Anda di halaman 1dari 23

CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER (CCRC) FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA

PROTOKOL IN VITRO

NO.

JENIS PROTOKOL

SUMBER

TGL.

 

DIBUAT

1

PERSIAPAN KERJA IN VITRO DI LABORATORIUM

2

PEMBUATAN MEDIA KULTUR LENGKAP (MK)

28/02/08

3

MENUMBUHKAN SEL DARI TANGKI NITROGEN CAIR

(CELL THAWING)

4

MENYIMPAN SEL DI TANGKI NITROGEN CAIR

(CRYOPRESERVATION)

5

GANTI MEDIA

6

PANEN SEL

7

SUBKULTUR

8

PENGHITUNGAN SEL

9

PREPARASI SAMPEL

10

UJI SITOTOKSIK METODE MTT

ATCC

11

UJI APOPTOSIS METODE DOUBLE STAINING

12

UJI IMUNOSITOKIMIA

13

UJI KOMBINASI SAMPEL (COMBINATORIAL ASSAY)

14

FLOWCYTOMETRY

15

TRANSFEKSI PLASMID

16

KLONING SEL

17

WESTERN BLOT

Disetujui oleh

Diperiksa oleh

Dibuat oleh

Tanggal:

Tanggal:

Tanggal:

Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt.

Riris Istighfari Jenie, M.Si., Apt.

Endah Puji Septisetyani

1 | Protokol i n vitro CCRC

PROTOKOL 1

PERSIAPAN KERJA IN VITRO DI LABORATORIUM

1. Memasuki Lab Ketika masuk ke dalam lab, tas dan jaket disimpan di dalam locker sedangkan sepatu dilepas ketika akan memasuki ruangan kerja (jangan lupa membawa log book). Cuci tangan sebelum mulai bekerja.

2. Jas Lab, Masker, dan Sarung Tangan Selalu gunakan jas lab ketika akan bekerja di laboratorium. Masker dan sarung tangan digunakan untuk menghindari terjadinya kontaminasi dan paparan bahan yang berbahaya (misal: saat menimbang MTT yang bersifat karsinogenik).

3. Perlengkapan Kerja Siapkan lampu spiritus, semprotan alkohol 70 %, mikropipet, tisu gulung, korek, spidol marker, buangan basah, dan buangan kering (dilapisi plastik bening) sebelum memasuki ruangan kerja. Peralatan steril (botol duran, conical, tip, tabung reaksi kecil, dll. yang telah diautoklaf) disimpan di dalam inkubator di ruang preparasi (sebelah oven di ruang pencucian alat). Jika tip (yellow dan blue tip) yang digunakan habis, isi kembali kotaknya dengan tip baru kemudian seal dengan selotip dan letakkan di meja di ruang pencucian untuk diautoklaf. Alat yang selesai dipakai, dicuci dengan air biasa dan direndam di dalam air sabun di bawah bak cuci. Khusus botol media, cuci dengan sabun, bilas dengan air murni/ aqua purificata (di dalam ember warna biru bertutup), dan masukkan ke dalam oven. Sampah kering (tip, tisu, plate, dll.) dibuang di tempat sampah. Kembalikan mikropipet, tisu, lampu spiritus, alkohol 70% di tempat semula setelah selesai bekerja.

4. Sterilisasi LAF Nyalakan UV untuk sterilisasi LAF selama tidak kurang dari 20 menit. Jika memungkinkan, UV juga peralatan yang akan digunakan (bahan-bahan jangan ikut di-UV). Kemudian, matikan lampu UV, buka penutup LAF, dan nyalakan lampu biasa. Jangan berada di depan LAF saat udara laminar akan berhembus dari LAF. Selanjutnya, semprot permukaan meja LAF dengan alkohol 70 % dan keringkan dengan tisu. Jika saat ke lab LAF sudah dinyalakan, tidak perlu di-UV lagi, tetapi tetap semprot dengan alkohol. Setelah selesai bekerja, semprot kembali LAF dengan alkohol, matikan dan tutup kembali LAF.

