Anda di halaman 1dari 15

KELOMPOK 15

Vincent Pratama
2013210259
Dita Arum K
2013212274
Nurul Dwirini
2013212278
Triana Wati W
2013212280

TUGAS MATA KULIAH
ANALISIS INSTRUMEN
SPEKTROFLUOROMETRI

Spektrofotometri emisi molekul dimana cara yang
diukur adalah intensitas fluoresensi yang terjadi pada
panjang gelombang tertentu (emisi) setelah analit
dieksitasi dengan cahaya pada panjang gelombang
tertentu (eksitasi).


PRINSIP SPEKTROFLUOROMETRI
1. Pengukuran intensitas cahaya fluoresensi
yang dipancarkan oleh zat uji dibandingkan
dengan yang dipancarkan oleh suatu baku
tertentu.
2. Cahaya yang diemisikan terjadi karena proses
absorbsi cahaya oleh atom yang
mengakibatkan keadaan atom tereksitasi.
Keadaan atom yang tereksitasi akan kembali
ke keadaan semula dengan melepaskan
energi yang berupa cahaya (de-eksitasi).
3. Emisi cahaya oleh larutan berfluoresensi
mempunyai intensitas maksimum pada
panjang gelombang yang biasanya 20 nm
hingga 30 nm lebih panjang dari panjang
gelombang radiasi eksitasi.
1. Molekul analit dapat menyerap cahaya dengan kuat
sehingga analit harus mengandung gugus kromofor.
Contohnya adalah senyawa-senyawa aromatik,
heterosiklik, dan sistem konjugasi.
2. Struktur molekulnya planar dan rigid/ kaku.
3. Transisi energi hingga ke tingkat kondisi eksitasi
terendah pasangan elektron singlet adalah transisi

4. Molekul yang tereksitasi kembali ke kondisi dasar
(ground state) dengan melepaskan energi radiatif
(fluoresensi) dengan waktu relaksasi kurang dari 10
-9
detik. Perlu diketahui bahwa kebanyakan zat
kembali ke kondisi dasar (ground state) dengan
melepaskan panas (energi nonradiatif) sehingga
tidak berfluoresensi.

1. Suhu dan viskositas
Intensitas fluoresensi akan turun dengan naiknya suhu. Suhu yang lebih
tinggi tabrakan-tabrakan antar molekul atau tabrakan molekul dengan
pelarut menjadi lebih sering, sehingga kelebihan energi molekul yang
tereksitasi dilepaskan ke molekul pelarut.
2. Pelarut
Intensitas radiasi fluoresensi makin besar jika pelarut makin polar
sedangkan intensitasnya akan menurun jika pelarut mengandung logam-
logam berat terlarut.
3. Derajat Keasaman (pH)
pH berpengaruh pada kesetimbangan larutan menjadi bentuk terionisasi
atau tidak terionisasi. Bentuk terionisasi akan menurunkan fluoresensi.
4. Oksigen terlarut
Quenching adalah deaktivasi non-radiatif dari molekul tereksitasi oleh
suatu zat sehingga menurunkan intensitas fluoresensi. Oksigen yang
terlarut dalam pelarut yang digunakan merupakan quencher yang serius
bagi beberapa senyawa hidrokarbon aromatik yang berfluoresensi. Karena
terjadinya oksidasi senyawa oleh pengaruh cahaya (fotochemically induced
oxidation).
5. Energi eksitasi dan metode iluminasi
Energi eksitasi (intensitas, kemonokromatisan dan ) yang digunakan
mempengaruhi intensitas fluoresensi. Makin kecil intensitas cahaya makin
lemah fluoresensi.
6. Fotodekomposisi
Makin kuat serapan radiasi pada eksitasi yang dipilih, makin besar
kesalahan karena penguraian oleh radiasi.

7. Struktur Molekul
Senyawa-senyawa yang mempunyai ikan rangkap terkonjugasi ini
merupakan calon senyawa yang mampu berfluoresensi. Modifikasi struktur
terhadap senyawa-senyawa ini dapat menurunkan atau meningkatkan
intensitas fluoresensi, tergantung pada sifat dan letak gugus substituen.

