. Queener, J. Alan Webber (1986). Beta-lactam
antibiotics for clinical use. Informa Healthcare. ISBN 978-0-8247-7386-
1.
10. ^ (Inggris)Tan TH, Tay L, Yeo M, Feng PH. "Augmentin (Amoxycillin
and clavulanic acid) in the treatment of urinary tact infections and skin
and soft tissue infections." . Singapore Medical Journal (SMJ): 299302.
11. ^ (Inggris)C. READING, M. COLE (May 1997). "Clavulanic Acid: a
Beta-Lactamase-Inhibiting Beta-Lactam from Streptomyces
clavuligerus" . ANTIMICROBIAL AGENT8 AIM
CHEMOTHERAPY7 11 (5): 852857.
Jenis-jenis[sunting | sunting sumber]
Antibiotik beta-laktam terbagi menjadi 4 golongan utama, yaitu penisilin,
sefalosporin, carbapenem, dan monobactam
[3]
.
Penisilin[sunting | sunting sumber]
Artikel utama untuk bagian ini adalah: Penisilin

Amoksisilin, salah satu contoh penisilin.
Berdasarkan spektrum aktivitas antimikrobialnya, penisilin terbagi menjadi 4
kelompok, yaitu penisilin dini (terdahulu), penisilinspektruk luas, penisilin anti-
stafilokokal, dan penisilin anti-pseudomonal (spektrum diperluas)
[3]
. Penisilin dini
secara aktif mampu melawan bakteri yang sensitif, seperti
golongan Streptococcus beta-hemolitik, Streptococcus alfa-
hemolitik dikombinasikan
denganaminoglikosida), pneumococcus, meningococcus, dan
kelompok Clostridium selain C. difficile
[3]
. Contoh dari penisilin terdahulu adalah
penisilin G dan penisilin V
[1]
. Penisilin spektrum luas memiliki kemampuan untuk
melawan bakteri enterik dan lebih mudah diabsorpsi oleh bakteri gram
negatif namun masih rentan terhadap degradasi beta-laktamase, contohnya
ampisilin, amoksisilin, mesilinam,bacampicillin, dll
[3]
. Penisilin anti-
stafilokokal dikembangkan pada tahun 1950-an untuk mengatasi S. aureus yang
memproduksi beta-laktamase dan memiliki keunggulan tahan terhadap aktivitas
beta-laktamase
[3]
. Contoh dari golongan ini adalah methicillin dancloxacillin
[3]
.
Penisilin anti-pseudomonal dibuat untuk mengatasi infeksi bakteri gram negatif
basil, termasuk Pseudomonas aeruginosa, contoh dari penisilin golongan ini
adalah carbenicillin, ticarcillin, Azlocillin, dan piperacillin
[3]
.
Sefalosporin[sunting | sunting sumber]
Antibioik sefalosporin terbagi menjadi 3 generasi, yang pertama
adalah cephalothin dan cephaloridine yang sudah tidak banyak digunakan
[3]
.
Generasi kedua (antara lain: cefuroxime, cefaclor, cefadroxil, cefoxitin, dll.)
digunakan secara luas untuk mengatasi infeksi berat dan beberapa di antaranya
memiliki aktivitas melawan bakteri anaerob
[3]
. Generasi ketiga dari sefalosporin
(di antaranya: ceftazidime, cefotetan, latamoxef, cefotetan, dll.) dibuat pada tahun
1980-an untuk mengatasi infeksi sistemik berat karena bakterigram negatif-
basil
[3]
.
Carbapenem[sunting | sunting sumber]
Hanya terdapat satu agen antibiotik dari golongan carbapenem yang digunakan
untuk perawatan klinis, yaitu imipenem yang memiliki
kemampuan antibakterial yang sangat baik untuk melawan bakteri gram negatif-
basil (termasuk P. aeruginosa, Staphylococcus, dan bacteroides)
[3]
. Penggunaan
imipenem harus dikombinasikan dengan inhibitor enzim tertentu untuk
melindunginya dari degragasi enzim dari liver di dalam tubuh
[4]
.
Monobactam[sunting | sunting sumber]
Golongan ini memiliki struktur cincin beta-laktam yang tidak terikat ke cincin
kedua dalam molekulnya
[3]
. Salah satu antibiotik golongan ini yang umum
digunakan adalah aztreonam yang aktif melawan berbagai bakteri gram negatif,
termasuk P. aeruginosa
[3]
.

Mekanisme resistensi[sunting | sunting sumber]

Mekanisme degradasi antibiotik beta-laktam oleh enzim beta laktamase.
Beberapa bakteri diketahui memiliki resitensi terhadap antibiotik beta-laktam,
salah satu diantaranya adalah golongan Streptococcus aureus resisten-metisilin
(Methicillin resistantStaphylococcus aureus/MRSA)
[6]
. Bakteri-bakteri yang
resisten terhadap antibiotik beta-laktam memiliki 3 mekanisme resistensi, yaitu
destruksi antibiotik dengan beta-laktamase, menurunkan penetrasi antibiotik untuk
berikatan dengan protein transpepidase, dan menurunkan afinitas ikatan
antara protein pengikat tersebut dengan senyawa antibiotik
[7]
. Beberapa bakteri
seperti Haemophilus influenzae, golongan Staphylococcus, dan sebagian besar
bakteri enterik berbentuk batang memiliki enzim beta-laktamase yang dapat
memecah cincin beta-laktam pada antibiotik tersebut dan membuatnya menjadi
tidak aktif
[7]
. Secara detail, mekanisme yang terjadi diawali dengan pemutusan
ikatan C-N pada cincin beta-laktam dan mengakibatkan antibiotik tidak dapat
berikatan dengan protein transpeptdase sehingga terjadi kehilangan kemampuan
untuk menginhibisi pembentukan dinding sel bakteri
[8]
. Beberapa studi
menyatakan bahwa selain ditemukan secara alami pada bakterigram positif dan
negatif, gen penyandi enzim beta-laktamase juga ditemukan pada plasmida dan
transposon sehingga dapat ditransfer antarspesies bakteri
[9]
. Hal ini menyebabkan
kemampuan resistensi akan antibiotik beta-laktam dapat menyebar dengan
cepat
[9]
. Difusi antibiotik beta laktam ke dalam sel bakteri terjadi melalui
perantaraanprotein transmembran yang disebut porine dan kemampuan difusinya
dipengaruhi oleh ukuran, muatan, dan sifat hidrofilik dari suatu antibiotik
[8]
.
Mengatasi resistensi antibiotik beta-laktam[sunting | sunting sumber]