5. Lampu Spiritus (Bunsen) Nyalakan lampu spiritus. Jika isi spiritus habis, isi kembali terlebih dahulu. Jangan gunakan lampu spiritus jika spiritus tinggal sedikit. Api digunakan untuk memanaskan ujung pipet, tip, tutup plate atau disk, dan segala macam tutup botol, conical tube, dan mulut botol serta conical tube sebelum dituang atau ditutup kembali. Hal ini dilakukan untuk menjaga sterilitas selama kerja.

6. Media (RPMI, DMEM), PBS, Tripsin-EDTA, dll. Bahan-bahan yang disimpan di dalam lemari es, seperti media dan PBS 1x, dikeluarkan terlebih dahulu agar saat akan dipakai tidak dalam keadaan dingin. Tripsin-EDTA harus dalam suhu kamar saat akan digunakan karena Tripsin tidak akan bekerja jika masih dalam keadaan dingin. Bahan- bahan ini jangan di-UV. Kembalikan bahan ke dalam lemari es setelah selesai digunakan. Jangan memakai bahan-bahan yang tidak dilabel/ milik orang lain.

7. Pemakaian LAF LAF maksimal dipakai oleh 2 orang secara bersamaan. Semprot semua peralatan dan botol bahan dengan alkohol 70% sebelum dimasukkan ke dalam LAF. Semprot juga kedua tangan setiap kali akan bekerja di LAF jika kedua tangan sempat keluar dari LAF.

8.

Inverted microscope Mikroskop digunakan untuk mengamati keadaan sel setiap kali akan bekerja. Amati kondisi sel serta kemungkinan kontaminasi bakteri atau jamur. Matikan lampu mikroskop (kembalikan ke posisi-0 dahulu) setiap kali selesai menggunakan. Dokumentasi (foto) sel juga diambil dari mikroskop ini.

9.

Inkubator CO 2 Inkubator digunakan untuk inkubasi sel (menyimpan sel). Jangan membuka inkubator terlalu lama karena akan menurunkan kadar CO 2 di dalamnya. Kendorkan tutup flask jika akan dimasukkan inkubator. Flask diletakkan dengan posisi ujung flask berada di sisi dalam inkubator.

PROTOKOL 2

FORMULA MEDIA KULTUR LENGKAP (MK)

Alat:

1. Mikropipet 1 ml

2. Botol duran 100 ml

3. Stiker label

Bahan yang diperlukan setiap membuat media kultur lengkap (MK):

No.

Bahan

Jumlah (%)

Jumlah (per 100 ml)

1.

Penisilin-streptomisin

1 %

1 ml

2.

FBS (Fetal bovine serum) quilified

10 %

10 ml

3.

Media (RPMI/DMEM)

Ad 100 %

ad 100 ml

Alat:

1. Pipet pasteur

2. Mikropipet 1 ml

3. Conical tube

4. Stiker label/ pulpen marker

Bahan:

PROTOKOL 6

PANEN SEL

1. PBS

2. Tripsin-EDTA 1x (Tripsin 0,25%)

3. MK (DMEM/RPMI)

Langkah

Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO 2 , amati kondisi sel. Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen.

2. Buang media dengan menggunakan pipet Pasteur steril.

3. Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + ½ volume media awal).

4. Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) secara merata dan inkubasi di dalam inkubator selama 3 menit 1 .

5. Tambahkan media + 5 ml untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan pipet sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol).

6.

Amati

menggerombol.

keadaan

sel

di

mikroskop.

Resuspensi

kembali

jika

masih

ada

sel

yang

7. Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru.

Keterangan:

1. Untuk dish diameter 10 cm, tripsin-EDTA = 450 µl, untuk flask= 300 µl; dekantir tripsin yang berlebih. Tripsin-EDTA digunakan untuk melepaskan sel.