8. Konsentrasi/ kadar larutan
Perlu larutan 10-100 kali lebih encer dari spektrofotometri.
INSTRUMENTASI
PRINSIP KERJA SPEKTROFLUOROMETER
Cahaya polikromatis sumber cahaya diarahkan ke
monokromator eksitasi
Monokromator eksitasi diset pada ex dimana analit
menyerap cahaya cukup kuat diarahkan ke larutan
sampel
Analit menyerap absorpsi ex lalu molekul analit
berfluoresensi atau mengemisikan cahaya em dengan
panjang gelombang lebih besar dari ex.
Monokromator fluoresensi dengan posisi 90
0
diset pada
em untuk mencegah gangguan cahaya eksitasi dan
cahaya hamburan dari sel atau pelarut
Detektor kemudian mengubah energi fluoresensi menjadi
signal listrik
Amplifier memperbesar signal listrik agar dapat disajikan
pada display atau direkam dengan printer dalam bentuk
intensitas fluoresensi , spektrum eksitasi atau emisi.
CONTOH SENYAWA YANG DAPAT DIANALISIS
DENGAN SPEKTROFLOUROMETRI
Senyawa anorganik, ion uranil, khelat metal Al.
Adrenolutin yang berasal dari adrenalin
Vitamin : Riboflavin, Piridoksin, dan Tiokrom yang berasal dari
tiamin setelah dioksidasi dengan larutan basa ferisianida pada
ex 365nm dan em 440 nm
Obat yang mempunyai sifat fluoresensi alamiah dalam hal ini
tidak diperlukan tambahan pereaksi Contoh : Quinine
Asam salisilat, asetosal, amfetamin, barbiturat, dan kuinin.
Asam amino, tirosin, triptofan. Asam amino yang tidak
berfluoresensi tetapi derivatisasi dengan fluoresamin atau
syclorida [ 5 (dimethylamino) naphtalene-1-sulfonyl-hloride]
dansyl asam amino yang intensitas fluoresensinya tinggi
Nafsilin dalam plasma manusia
Glukosamin dalam plasma manusia
Polutan : Hidrokarbon aromatik polisiklik
KEUNGGULAN SPEKTOFLOUROMETRI
Keunggulan spektrofluorometri
1. Sensitif
2. Selektif
3. Cocok untuk sampel dengan konsentrasi
kecil
KELEMAHAN SPEKTROFLOUROMETRI
1. Penggunaan terbatas hanya untuk senyawa
berfluoresensi
2. Intensitas fluoresensi dipengaruhi oleh intensitas
sumber cahaya
3. Investasi mahal.

CONTOH IMPLEMENTASI
Pengaruh Pemberian Merica Putih (Piperis album, L) dan Piperin Terhadap
Ketersediaan Hayati Salisilamida Pada Tikus.

Larutan Stok
Dibuat larutan stok salisilamida dalam 0,015 N NaOH dengan kadar 512 mg/ml.
Dari larutan stok tersebut dibuat seri larutan dalam 0,2ml darah : 50,12; 25,60;
10,02; 5,01 mg/ml.
Larutan Uji
Sampel plasma darah tikus.
Prosedur
Mencari panjang gelombang eksitasi dan emisi maksimum salisilamida.
Digunakan larutan salisilamida dalam NaOH 0,2N dengan kadar
50,0mg/ml dan dimulai dari panjang gelombang 250-500nm.
Mencari persamaan kurva baku salisilamida dalam darah. Dibuat Larutan stok
salisilamida dalam 0,015N NaOH dengan kadar 512 mg/ml. Dari larutan stok
tersebut dibuat seri larutan dalam 0,2ml darah:50,12; 25,60; 10,02;5,01mg/ml.
LANJUTAN

Kelompok I (kontrol) : diberi salisilamida dosis
tunggal(50mg/KgBB;ip) dalam larutan basa.
Kelompok II : diberi salisilamida dosis tunggal
(50mg/KgBB;ip) dalam larutan basa, yang satu jam
sebelumnya diberi piperin dalam tilosa 1%
(400mg/kgBB;po).
Kelompok III: diberi salisilamida dosis tunggal
(50mg/KgBB;ip) dalam larutan basa, yang satu jam
sebelumnya diberi piperin dalam PVP 0,8%
(40mg/kgBB;po).
Setelah pemberian salisilamida darah dicuplik dari vena
ekor tikus dan ditampung dengan ependorf, pada
menit tertentu. Kemudian ditetapkan kadar salisilamida
utuhsebagaiberikut.



LANJUTAN
Penetapan kadar salisilamida dalam darah secara
spektrofluorometri yang dimodifikasi. Kepada 200 ml darah
ditambahkan 0,5ml dapar fosfat pH 4,3 yang diekstraksi
dengan 3ml etil asetat. Selanjutnya diputar selama 1 menit
dengan kecepatan konstan. Kemudian campuran
disentrifugasi ( 2500 rpm,10 menit ). Fase etil asetat diambil
2,5ml. Kemudian divortex dengan penambahan 4ml NaOH
0,2N selama I menit selanjunya disentrifugasi 2500 rpm selama
5 menit. Fase basa dibaca pada spektrofluorometri dengan
panjang gelombang eksitasi 328 nm dan emisi 415 nm.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pra perlakuan merica
(400mg/KgBB;po) dan piperin (40mg/kgBB;po) dapat
menaikkan ketersediaan hayati salisilamida (50mg/kgBB;ip)
pada tikus jantan.

TERIMA KASIH