Asam klavulanat, inhibitor beta-laktamase.
Untuk mengatasi degradasi cincing beta-laktam, beberapa antibiotik beta-laktam
dikombinasikan dengan senyawa inhibitor enzim beta-laktamase seperti asam
clavulanat, tazobactam, atau sulbactam
[2]
. Salah satu antibiotik beta-laktam yang
resisten beta laktamase adalah augmentin, kombinasi amoxycillin dan asam
klavulanat. Augmentin terbukti telah berhasil mengatasi infeksi bakteri
pada saluran kemih dan kulit
[10]
. Asam klavulanat yng diproduksi dari
hasil fermentasi Streptomyces clavuligerus memiliki kemampuan untuk
menghambat sisi aktif enzim beta-laktamase sehingga
menyebabkan enzim tersebut menjadi inaktif
[11]
. Beberapa jenis antibiotik beta-
laktam (contohnya nafcillin) juga memiliki sifat resisten terhadap beta-laktamase
karena memiliki rantai samping dengan letak tertentu
[2]
.

AZTREONAM
Kode ATC:
J01DF01
Deskripsi.
Turunan dari betalaktaminov, memiliki satu (Beta-laktamnoe) cincin.
Bubuk kristal putih dan tidak berbau. Sangat sedikit larut dalam etanol, sedikit
larut dalam metanol, larut dalam dimethylformamide, dimetil sulfoxide. Hampir
nerastvorim di toluena, kloroform, etil asetat.
Farmakologi aksi.
Sun, bakterisida.
Aplikasi.
Berat generalized infeksi sistemik, karena gramotricationami mikroorganisme:
infeksi saluran kemih, septicaemia, seksual menurunkan infeksi saluran
pernafasan (termasuk. radang paru-paru, bronkitis), kulit dan jaringan lunak,
organ panggul, tulang, paru-paru lokal abses, terutama pasien melemah dan
gangguan sistem kekebalan tubuh; Pencegahan infeksi pasca bedah.
Kontraindikasi.
Hipersensitivitas, kehamilan, menyusui, periode neonatus.
Gunakan dalam kehamilan dan menyusui.
Kategori: pada janin oleh FDA (B). (Reproduksi hewan studi telah
menemukan resiko efek yang merugikan pada janin, dan studi yang memadai dan
baik dikontrol pada wanita hamil tidak lagi mengadakan.)
Pada saat pengobatan harus berhenti menyusui.
Efek samping.
Sakit kepala, kebingungan, meningkatkan berkeringat, peningkatan waktu
prothrombin, trombositopenia, diare, mual, muntah, rasa, meningkatkan di ALP,
ALT dan AST, rasa sakit pada otot dan tulang, ruam kulit, gatal, flebit atau throm
dengan/dalam pendahuluan, ketidaknyamanan dalam pendahuluan tanah/m.
Interaksi.
Meningkatkan (saling) penitsillinov Efek antibakteri, sefalosporin,
aminoglycosides, Klindamisin, metronidasol.
Overdosis.
Ditandai dengan polimorfik (spesifik) manifestasi.
Pengobatan: gejala, hemo- atau peritoneal dialisis.
Dosis dan administrasi.
B/m, di/dalam struino dan menetes. Dosis yang ditetapkan secara individual
tergantung pada lokasi dan tingkat keparahan infeksi, kerentanan. Dewasa dosis
tunggal - 0,5-2 g (pasien dengan gangguan ginjal berat - dosis setengah) setiap 8-
12 jam, dosis harian maksimum - 8 g; untuk anak-anak yang lebih tua dari 1
minggu - on 30 mg/kg, remaja 2 tahun 50 mg / kg setiap 6-8 jam.
Tindakan pencegahan.
Hati-hati harus ditunjuk untuk fungsi hati tidak mencukupi, reaksi alergi,
termasuk. diinduksi oleh obat. Untuk anak di bawah 6 Jangan gunakan pelarut,
yang mengandung alkohol Benzil.
http://omedicine.info/id/aztreonam.html
Catatan ini telah diposting pada hari Senin, Desember 6, 2010 di 21:51 dan filed
under Instruksi penggunaan, Deskripsi - Id J. Antimikroba untuk penggunaan
sistemik. Anda dapat mengikuti respon untuk entri ini melaluiRSS 2.0 Tape.
Kamu bisa Tinggalkan komentar, atau Trackback dari situs web Anda.
Supriyatna, Jaka. 1996. Antibiotika Beta-Laktam Klasifikasi dan
Permasalahannya. Majalah Ilmiah. 13 (124): 51-58.
Gigure, Steeve. 2007. Antimicrobial therapy in veterinary medicine.
Wiley-Blackwell.
Mangla, Pavan dan KK Aggarwal. 2012. Review of Antibiotics in the
Management of Respiratory Infections: Cefaclor vs Amoxicillin- Clavulanate.
Indian Journal of Clinical Practice. 22 (11): 571-575.