Alat:

1. Pipet pasteur

2. Mikropipet 1 ml

3. Conical tube

4. Culture dish

5. Stiker label/ pulpen marker

Bahan:

1. MK (DMEM/RPMI)

PROTOKOL 7

SUBKULTUR

Langkah

Pekerjaan

1. Lakukan panen sel sesuai dengan protokol panen sel (protokol 6).

2. Resuspensi suspensi sel di dalam conical tube.

3. Ambil + 300 µl panenan sel dan masukkan ke dalam conical yang lain. Tambahkan 7 ml MK dan resuspensi kembali.

4. Tuang sel ke dalam wadah (dish) yang telah disiapkan. Homogenkan dan amati kondisi dan jumlah sel secara kualitatif.

5. Inkubasi semalam dan ganti MK esok harinya. Amati keadaan sel sebelum dan setelah diganti media.

PROTOKOL 8

PENGHITUNGAN SEL

Alat:

1.

Mikropipet 20 µl

2.

Hemacytometer/ hemocytometer

3.

Counter

4.

Mikroskop (inverted/cahaya)

Bahan:

1.

Suspense sel hasil panen sel (protokol 6)

Langkah

Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO 2 , amati kondisi sel. Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen.

2. Buang media dengan menggunakan pipet Pasteur steril.

3. Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + ½ volume media awal).

4. Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) secara merata dan inkubasi di dalam inkubator selama 3-5 menit 1 .

5. Tambahkan media + 2-3 ml untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan pipet sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol).

6.

Amati

menggerombol.

keadaan

sel

di

mikroskop.

Resuspensi

kembali

jika

masih

ada

sel

yang

7. Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru. Tambahkan MK + 2- 3 ml. Resuspensi sel.

8. Ambil 10 µl panenan sel dan pipetkan ke hemacytometer.

9. Hitung sel di bawah mikroskop (inverted atau mikroskop cahaya biasa) dengan counter 2 .

10. Transfer sejumlah sel yang diperlukan ke dalam conical yang lain dan tambahkan MK sesuai dengan konsentrasi sel yang dikehendaki 3 .

Keterangan:

1. Untuk dish, tripsin-EDTA = 0,75 ml, untuk flask = 0,5 ml; dekantir tripsin yang berlebih. Tripsin- EDTA digunakan untuk melepaskan sel.

2.

H emacytomet er memiliki 4 kamar hitung (chamber), s bb:

emacytomet er memiliki 4 kamar hitung ( chamber ), s bb: (B) (A) Gam bar 1.
emacytomet er memiliki 4 kamar hitung ( chamber ), s bb: (B) (A) Gam bar 1.
emacytomet er memiliki 4 kamar hitung ( chamber ), s bb: (B) (A) Gam bar 1.

(B)

(A)

Gam bar 1. (A) H emacytomete r terdiri dari 4

hitun g. Setiap ka mar hitung t erdiri dari 16

Sel

yang gelap

(mati) dan

kamar

kotak.

sel yang be rada di

bata s luar di seb elah atas da n di sebelah

kanan

tidak

ikut dihitun g. Sel di b atas kiri dan

batas

baw ah ikut d ihitung. (B ) Counter mem udahkan dal am penghitu ngan sel.

untuk

4

J umlah sel ya ng dihitung/m l = Σsel kam ar A + Σsel ka mar B + Σse l kamar C + Σ sel kamar D x 10 4

3. J umlah ml pan enan sel yan g ditransfer =

Jumlah tota l sel yang dip erlukan ; Jumlah se l terhitung/m l

k emudian dita mbahkan MK ad sejumlah ml yang dipe rlukan.

m isal:

a.

Jumla h total sel ya ng diperlukan

untuk mena nam 5x10 3 s el WiDr di se tiap sumuran pada

96-we ll plate 5x1 0 3 x 100 sum uran (dibuat lebih) = 5x1 0 5 sel.

 

b.

Volum e panenan s el yang diperl ukan (dalam ml) = 5x10 5 : jumlah sel terhitung/ml

c.

Karen a setiap su muran akan

diisi 100

µl

MK berisi

sel, maka t otal volume

yang

diperlu kan untuk m enanam sel

= 100 µl x 10 0 sumuran = 10 ml.

d.

Jadi, s etelah sejum lah volume ad 10 ml.

panenan sel ditransfer ke

conical baru , ditambahka n MK

U ntuk perlaku an sel MCF-7 = 5x10 3 sel/ sumuran,

sel T47D

= 5x10 3 sel/ sumuran,

sel HeLa

= 5x10 3 sel/s umuran,

PROTOKOL 9

PREPARASI SAMPEL

Alat:

1.

Mikropipet 20, 200, 1000 µl

2.

Tabung reaksi kecil

3.

Rak tabung kecil

4.

Vortex

5.

Conical tube

Bahan:

1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf

2. DMSO

3. MK

Langkah

Pekerjaan

1. Timbang sampel kurang lebih 10 mg dengan saksama (gunakan neraca analitik semimikro) di dalam eppendorf.

2. Uji kelarutan sampel dalam DMSO.

3. Tambahkan 50 µl DMSO dan coba larutkan dengan bantuan vortex.

4. Jika belum larut, tambahkan 50 µl DMSO lagi dan larutkan kembali.

5. Buat baru stok sampel dalam DMSO setiap kali akan digunakan untuk perlakuan (recentur paratus).

Buat seri kadar sampel dengan pengenceran stok dalam DMSO menggunakan MK. Jika terjadi endapan pada pengenceran pertama, jangan dilanjutkan. Pikirkan dahulu solusinya agar sampel bisa larut, kemudian ulangi lagi pembuatan seri kadar dari stok DMSO.

Catatan:

1. Range seri konsentrasi untuk orientasi 7-8 seri kadar + 1 – 500 µg/ml (ppm) Contoh: 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 400 µg/ml

2. Volume akhir tiap seri konsentrasi untuk perlakuan dibuat 400 µl (100 µl/sumuran, triplo).

PROTOKOL 10

UJI SITOTOKSIK METODE MTT

Alat:

1.

Mikropipet 20, 200, 1000 µl

2.

Tabung reaksi kecil

3.

Rak tabung kecil

4.

Vortex

5.

Conical tube

Bahan:

1.

Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf

2.

DMSO

3.

MK

4.

PBS

5.

96-well plate

6.

Tisu makan (kotak)

7.

Buangan untuk media bekas dan PBS

Langkah

Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO 2 , amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.

2. Panen sel sesuai dengan protokol panen.

3. Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti protokol penghitungan sel.

4. Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi kembali sel agar tetap homogen.

5. Sisakan 3 sumuran kosong (jangan diisi sel).

6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan.

7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).

8. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.

9. Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel untuk perlakuan (termasuk kontrol sel dan kontrol DMSO) 1 sesuai dengan protokol preparasi sampel (protokol 9).

10. Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.

11. Buang media sel (balikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan)

12. Masukkan 100 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti no. 10. Tiriskan sisa cairan dengan tisu.

13. Masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran (triplo).

14. Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam (waktu inkubasi total: 24-48 jam).

15. Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan (foto dahulu).

16. Buang media sel, cuci PBS 1x (seperti pada no. 11), dan tambahkan reagen MTT 100 µl ke setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel) 2 . Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator (sampai terbentuk formazan).

17. Periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10% dalam 0,1 N HCl. Pekerjaan tidak perlu dilakukan di dalam LAF hood.

18. Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap (suhu ruangan) semalam (jangan diletakkan di inkubator!).

19. Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai.

20. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam ELISA reader (posisi jangan terbalik). Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ=550-600 nm (595 nm, tekan tombol START).

21. Matikan kembali ELISA reader. Simpan dan temple kertas hasil ELISA pada LOG BOOK. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, catat di buku catatan pemakaian ELISA READER.

22. Buat grafik absorbansi (setelah dikurangi kontrol media) vs konsentrasi (jangan di-log- kan) untuk melihat profil sel hidup.

Hitung prosentase sel hidup 3 dan analisis harga IC 50 dengan Excell (Regresi linear dari log konsentrasi) atau SPSS (Probit/Logit).

Keterangan:

1. Kontrol negatif = sel + media. Kontrol DMSO = sel + % terbesar DMSO yang digunakan dalam MK. % DMSO terbesar dilihat dari konsentrasi DMSO dalam seri konsentrasi sampel yang paling pekat.

2. Stok MTT (5mg/ml) timbang 50 mg sebuk MTT, larutkan dalam 10 ml PBS (dengan bantuan vortex). Reagen MTT untuk perlakuan (0,5 mg/ml) ambil 1 ml stok MTT dalam PBS (5mg/ml), encerkan dengan MK ad 10 ml (untuk 1 buah 96 well plate).

Gunakan sarung tangan! (MTT – karsinogenik).

3. Prosentase sel hidup =

4. Grafik yang dibuat:

(Absorbansi perlakuan – Absorbansi kontrol media) (Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi kontrol media)

x 100%

a. Profil sel hidup: Absorbansi terkoreksi (absorbansi perlakuan-absorbansi kontrol media) v.s. konsentrasi. Profil SD (standar deviasi) juga diperhitungkan.

b. Profil persentase sel hidup: % sel hidup v.s. konsentrasi. Profil SD juga diperhitungkan.

c. Untuk regresi linear: % sel hidup v.s. log konsentrasi, dicari persamaan regresi dan R 2 , dihitung harga IC 50 .

5. Contoh desain plate:

PROTOKOL 11

UJI APOPTOSIS METODE DOUBLE STAINING

Alat:

1.

Mikropipet 20, 200, 1000 µl

2.

Tabung reaksi kecil

3.

Rak tabung kecil

4.

Vortex

5.

Cover slip

Bahan:

1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf

2. DMSO

3. MK

4. PBS

5. 24-well plate

6. Buangan untuk media bekas dan PBS

7. Reagen etidium bromida-akridin oranye (karsinogen)

Hati-hati, reagen mudah menguap! Gunakan sarung tangan dan masker saat pengecatan.

Langkah

Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO 2 , amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.

2. Panen sel sesuai dengan protokol panen.

3. Hitung jumlah sel sesuai dengan protokol penghitungan sel. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji imunositokimia adalah 5x10 4 sel/sumuran (5x10 4 sel/1000 µl MK). Buat pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 5x10 4 sel/1000 µl MK.

4. Siapkan 24 well plate dan cover slip.

5. Masukkan cover slip ke dalam sumuran menggunakan pinset dengan hati-hati. Transfer 1000 µl suspensi sel ke atas cover slip. Setiap akan mengisi sumuran, resuspensi sel kembali.

6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel.

7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).

8. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media sel (MK) dan inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.

9. Setelah sel normal kembali, segera buat satu konsentrasi sampel (cukup satu – pada IC 50 ) untuk perlakuan dan satu kontrol DMSO. Kontrol sel hanya ditambah MK.

10. Ambil 24 well plate dari inkubator.

11. Buang semua MK dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.

12. Isikan PBS masing-masing 500 µl.

13. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.

14. Masukkan sampel ke dalam sumuran.

15. Masukkan juga media dan kontrol DMSO.

16. Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan dalam mengakibatkan apoptosis (10-24 jam).

17. Amati kondisi sel setelah 10 jam, dokumentasikan. Konsultasikan untuk menentukan waktu inkubasi.

18. Setelah inkubasi selesai, keluarkan plate dari inkubator.

19. Buang semua media dengan pipet Pasteur secara perlahan.

20. Isikan PBS 500 ml ke dalam sumuran secara perlahan.

21. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan.

22. Ambil cover slip dengan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.

23. Letakkan di atas object glass (kaca obyek). Posisi sel harus berada di atas, jangan sampai terbalik.

24. Beri label.

25. Teteskan 10 µl reagen campuran etidium bromida-akridin oranye di atas cover slip. Ratakan dengan cara menggoyang secara perlahan.

26. Amati di bawah mikroskop fluoresen.

27. Jika pewarnaan belum optimal, tunggu beberapa menit dan amati kembali.

28. Dokumentasikan. Set kamera dengan setting khusus untuk fluoresen.

29. Setelah selesai, buang cover slip dan cuci kembali object glass.

PROTOKOL 12

UJI IMUNOSITOKIMIA

Alat:

1.

Mikropipet 20, 200, 1000 µl

2.

Tabung reaksi kecil

3.

Rak tabung kecil

4.

Vortex

5.

Cover slip

6.

Object glass

7.

6-well plate bekas/ dish bekas yang bersih.

Bahan:

1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf

2. DMSO

3. MK

4. PBS

5. 24-well plate

6. Buangan untuk media bekas dan PBS

7. Tisu basah (untuk inkubasi).

8. Reagen imunositokimia (Metanol, Novostain universal detection kit, antibodi COX-2/VEGF/dll.)

Langkah

Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO 2 , amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.

2. Panen sel sesuai dengan protokol panen.

3. Hitung jumlah sel sesuai dengan protokol penghitungan sel. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji imunositokimia adalah 5x10 4 sel/sumuran (5x10 4 sel/1000 µl MK). Buat pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 5x10 4 sel/1000 µl MK.

4. Siapkan 24 well plate dan cover slip.

5. Masukkan cover slip ke dalam sumuran menggunakan pinset dengan hati-hati. Transfer 1000 µl suspensi sel ke atas cover slip. Setiap akan mengisi sumuran, resuspensi sel kembali.

6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel.

7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).

8. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media sel (MK) dan inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.

9. Setelah sel normal kembali, segera buat satu konsentrasi sampel (cukup satu – pada

IC 50 ) untuk perlakuan dan satu kontrol DMSO. Kontrol sel hanya ditambah MK.

10. Ambil 24 well plate dari inkubator.

11. Buang semua MK dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.

12. Isikan PBS masing-masing 500 µl.

13. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.

14. Masukkan sampel ke dalam sumuran.

15. Masukkan juga media untuk kontrol sel (2 kontrol sel).

16. Inkubasi di dalam inkubator. Inkubasi 15 jam.

17. Amati kondisi sel setelah 14 jam, dokumentasikan. Siapkan metanol dingin dan PBS.

18. Pada jam ke-15, inkubasi dengan sampel dihentikan. Pekerjaan selanjutnya, tidak perlu di dalam LAF.

19. Buang semua media dengan pipet Pasteur secara perlahan.

20. Isikan PBS 500 ml ke dalam sumuran secara perlahan.

21. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan.

22. Ambil cover slip dengan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.

23. Letakkan di dalam sumuran 6-well plate bekas atau dish bekas yang bersih.

24. Beri label.

25. Teteskan 300 µl metanol dingin, inkubasi 10 menit di dalam freezer.

26. Buang metanol secara perlahan, jangan sampai cover slip terbalik. Jika pengecatan akan dilanjutkan pada hari berikutnya, simpan cover slip di dalam freezer.

27. Tambahkan 500 µl PBS pada cover slip, diamkan 5 menit. Ambil PBS dengan mikropipet 1 ml, buang. Lakukan 2 kali. (intinya, dicuci dengan PBS)

28. Tambahkan 500 µl akuades, diamkan 5 menit. Buang akuades. Lakukan 2 kali. (intinya, dicuci dengan akuades)

29. Teteskan larutan hidrogen peroksidase (blocking solution). Inkubasi 10 menit. Buang larutan (dengan mikropipet).

30. Teteskan prediluted blocking serum, inkubasi 10 menit. Buang larutan.

31. Teteskan antibodi monoklonal primer untuk antigen yang ingin diamati (missal: COX-2), inkubasi 10 menit.

32. Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.

33. Teteskan antibody sekunder (biotinylated universal secondary antibody), inkubasi 10 menit.

34. Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.

35. Teteskan reagen yang berisi kompleks streptavidin-enzim peroksidase, inkubasi 10 menit.

36. Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.

37. Teteskan larutan DAB, inkubasi 10 menit.

38. Tambahkan akuades 500 µl, kemuadian buang kembali akuadesnya.

39. Teteskan larutan MayeHaematoxylin, inkubasi 3 menit.

40. Tambahkan akuades 500 µl, kemuadian buang kembali akuadesnya.

41. Angkat cover slip dengan pinset secara hati-hati, kemudian celupkan dalam xylol.

42. Celupkan cover slip dalam alkohol. Keringkan cover slip.

43. Letakkan cover slip di atas object glass, tetesi dengan lem (mounting media). Tutup cover slip dengan cover slip kotak.

44. Amati dengan mikroskop cahaya.

Catatan:

1. Untuk imunositokimia, minimal diperlukan 3 perlakuan (3 cover slip):

a. Kontrol sel tanpa antibodi (akan menunjukkan warna biru).

b. Kontrol sel dengan antibodi.

c. Perlakuan dengan sampel.

2. Ekspresi protein tertentu akan ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma (bukan inti sel).

Warna biru menunjukkan tidak adanya protein yang ingin diamati.

PROTOKOL 10

UJI KOMBINASI DENGAN AGEN KEMOTERAPI

Alat:

1.

Mikropipet 20, 200, 1000 µl

2.

Tabung reaksi kecil

3.

Rak tabung kecil

4.

Vortex

5.

Conical tube

Bahan:

1.

Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf

2.

DMSO

3.

MK

4.

PBS

5.

96-well plate

6.

Tisu makan (kotak)

7.

Buangan untuk media bekas dan PBS

Langkah

Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO 2 , amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.

2. Panen sel sesuai dengan protokol panen.

3. Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti protokol penghitungan sel.

4. Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi kembali sel agar tetap homogen.

5. Sisakan 3 sumuran kosong (jangan diisi sel).

6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan.

7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).

8. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.

9. Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi (misal: Doxorubicin) untuk perlakuan (termasuk kontrol sel). Seri konsentrasi terdiri dari 4 konsentrasi: IC 50 , ¾ IC 50 , ½ IC 50 ,dan ¼ IC 50.

10. Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.

11. Buang media sel (balikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan)

12. Masukkan 100 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti no. 10. Tiriskan sisa cairan dengan tisu.

13. Masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran @ 50 µl (triplo). Masukkan seri konsentrasi Doxorubicin untuk kombinasi @ 50 µl.

14. Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam (waktu inkubasi total: 24-48 jam).

15. Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan (foto dahulu).

16. Buang media sel, cuci PBS 1x (seperti pada no. 11), dan tambahkan reagen MTT 100 µl ke setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel) 2 . Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator (sampai terbentuk formazan).

17. Periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10% dalam 0,1 N HCl. Pekerjaan tidak perlu dilakukan di dalam LAF hood.

18. Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap (suhu ruangan) semalam (jangan diletakkan di inkubator!).

19. Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai.

20. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam ELISA reader (posisi jangan terbalik). Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ=550-600 nm (595 nm, tekan tombol START).

Desain plate

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

           

B

Seri konsentrasi

Seri konsentrasi

Seri konsentrasi

     
   

1-4

   

1-4 Sampel

 

1-4 Sampel

     

C

     

sampel

+

Doxo kons 1

+

Doxo kons 3

D

         

E

     

Kontrol Sel

F

Seri konsentrasi

Seri konsentrasi

Seri konsentrasi

 

1-4

   

1-4 Sampel

 

1-4 Sampel

 

G

Kontrol Media

Doxorubicin

+

Doxo kons 2

+

Doxo kons 4

H

     

PROTOKOL 14

FLOWCYTOMETRY

1. Perlakuan

2. Preparasi Sel untuk Flowcytometry

Langkah

 

6 well plate

 

24 well

1.

Siapkan 2 eppendorf untuk 1 jenis perlakuan.

   

2.

Ambil media dengan mikropipet 1 ml (blue), transfer ke eppendorf I, jika kurang masukkan ke eppendorf II.

 

3.

Sentrifus (2000 rpm, 5 menit)

   

4.

Buang media.

   

5.

Isikan PBS (@ 500µl) ke dalam sumuran.

 

@ 500 µl

6.

Ambil PBS dan transfer ke dalam eppendorf I.

   

7.

Sentrifus (2000 rpm, 5 menit)

   

8.

Buang PBS.

 

@

500 µl

9.

Ulangi tahap 5-6 sekali lagi.

   

10.

Tambahkan tripsin 0,25% (200 µl), inkubasi di inkubator 2 menit

50 µl

11.

Tambahkan media (@ 1 ml), resuspensi, dan pindah ke eppendorf I dan/ II. (sel harus lepas satu per satu – amati di mikroskop inverted)

@ 500 µl

 

Tambahkan kembali PBS 500 µl ke dalam sumuran untuk mengambil sisa sel, kemudian transfer ke dalam eppendorf II.

 

12.

Sentrifus semua eppendorf (2000 rpm, 30 detik) – tekan “pulse” di sentrifugator

 

13.

Buang media/PBS, cuci pellet sel dengan PBS dingin @ 500 µl

@ 500 µl

14.

Gabungkan suspensi sel dalam eppendorf I. Bilas eppendorf kosong dengan PBS, transfer ke eppendorf I.

 

15.

Sentrifus lagi eppendorf yang berisi PBS (2000 rpm, 30 detik)

 

16.

Buang PBS, cuci kembali pellet dengan PBS dingin @ 500 µl.

@ 500 µl

17.

Sentrifus (2000 rpm, 30 detik).

   

18.

Buang PBS.

   

19.

Tambahkan reagen flowcytometry 300 µl – buat stok reagen dahulu dan bungkus alufoil.

sama

20.

Bungkus tiap eppendorf dengan alufoil.

   

21.

Inkubasi di waterbath 37°C, 10 menit.

   

22.

Jika akan disimpan, masukkan ke dalam lemari es (jangan di freezer).

 

23.

Jika

langsung

di-flocyto,

vortex

eppendorf

(tanpa

membuka

 

bungkus alufoil).

 

24.

Masukkan ke flowcyto-tube yang sudah diberi filter (kain nylon/kain kaca) menggunakan mikropipet 1 ml.

 

25.

Baca di FACS Calibur.

   

Catatan:

1. Konsentrasi akhir dalam PBS 500 µl =

a. Propidium Iodide (PI): 50 µg/ml

b. RNase : 20 µg/ml

c. Triton-X 100 (pro GC - Merck) : 0.1 %

2.

S tok awal reag en:

a. PI : 2, 5 mg/ml / 50x

b. RNas e : 10 mg/ml

c. Triton- X : 1x

(penimbang an 0,7 mg dil arutkan dala m 700 µl PBS )

3. R eagen flowcy tometry untu k 1 sampel: 2 5 µl PI (50x) + 1 µl RNas e + 0,5 µl TX + PBS ad 500 µl

(50x) + 1 µ l RNas e + 0,5 µ l TX + PBS ad 50

Gam bar. Sentrif ugator Sorv all. : Puls e

3. Runni ng Flowcyto metry

4. A nalisis Data

Gambar

Gambar Tangki nitro g en cair tem p at penyimpa nan sel yang dikryo ( -

Tangki nitro gen cair tempat penyimpanan sel yang dikryo ( - 179°C).